产纤维素酶真菌的酶活测定及复核鉴定-定稿

1、产纤维素酶真菌的酶活测定及复核鉴定摘要：试验中的真菌一部分来源于九寨沟的土壤中和枯枝落叶中，还有部分来自于河北迁安市及胜利油田的污染土壤中。包括ACCC31726、ACCC32491、ACCC32567、ACCC32568等共计29株菌对其进行了微生物纯化、分离、筛选、酶活的测定及复核鉴定等。关键词：纤维素酶活筛选真菌ITS鉴定纤维素是自然界存在量最大的一类天然资源，且可无限再生。麻、麦秆、稻草、甘蔗渣等，都是纤维素的丰富来源。并且我国每年产秸秆约7亿多吨，实现秸秆资源高效利用，是我国可持续发展面临的重要问题。能源危机和环境危机是整个人类社会目前面临的严峻问题，而合理有效的处理和利用纤维素资源

2、将为解决这些问题提供一种有效的手段。本实验通过对菌种产纤维素酶活的测定确定其酶活高低，并综合形态观察和ITS序列分析对其进行鉴定。材料与方法1.1试验材料1.1.1试验菌种试验菌种一部分来源于九寨沟的土壤中和枯枝落叶中，还有部分来自于河北迁安市及胜利油田的污染土壤中。包括ACCC31726、ACCC32491、ACCC32567、ACCC32568等共计29株菌，所有菌种均来源于中国农业微生物菌种中心（ACCC）。1.1.2培养基马铃薯葡萄糖琼脂（PDA）培养基马铃薯200.0g葡萄糖20.0g琼脂15.020.0g蒸馏水1000.0mLpH自然马铃薯去皮，切成块煮沸30.0min,然后用纱布

3、过滤，再加糖及琼脂，溶化后补足水至1000.0mL羧甲基纤维素培养基（CMCNa）NH4NO31.0gMnSO40.004g HYPERLINK l bookmark4 MgSO47H2O0.5g琼脂20gKH2PO41.0gZnCl20.0017g HYPERLINK l bookmark10 FeSO40.01g蒸馏水1000mlKCl0.5gCoCl20.002gCMCNa10gpH6.5羧甲基纤维素液体培养基（同羧甲基纤维素固体培养基配方，不加琼脂）液体发酵培养基玉米秸秆粉（40目）10.0g麸皮2.5gKH2PO41.5g（NH4）2SO41.3gK2HPO43H202.9gCaCl

4、20.15gMgCl21.0gFeSO40.005gMnSO40.0061gNaCl1.0g蒸馏水1000mL1.1.3主要试剂1.0%羧甲基纤维素钠（CMC-Na）：2g羧甲基纤维素钠（粘度300600里泊）溶于200.0mL蒸馏水中，水浴加热至溶解，用一层纱布过滤，取滤液100.0mL加pH4.8的醋酸盐缓冲液20.0mL，再加蒸馏水410.0mL，贮冰箱备用。一周后应重新配制。3,5-二硝基水杨酸试剂（DNS）制备：将6.3g3,5-二硝基水杨酸和2.0mol/LNaOH溶液262.0mL，加到500.0mL含有185.0g酒石酸钾钠的热水溶液中，再加5.0g结晶酚和5.0g亚硫酸钠，搅

5、拌溶解。冷却后用蒸馏水定容至1000.0mL，贮于棕色瓶中，半个月后使用。pH4.6的醋酸-醋酸钠缓冲液：11.8mL冰醋酸定容至100.0mL，称取27.2g的醋酸钠溶解并定容至100.0mL，将上述两种溶液等体积混合。1%水杨苷溶液：1g的水杨苷溶液加少许pH6的缓冲液,，再用pH6的缓冲液定容至100mL。1mg/mL刚果红、水杨苷、whatmanNO.1试纸、1mg/mL的葡萄糖标准液、羟基纤维素钠、葡萄糖、苯酚：氯仿：异戊醇（25:24:1）、无水乙醇（预冷）、70%乙醇（预冷）、氯仿异戊醇（24:1）、液氮、CTAB缓冲液、ITS1、ITS5、Buffer、Taq酶、dNTP、TE

6、缓冲液、DNA电泳胶（0.8g,100ml,5%TBE）、PCR电泳胶（1.0g,100ml，1%TBE）。1.2实验方法1.2.1菌种的初筛采用的刚果红染色法对菌株的酶活力进行初步筛选。1211实验原理：刚果红能与培养基中的纤维素形成红色复合物，当纤维素被纤维素酶分解后，刚果红纤维素的复合物便没法形成，培养基中会出现以纤维素分解菌为中心的透明圈，通过是否产生透明圈来筛选纤维素分解菌。1.2.1.2实验步骤：菌落长满平皿后，加入适量1.0mg/mL的刚果红溶液，染色1h后倾去染液，加入适量1.0mol/L的NaCl溶液，洗涤1h。菌体若能分泌纤维素酶，则在菌体周围会出现清晰的透明圈，根据透明圈

