枫叶色素含量的季节性变化测定实验方案复习过程

1、枫叶色素含量的季节性变化测定实验方案实验原理：枫叶中的色素，当叶子中所含的叶绿素占主导地位时，绿色就 为主色调，抑制了其他色素展现本来面目。入秋后，气温逐渐下降， 叶绿素的合成速度受阻，破坏却与日俱增，到后来叶片中只剩下花 青素、类胡萝卜等色素，于是它们便有机会尽情展现自己的如花娇 颜。另外，随着秋季不断降温，尤其是霜降之后，为适应即将到来 的寒冷气候，叶肉内积累了较多的糖分，这些糖分经过复杂的反应， 形成了花青素，也由此形成了秋叶变红的重要基础花青素：花青素是具有2-苯基苯并吡喃阳离子结构的衍生物， 广泛存在于植物中的水溶性天然色素。花青素在自然状态下常与各 种单糖形成糖昔，称为花色昔。溶液

2、PH不同，花色昔的存在形式也 不同。对于一个给定的PH值，在花色昔的4种结构之间存在着平衡: 蓝色的醍式(脱水)碱，红色的花烊正离子，无色的甲醇假碱和查 尔酮。花色昔在PH值很低时，其溶液呈现最强的红色。随着PH值 的增大，花色昔的颜色将褪至无色，最后在高PH值时变成紫色或蓝 色PH示差法测定花色昔含量的依据是花色昔发色团的结构转换是 PH的函数，起干扰作用的褐色降解物的特性不随PH变化。因此在 花青素最大吸收波长下确定两个对花青昔吸光度差别最大但是对花 色昔稳定的PH值。根据Fuleki T经验公式花青素含量(mg/100g)=TO.D/(avE%1cm XW X10)；TO.D=AXDVX

3、VF； A=A(pH1.0)-A(pH4.5).其中：DV稀释体积；VF稀释倍数；W样品重量；A-总吸光值；avE%1cm平均消光系数 代入数值计算：叶绿素a.b：叶绿素是由叶绿酸、叶绿醉和甲醇组成的二醇酷， 是四毗咯衍生物，其中的叶琳环是处于二氢形式，中心的金属原子为镁。蔬菜中的叶 绿素有叶绿素a和叶绿素b两类。叶绿素在植物细胞中与蛋白质结 合成叶绿素蛋白质，由多种叶绿素蛋白复合物构成叶绿体，当细胞死亡之后，叶绿 素就游离出来。叶绿素是一种不稳定的物质.不耐光、热、酸、 不溶于水，易溶于碱、乙醉与乙醚，在碱性溶液中，皂化为叶绿素 碱盐。叶绿素a、b在长波的最大吸收峰分别在663nm、645n

4、m，据 Lamber-Beer定律，可得浓度C与光密度D间的关系式：D663=82.04Ca +9.27CbD645=16.75Ca +45.6Cb(浓度单位：g/mL) 叶绿素 a 的浓度：Ca= 12.72D663 - 2.59D645 叶绿素 b 的浓度：Cb= 22.88D645 - 4.68 D663总叶绿素的浓度：Ct=20.29D645 +8.02D663 (浓度单位:mg/L) 材料与用品：枫叶提取液，乙醇95% (AR)，盐酸 仪器：PHs-3B 型酸度计，紫外分光光度计 丙酮、石英砂、碳酸钙 分光光度计、 天平、剪刀、研钵、移液管、漏斗、大试管实验步骤：1.花青素测定：1，

5、将花青素取液稀释至一定的体积，用稀氢氧化钠和稀盐酸调节 PH，观察提取液在不同PH下的颜色变化。对提取液进行200800nm 全波长扫描，绘制光谱图PH1.02.0原液4.59.5溶液颜色2.测定波长的选择取枫叶花青素提取液用5%HCL-EtOH (15:85)溶液稀释至一定 体积，进行光谱扫描，确定最大吸收波长。紫外可见吸收光谱PH示差法中PH的选择在选定PH时应考虑以下因素：在此两个PH处测定的花青素的 吸收值差异应是最显著的；单一 PH的轻微变动，对花青素吸光值的 影响是极小的；花青素在所处的两个PH下，应是相当稳定的。由于 花青素只有在酸性介质中是稳定的，因此只测定PH小于7条件下花

