3,5 - 二硝基水杨酸(DNS)法测定总糖和还原糖

1、实验一 3, 5 - 二硝基水杨酸(DNS)法 测定总糖和还原糖 掌握还原糖和总糖测定的基本原理 掌握比色法测定还原糖的操作方法和分光光度计的使用。实验目的还原糖包括哪些糖？测试还原糖的方法有哪些？总糖包括哪些化合物？如何测定？3,5二硝基水杨酸(DNS)法的基本原理是什么？优点？3,5二硝基水杨酸(DNS)法测定时为什么要设计空白管？思考题实验原理还原糖与非还原糖还原性糖（Reducing sugar） 与斐林、土伦、本氏试剂呈正反应的糖非还原性糖（Nonreducing sugar）无变旋、还原、成脎性质在NaOH和丙三醇存在下，3,5-二硝基水杨酸（DNS）与还原糖共热后被还原生成氨基化

2、合物。在过量的NaOH碱性溶液中此化合物呈桔红色，在540nm波长处有最大吸收，在一定的浓度范围内，还原糖的量与光吸收值呈线性关系，利用比色法可测定样品中的含糖量。 本方法操作简便，快速，杂质干扰较少。试管和试管架 碱滴定管（50ml）铁架台 滴定管夹吸量管（1ml和2ml） 容量瓶（100ml）水浴锅 玻璃漏斗和烧杯。三脚架 量筒白瓷板 玻璃棒 实验器材762 分光光度计 756 分光光度计电子天平 恒温水浴 3,5-二硝基水杨酸（DNS）试剂：称取6.5g DNS溶于少量热蒸馏水中，溶解后移入1000ml容量瓶中，加入2mol/L氢氧化钠溶液325ml，再加入45g丙三醇，摇匀，冷却后定容

3、至1000ml。葡萄糖标准溶液：准确称取干燥恒重的葡萄糖100mg，加少量蒸馏水溶解后，再定容至100ml，即含葡萄糖为1.0mg/ml。6 M HCl：取250ml浓HCl(3538%) 蒸馏水稀释到500ml。碘-碘化钾溶液：称取5g碘，10g碘化钾溶于100ml蒸馏水中。6N NaOH：称120g NaOH溶于500ml蒸馏水中。0.1% 酚酞指示剂。实验材料 ：玉米粉实验试剂 （一）葡萄糖标准曲线制作管号葡萄糖标准液（ml）蒸馏水（ml）最终浓度（mg/ml）OD540nm00.01.00.010.20.80.220.40.60.430.60.40.640.80.20.851.00.0

4、1.01. 取6个试管，按下表加入1.0mg/ml葡萄糖标准液和蒸馏水 实验操作：2. 向各试管中分别加入DNS试剂1 ml，充分混合，放入沸水浴中加热煮沸2 min进行显色，取出试管放入盛有冷水的烧杯中迅速冷却。3.向各管中分别加入8 ml蒸馏水，充分混合。4.以空白管（0号管）做对照，于540nm 波长下调0，然后测定各管的OD值。5.以光吸收值作为纵坐标，葡萄糖含量为横坐标，绘制标准曲线。如果该直线不通过零点，必须重做。 （二）还原糖的制备1. 称取2g玉米粉，把它放入一个100ml的三角瓶中，然后加入2030ml蒸馏水，搅拌均匀。2. 把三角瓶放于一个50水浴中保温 30 min，不时

5、搅拌。3. 拿出三角瓶，将三角瓶内含物转入50ml的容量瓶中：过滤，定溶，充分混合，滤出液即为还原糖提取液。(三) 样品总糖的水解和提取 1. 取1g玉米粉，放在100ml三角瓶中，加15ml水溶解，再加10ml 6mol/L 盐酸，混匀。2. 将三角瓶置于沸水浴中加热煮沸30 min。3.取出12滴置于白瓷板上，加1滴I-KI溶液检查水解是否完全。如已水解完全，则不呈现蓝色。 4.拿出三角瓶，冷却，过滤，滤出液即为总糖提取液。5.加入3-5滴酚酞指示剂，混匀，用6mol/L的NaOH中和至溶液呈微红色。将中和后的溶液转入100 ml的容量瓶中定容。（四）样品中含糖量的测定1. 取5支试管，编号，按下表向每支试管中加入试剂。2. 用管1做对照，测定每管在540nm下的OD值。将结果记录在表中。试 剂管 号12345还原糖抽提液（ml）0.00.50.50.00.0总糖抽提液（ml）0.00.00.00.50.5DNS（ml）0.50.50.50.50.5加热在沸水浴中加热2分钟，然后冷却之。蒸馏水（ml）4.54.04.04.04.0OD540 3. 根据还原糖和总糖的OD值，使用葡萄糖的标准工作曲线，计算还原糖和总糖