构建重组质粒基本方法解析

1、构建重组质粒基本方法cDNA 编码区片段的 PCR 扩增50ul 区模版 1引物 1引物 1dNTP 110 八buffer 5Taq 1Milliq H2O 402. PCR 产物纯化1、加 5 倍体积的 PB2、将 Spin 柱放于 2ml 收集管上3、加样液， 14Krpm ，离心 1min4、弃去排出液5、加 0.75ml PE, 14Krpm ,离心 1min6、弃去排出液 ,14Krpm, 离心 1min7、将 Spin 柱放在洁净 1.5ml 的 Epp 管中8、往Spin柱的膜中央加入 50卩I的EB （或milliq H 20,静置2min, 14Krpm，离心 1min3.

2、 双酶切载体和PCR产物分别用一下条件进行双酶切（反应体系均为30ul , 37E,酶切n小时）：载体10ulPCR 产 物20ul10 x buffer100XBSA0.3ul100XBSA0.3ul酶11ul酶11ul酶21ul酶21ulMilliQ H2O14.7ulMilliQ H2O4.7ul10 x buffer3ul3ul?双酶切后的载体用试剂盒割胶回收割胶并称重，加3倍体积的QG （胶块每100mg约合100卩I的体积）50C，恒温10min,等到胶完全被溶解将一个Spin柱放在一个2ml的收集管中加样液，14Krpm，离心1min弃去排出液加 0.75ml PE, 14Krp

3、m，离心 1min弃去排出液,14Krpm,离心1min将Spin柱放在洁净1.5ml的Epp管中往Spin柱的膜中央加入 50卩l的EB（或milliq H 20,静置2min, 14Krpm，离心1min连接上述双酶切产物经过纯化（其中载体酶切产物割胶回收，PCR片段酶切后纯化步骤与上述PCR产物纯化步骤相同），在 T4 DNA连接酶作用下16C连接过夜。连 接体系 如下：载体2ulPCR 片段 6ul10 xT4 buffer 1ulT4 DNA ligase 1ul转化取上述连接液5卩I转化到预先制备的DHa化学感受态细胞中，冰浴30分钟，42C 热激2min,置冰上5min，加入Im

4、ILB培养液37C摇床45min,离心5000rpm, 1-5min （不 要离心太久，以免太实），最后均匀涂布在含有100 ng/mI抗生素的LB平板上（100-150 ul）。将平板在37E倒置培养过夜。挑取阳性克隆 菌落 转划到另一块含有 100 ng/mI 抗生素的 LB 平板上，并对之进行编号， 37C 倒 置培养过夜。菌落原位 PCR挑取转划后长出的阳性克隆菌落，加入 3ul 细菌 DNA 提取液破细胞。将细菌 裂解液作为 PCR 模板，其他 PCR 组分及 PCR 条件同上。 PCR 产物在 2% 凝胶上进 行电 泳分析。QIAGEN 试剂盒抽提质粒1 用 1.5ml 管离心收集

5、细菌，两次，共 3ml 左右。2加入250ul的预冷的P1，打匀后在震荡仪上高速震荡1min。加入 250ul P2, 温和颠倒数次混匀。（在 5min 内）加入冰上预冷的溶液 N3 350ul ，迅速温和颠倒混匀，至出现 分散 的絮状沉淀。冰上静置 2min 后离心， 13， 000rpm ， 10min 。小心吸取上清于蓝色的 spin 柱中（勿吸到沉淀）离心 13， 000rpm ， 1min, 弃流出液加入 750ul PE, 离心 13， 000rpm ， 1min, 弃流出液9再离心一次，离心13, OOOrpm, 1min，弃流出液。以让管内彻底干燥。10 将 spin 柱拿出，置于一干净的 1.5ml 管中，小心的在 spin 柱中央加入 30ul