7、与菌落直径比值的大小选择菌株。122菌株的复筛将初筛的11株真菌接种到液体发酵培养基中，加一个空白对照管，进行摇瓶发酵培养（28，200r/min），分别测定菌株在培养第3d、4d、5d、6d的CMC酶，以酶活力为指标筛选菌株。123纤维素酶活力测定1.2.3.1原理：纤维素酶是一种多组分的酶，其中C1酶的作用是将天然纤维素水解成无定形纤维素；C酶的作用是将无定形纤维素继续水解成纤维素寡糖；而0葡萄糖x苷酶的作用是将纤维素寡糖水解成葡萄糖。纤维素酶水解纤维素产生的纤维二糖、葡萄糖等还原糖能将3,5-二硝基水杨酸还原，生成棕红色的氨基化合物，利用比色法测定其还原物生成量就可测定纤维素酶的活力。1

8、.2.3.2葡萄糖标准曲线的绘制准确称取葡萄糖250.0mg，溶于蒸馏水中，定容至250.0mL。分别吸取0.1%标准葡萄糖溶液2.0、4.0、6.0、8.0、10.0mL，分别定容至50.0mL。再分别吸取上述溶液各2.5mL于试管中，各加2.5mL3,5-二硝基水杨酸，煮沸5min（另设1管对照，取2.5mL蒸馏水，加2.5mL3,5-二硝基水杨酸，同样煮沸5min）。冷却后，用紫外分光光度计在550nm波长下比色，记录各管的吸光值，以吸光值作横座标，对应标准葡萄糖溶液含糖的毫克数为纵座标，绘制标准曲线。酶活力定义：在上述条件下，每小时释放1“g葡萄糖的量为一个酶活力单位（U）。葡萄糖含量

9、（mg）0.10.20.30.40.5OD550nm直87654321U3专薔櫃Oy=1.7160 x-0.1302R2=0.99120.0480.2110.3550.5950.724酶液提取将液体发酵液取出后（包括空白对照），用离心机4500r/min离心10min（去除杂蛋白及一些影响吸光值测定的杂质），取上清液则为粗酶液。CMC酶活力测定用CMC酶活力代表内切酶活力。在试管中加入1.2mL1.0%浓度的羧甲基纤维素钠的缓冲液，再加入0.4mL适当稀释的酶液，于50C恒温水浴锅保温30min，迅速加入DNS试剂2.4mL，沸水中煮5min，冷却至室温，加蒸馏水至20.0mL，混合均匀，取上

10、清液在550nm处测定吸光值。1.2.3.5滤纸酶活力（FPA）测定取WhatmanNO.1滤纸一条（1cmx6cm,约50mg），卷成筒状，投入试管底部,加1.0mLpH值4.6的0.05M醋酸-醋酸钠缓冲液，再加入适当稀释的酶液0.4mL，盖上塞子。将其置于50C恒温水浴锅保温60min。取出试管，迅速加入DNS试剂2.4mL，沸水中煮5min,冷却至室温，加蒸馏水至20.0mL，混合均匀。取上清液在550nm处测定吸光值。1.2.3.6-葡萄糖苷酶活力测定在试管中加入1.2mll.O%水杨苷溶液的缓冲液并加入0.4mL适当稀释的酶液，50C恒温水浴锅保温30min后迅速加入2.4mLDN

11、S试剂，沸水浴5min,冷却后加水稀释到20.0mL，在550nm处测定吸光值。空白对照，对照样品预先煮沸灭酶活lOmin,其它同上。1.2.4菌株鉴定1.2.4.1菌落形态观察将菌株分别接种到PDA平皿中培养，进行菌落形态观察和显微形态观察。1.2.4.2菌株DNA鉴定菌株活化：将菌株接种到盖有玻璃纸的PDA平皿中，于28C培养34d，待菌丝茂盛而未大量形成抱子时，用已经灭菌的药匙刮去菌丝进行DNA鉴定。DNA提取将已刮好的装在离心管中的菌丝(装在2离心管中)加入液氮。将其放入研磨机研磨至均匀。将预热65C的CTAB缓冲液800ml加入离心管中并且摇匀。将离心管放在65C水浴锅中水浴30mi

