遗传学综合性试验报告

1、YUNNAN NORMAL U NIVERSITY本科学生综合性实验报告诱变物质的微核实验学号： 134120022 姓名： 李尧学院：生命科学学院专业、班级 13生科A班实验课程名称：遗传学实验教师及职称： 曹能开课学期： 2014 至 2015 学年 下 学期填报时间：2015 年 5 ，月 25 日云南师范大学教务处编印实验设计方案实验序号实验9实验名称诱变物质的微核实验实验时间2015-5-13 至U2015-5-20实验室睿智3- 224实验室1.实验目的1、了解微核发生的机制；2、掌握微核实验的一般程序和实践意义；3、掌握对实验动物进行药物处理的一般程序；4、掌握进行实验设计的一般

2、程序和规则，并锻炼实践能力。2.实验原埋微核(Micronucleus):染色单体或染色体的无着丝点断片，或因 纺锤体受损而丢失的整个染色体，在细胞分裂后期，仍然遗留在细胞质中。 末期之后，单独形成一个或几个规则的次核，被包含在子细胞的胞质内， 因比主核小，故称为微核。凡能使染色体发生断裂或使染色体和纺锤体联 结损伤的化学物，都可用微核试验来检测。各种类型的骨髓细胞都可形成 微核，但有核细胞的胞质少，微核与正常核叶及核的突起难以鉴别。嗜多染红细胞是分裂后期的红细胞由幼年发展为成熟红细胞的一个 阶段，此时红细胞的主核已排出，因胞质内含有核糖体，姬姆萨染色呈灰 蓝色，成熟红细胞的核糖体已消失，被染

3、成淡桔红色。骨髓中嗜多染红细 胞数量充足，微核容易辨认，而且微核自发率低，因此，骨髓中嗜多染红 细胞成为微核试验的首选细胞群。-2 -.仪器和器械生物显微镜、解剖剪、镣子、注射器、载玻片、盖玻片、塑料吸瓶、吸水纸等。试剂及配制：(1)小牛血清(灭活)将滤菌的小牛血清置于 56c恒温水浴保温30min灭活。灭活的 小牛血清通常保存于冰箱冷冻室里。姬姆萨(Giemsa)染液成分：Giemsa染料 3.8cj甲醇 375mL、甘油125mL。配制：将染料和少量甲醇于乳钵里仔细研磨，再加入甲醇至 375mL 和甘油，混合均匀，放置 37c恒温箱中保温48h。保温期间，振摇数次， 促使染料的充分溶解，取

4、出过滤，两周后用。0.1mol/L磷酸盐缓冲液(pH6.8)成分：磷酸氢二钠(Na2HPO4 12H2O) 71.64g/L磷酸二氢钠(NaH2PO42H2PO4)31.21g/L分别加蒸储水1000mL配成A、B液；取A液51ml,B液49ml混合，再加入100ml蒸储水混匀，即为pH6.8的0.1mol/L磷酸缓冲液。Giemsa应用液取2ml Giemsa染液与40ml 0.1mol/L磷酸盐缓冲液混合而成。临用现 配。实验动物：小鼠是微核试验的常规动物。体重为 25g 35g也可选用成年大鼠， 体重为150g 200g剂量分组：一般取受试物一般至少设3个剂量。每个剂量组5只动物。另外，

5、还 应设溶剂对照和阳性物对照组。常用环磷酰胺作为阳性物对照，剂量可为 40mg/kg 体重。.实验步骤剂量分组：每种受试动物一般至少设 3个计量（见下表）。每个计量 5-10只动 物。另外，还映射溶剂对照（阴性对照）和（阳性对照）。常用环磷酰胺 做阳性对照，阴性对照为蒸储水。受试物：对苯二酚，秋水仙素，氯化汞。受试物剂量组 别各受试小鼠1000个受检细胞中含微核细胞数12 34567g910111213对苯二酚1201802403秋水仙素31L523_氯化汞31 _1213阴性对照蒸铺水阳性对照环罐酰胺 (40mkg)染毒途径和方式染毒途径视实验目的而定，常用腹腔注射，24小时取材。试验方法(

6、1)骨髓的制取用断颈法处死小鼠。用剪刀剪开腿部的皮肤，用镣子夹住 小鼠的股骨，剪去股骨周围的肌肉，将小鼠的两股骨取出，擦净股骨上的 肌肉。去股骨的魏面，将吸有 0.85% Nacl生理等渗液小注射器的针头插 入，反复几次吹出骨髓细胞。反复吹打使其混合均匀，制成细胞悬液。 将细胞悬液在1000转/分离心5分钟，弃除上清液。 涂片在离心管中加入少量的小牛血清(约0.3ml)混匀后，按血常规涂片法涂片, 长度约2cm3cm馀片时一次涂成)。在空气中晾干。固定将干燥的涂片放入甲醇液中固定 5min。即使当日不染色，也应固定 后保存。染色将固定过的涂片放入 Giemsa应用液中，染色20min30min