6、青素吸光值的变化。PH为1. 0时，花青素以红色的2-苯基苯并吡喃 的形式存在PH为4.5时，花青素以无色的甲醇假碱的形式存在。因 此选择PH为1.0和4.5。平衡时间的确定因为花青素在溶液介质中存在4种结构形式，这4种结构形式 在某一 PH下处于动态平衡，当PH改变时，动态平衡发生转移，总 的趋势是PH降低时，平衡向红色的2-苯基苯并吡喃阳离子移动； ?日升高时平衡向蓝色醍式移动。一定时间后达到一个新的平衡。因 此提取液用缓冲液稀释后，必须静置一段时间，等动态平衡处于稳 定后，才能测定吸光值。花青素在缓冲液中的吸光度值与时间的变化关系(入二nm)T(min)01020PH1.0 buffer

7、PH4.5 buffer305080110结果表明，花青素在缓冲液中的吸光度值随时间变化，在 PH1.0()基本稳定，在PH4.5时()基本稳定。所以综合考虑，选择平衡时间为火棘果花青素含量的测定 移取浓缩液2ml，用5%HCL-EtOH稀 释、定容至100ml，分别移取10ml，用PH1.0和PH4.5的缓冲液稀 释至100ml，平衡()min，在波长 处测定吸光值。根据Fuleki T经验公式花青素含量(mg/100g)=TO.D/(avE%1cm XW X10)；TO.D=AXDVXVF； 二A(pH1.0)-A(pH4.5).2,叶绿素a.b测定：称1.25g叶用丙酮研磨I匀浆过滤(用

8、80%丙酮洗研钵及残渣，合并滤液)滤液用80%丙酮定容至25mLI适当稀释后测A645、A6631取样：称取1.25g剪碎的叶片(提供的样品即为剪碎后冻于-80笆 的叶片)放入研钵中。注意取样时要避开大的叶脉。2研磨提取：向研钵中加入80%丙酮2.5ml,以及少许(约0.002g) CaCO3 (中和酸性，防止叶绿素酯酶分解叶绿素)和石英砂，研磨成 匀浆，再加入3ml 80%丙酮，继续研磨至组织变白，在暗处静止 35min后，用一层干滤纸过滤到25ml容量瓶中，用滴管吸取80%丙 酮将研钵洗净，清洗液也要过滤到容量瓶中，并用80%丙酮沿滤纸的 周围洗脱色素，待滤纸和残渣全部变白后，用80%丙酮

9、定容至刻度。3读取吸光度：取厚度为lcm的洁净比色皿，注意不要用手接触比 色皿的光面，先用少量色素提取液清洗23次，注意清洗时要使清洗 液接触比色皿内壁的所有部分，然后将色素提取液倒入比色皿中， 液面高度约为比色皿高度的4/5，将撒在比色皿外面的溶液用滤纸吸 掉(注意不能擦)，再用擦镜纸擦干擦净。将比色皿放入仪器的比 色皿架上，注意不要将溶液撒入仪器内。第一个位置放盛有80%丙酮 的比色皿，做为空白对照。将仪器波长分别调至663、645nm处，以 80%丙酮做为空白对照调透光率100%，分别测定溶液在上述2个波长 下的吸光度。每个样品重复测定3次。注意，每次在转换波长时，都 要用80%丙酮调透

10、光率100%。结果计算：根据Fuleki T经验公式(1)花青素含量(mg/100g)=TO.D/(avE%1cm XW X10)；TO.D=AXDVXVF； A=A(pH1.0)-A(pH4.5).其中：DV稀释体积；VF稀释倍数；W样品重量；A-总吸光值；avE%1cm平均消光系数 代入数值计算：（2）D663=82.04Ca +9.27CbD645=16.75Ca +45.6Cb（浓度单位：g/mL）叶绿素 a 的浓度：Ca= 12.72D663 - 2.59D645叶绿素 b 的浓度：Cb= 22.88D645 - 4.68 D663总叶绿素的浓度：Ct=20.29D645 +8.02D6