12、n。水浴结束后加入Tris饱和酚：氯仿异戊醇(25:24:1)等体积混合，12000r5min离心结束后取上清液加等体积的氯仿异戊醇(24:1)混合，12000r5min离心结束后取上清液加等体积的氯仿异戊醇(24:1)混合，12000r5min取上清液加满冰箱预冷(4C)的无水乙醇，放4C冰箱20min。看是否有沉淀，多沉淀的用黄色枪头挑出放入一个干净的离心管中。无絮状沉淀离心10000r10min，然后倒出液体。将冰箱预冷的70%的乙醇加入离心管1ml洗涤DNA。重复第10步(第二遍加时稍微摇一下，充分接触)把离心管倒立在吸水纸上至管壁没有水珠，观察DNA的量。若DNA含量高，加入100u

13、lTE缓冲液，中等加80ulTE缓冲液，少则加入60ulTE缓冲液。再离心2min，放入4C冰箱中。DNA电泳(1)制备凝胶：电泳缓冲液配制的1.0%琼脂糖用微波炉融化，混匀冷却至，倒入已封好的凝胶灌制平台上，插上样品梳(琼脂糖的厚度在样品梳的1/3左右)。取DNA提取产物5.0吐，与2.0吐加样缓冲液混匀，点样于1.0%的琼脂糖凝胶，以MarkerV(全式金生物技术公司提供)为分子量标记。5V/cm恒压电泳,当加样缓冲液中的溴酚蓝迁移至足够分离DNA片段的距离时,关闭电源，电泳结束后将凝胶先在溴化乙锭染色液中染色1015min,然后在凝胶呈像仪上观察其明暗程度并保存于电脑中。1.2.4.2.

14、3ITS扩增反应及测序利用TransGen公司的2XTaqSuperMix进行扩增反应。以提取的菌株DNA为模板,以ITS1(5-CGTAGGTGAACCTGCGG-3)和ITS4(5-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3)(WhiteT.J.etal.,1990)为引物，扩增ITS片段,扩增体系如表。PCR反应体系成分体积备注dNTP1吐引物ITS1(10pmol/L)1吐(1OD稀释至引物ITS4(10pmol/L)1吐500吐)Buffer5吐(1OD稀释至IaqE1吐500吐)DNA模板5吐ddH20补足至50yLPCR反应条件列表PCR条件温度时间预变性95C3min变性95

15、C2min退火53C35s延伸72C1min循环数34延伸72C10min取PCR扩增产物于1.0%的琼酯糖凝胶上，以MarkerV为分子量标记。于lxTAE缓冲液中，5V/cm电压下进行电泳，电泳结束后将凝胶先在溴化乙锭染色液中染色1015min，观察其明暗程度并保存于电脑中。PCR产物送上海英骏生物技术有限公司进行序列测定。2结果与分析2.1产纤维素酶菌株的筛选对供试菌株通过刚果红染色法进行初筛，通过发酵培养测纤维素酶活力进行复筛，筛选出11真菌株纤维素分解菌，获得菌种的水解圈直径与菌落直径的比值，结果见表。不同菌株透明圈与菌落直径菌株编号透明圈直径菌种编号透明圈直径/菌种编号透明圈直径/

16、菌落直径菌落直径菌落直径ACCC325672.57JZG8-32ACCC325721.41ACCC317261.28ACCC325691.83ACCC325711.24五3-3033ACCC324913ACCC325681.31ACCC325661.38ACCC316013.29从此表可以看出真菌ACCC31601的水解圈的直径与菌落直径比值最大。然后分别在100mL的纤维素酶活性测定液体培养基中，接种真菌，培养9d。每24h取样，测得CMC酶活力见下表。初筛菌株液体发酵粗酶液CMC酶活力（U/ml）菌株4d5d6d7d8d9dACCC32567723.5951.85973.31023.358

17、16530ACCC31726-142.1680.15715.9980.451116.3301.2五3-303-206.45265.45558.6708.751366.55758.8ACCC32566644.41216.41287.91802.71352.251187.8ACCC32572122.45765.95937.551388744.5701.6ACCC32568-84.9830.31051.95966.15765.95551.45JZG8-3315.5944.71030.5916.1787.4715.9ACCC32569522.851137.751345.11402.31466.6515

18、1.05ACCC32491-199.3901.8966.151430.9451.35201.1ACCC31601201.11852.752081.552260.31609.65994.75ACCC32571551.45465.651266.45951.8537.15537.15在初步确定有降解纤维素能力的11株菌中，菌株ACCC31601、ACCC32566发酵过程中产生的CMC酶活力相对较高。其中菌株ACCC31601发酵液的CMC酶活力最高，为2260.3U/mL,其透明圈与菌落直径的比值也最大。菌株ACCC32566发酵液的CMC酶活力稍低，为1802.7U/mL。初筛菌株液体发酵粗酶液

19、FPA酶活力（U/ml）菌株4d5d6d7d8d9dACCC32567723.5951.85973.31023.35816530ACCC31726-142.1680.15715.9980.451116.3301.2五3-303-206.45265.45558.6708.751366.55758.8ACCC32566644.41216.41287.91802.71352.251187.8ACCC32572122.45765.95937.551388744.5701.6ACCC32568-84.9830.31051.95966.15765.95551.45JZG8-3315.5944.71030.