7、,然后 立即用0.1mol/L磷酸盐缓冲液冲洗。封片用滤纸及时擦干染片背面的水滴，再用双层滤纸轻轻按压染片，以 吸附染片上残留的水分，再在空气中晃动数次，以促其尽快晾干，然后放 入二甲苯中透明5min,取出滴上适量光学树脂胶，盖上盖玻片，写好标 签。观察与计数先用低倍镜，后用高倍镜粗略检查，选择细胞分布均匀，细胞无 损，着色适当的区域，再在油浸镜下计数。虽然不计数含微核的有核细胞， 但需用有核细胞形态染色完好做好判断制片优劣的标准。选择细胞完整、分散均匀，着色适当的区域，在油镜下观察。以有 核细胞形态完好作为判断制片优劣的标准 。本法系观察嗜多染红细胞的微核。用Giemsa染色法，嗜多染红细胞

8、 呈灰蓝色，成熟红细胞呈粉红色。典型的微核多为单个的、圆形、边缘光 滑整齐，嗜色性与核质一致，呈紫红色或蓝紫色，直径通常为红细胞的1/201/5。每只动物计数1000个嗜多染红细胞，观察含有微核的嗜多染红细胞数，微核率以千分率表示。数据处理：利用统计学软件SPSS的单因素方差分析或t检验等方法，进行数据 处理，分析实验结果。5.实验结果处理：组别剂量动物数受检细胞数含微核细胞数微核率P值（g/kg体重）（只）（个）（个）件）受120对苯二 酚8040溶剂对照（蒸豳水）阳性物对照环磷酰 胺（mg/kg体重）50两人一只100032320.0322）利用统计学软件SPSS做单因素方差分析或T检验等

9、方法进行数据处理，并分析实验结果：受试物剂 量 mg/Kg组 别各受试小鼠1000个受检细胞中含微核细胞数123456789101112131415对苯 二酚1201383335373435363034393140323633802283130322928332726293230272928403202521232826242219282225212327秋水 仙素313633323435313137313835303936351.5229252326242725243026282325272913242123201925221918252224202321氯化 汞31222520262123

10、2218272423221726202216222119201817152315212022171613131715161415171317151614121813阴性 对照 蒸播 水321435392435871阳性 对照 环磷 酰胺40m g/kg 体 重384445403641433935433944394542.对实验现象、实验结果的分析及其结论：由于这次试验涉及到两个变量，只能用方差分析，应用最显著差数（LSD法）和Duncan法分别对三种受试物：（对二苯酚，秋水仙素，氯化汞）的三种不同浓度进行检验。其结果如下：对二苯酚：ANOVA微核数Sum ofSquaresdfMean Squ

11、areFSig.Between Gr ups26732.836213366.4182068.325.000Within Groups8485.17913136.462Total35218.0151315 假设：Ho:对二苯酚的三种浓度对老鼠细胞微核数影响显著。H1 :对二苯酚的三中浓度对老鼠细胞为核数影响不显著.(2)确定显著水平0c=0.05,(3)数据处理从表中可看出P3,12 且 P3.12 且 P0.05即，接受原假设。但是看不出那一种结果较明显。对上述实验做多重比较-11 -如下：Post Hoc TestsMultiple ComparisonsDependent Variable

12、:微核数(I)剂量(J)剂量MeanDifference (I-J)Std. ErrorSig.95% Confidence IntervalLower BoundUpper BoundLSD3ml2ml3.6000(*).92238.0001.73865.46141ml7.4000(*).92238.0005.53869.26142ml3ml-3.6000(*).92238.000-5.4614-1.73861ml3.8000(*).92238.0001.93865.66141ml3ml-7.4000(*).92238.000-9.2614-5.53862ml-3.8000(*).92238

13、.000-5.6614-1.9386* The mean difference is significant at the .05 level.Homogeneous Subsets微核数剂量NSubset for alpha = .05123Duncan1ml1515.0000(a)2ml1518.80003ml1522.4000Sig.1.0001.0001.000Means for groups in homogeneous subsets are displayed.a Uses Harmonic Mean Sample Size = 15.000.氯化汞的三种浓度对微核数的影响明显，但是看不出哪一种浓度的影响最明显。ANOVA微核数Sum ofSquaresdfMean SquareFSig.Between Groups10193.633110193.6331275.723.000Within Groups223.733287.990Total10417.36729-12 -.实验总结三种受试物分别对老鼠细胞产生微