20、5916.1787.4715.9ACCC32569522.851137.751345.11402.31466.65151.05ACCC32491-199.3901.8966.151430.9451.35201.1ACCC31601201.11852.752081.552260.31609.65994.75ACCC32571551.45465.651266.45951.8537.15537.15由表可以看出ACCC31601和ACCC31726的FPA酶活较高。初筛菌株液体发酵粗酶液卩-葡糖糖苷酶活力（U/ml）菌株4d5d6d7d8d9dACCC32567644.41266.45973.354

21、4.3458.5122.45ACCC31726808.85973.3923.251152.05894.65608.65五3-303294.052746.51223.55908.95901.8251.15ACCC32566322.651216.41087.7858.9344.1251.15ACCC32572751.65951.851123.45908.95773.1472.8ACCC32568901.8994.751001.91287.91159.2544.3JZG8-3172.51037.651202.1858.9687.3415.6ACCC32569251.151273.61581.0511

22、23.45651.55429.9ACCC32491530730.2873.2701.6601.5258.3ACCC316011037.6511021202.1251.15179.65129.6ACCC32571858.9887.526751223.551037.65279.75表中五3-303和ACCC32569的卩嘀糖糖苷酶活较高。面是其折线图OO初筛菌株液体发酵粗酶液CMC酶活力(U/mEACCC32567-ACCC31726五3-303ACCC32566ACCC32572ACCC32568JZG8-3ACCC32569ACCC32491ACCC31601ACCC32571k,W45678

23、9图1初筛菌株液体发酵粗酶液CMC酶活力oooooOooooO505052211oooOooOV5O5匚1一IS5-Rw初筛菌株液体发酵粗酶液卩葡糖糖昔酶活力/ml)ooOoOoO21菌株酶活力：ACCC31601的酶活力最高，达2260.3U/m1,其透明圈与菌种直径的比值也是最大的。可以看出水解圈与酶活高低有关联。其次是ACCC32566,其酶活达1802.7U/m1。图2初筛菌株液体发酵粗酶液FPA酶活力ACCC32567ACCC31726五3-303ACCC32566ACCC32572ACCC32568JZG8-3ACCC32E69ACCC32491ACCC31601ACCC32571

24、FPA酶活力：ACCC31726的酶活力最高1731.2U/m1,其次是ACCC31601，其酶活达到1666.85U/m1。图3初筛菌株液体发酵粗酶液伕葡糖糖苷酶活力ACCC32567ACCC31726五3-303ACCC32566ACCC32572ACCC32568JZG8-3ACCC32569ACCC32491ACCC31601ACCC32571从图3可以看出：五3-303的酶活达到2746.5U/ml，其次是ACCC32569酶活达到1581.05U/ml。2.2对酶活测定的11株菌种进行了形态学鉴定，以下为其鉴定结果2.2.1菌株ACCC31601（原始编号：141-3）形态学鉴定在

25、PDA上黑暗培养，28C培养3天菌落直径85mm,在28C培养48h内出现分生抱子。菌落暗绿色，中间为产抱区，外缘也产抱，菌丝少。PDA上产生黄色的扩散性色素。显微镜下分生孢子梗丛束疏松，环状排列。分生孢子梗主分枝呈树状，其上众多次级分枝，基部变细、中间膨大、以大角度伸出，终极甁梗长而细。2.2.2菌株ACCC32566（原始编号：迁4-2）形态学鉴定PDA上菌落呈绿色，絮状，生长迅速，一般25C下3天基本可以铺满平板，木霉菌落开始时为白色，致密，圆形，向四周扩展，后从菌落中央产生绿色抱子，中央变成绿色。菌落周围有白色菌丝的生长带。在显微镜下可以看到其抱子呈爪状,分生孢子梗主分枝呈树状，其上众

26、多次级分枝、以大角度伸出，终极甁梗长而细。2.2.3菌株ACCC31572（原始编号：三5-10）、菌株ACCC32569（原始编号：三4-4）形态学鉴定菌落特征：该菌生长缓慢，菌落呈放射状向外延生，菌丝初为白色，后期抱子呈绿色；形态特征：菌丝体产生大量的分生抱子梗。分生抱子梗顶端膨大成为顶囊,一般呈球形。项囊表面长满一层或两层辐射状小梗（初生小梗与次生小梗）。最上层小梗瓶状，顶端着生成串的球形分生抱子。2.2.4菌株五3-303形态学鉴定菌落特征：该菌生长非常缓慢，菌落呈放射状向外延生，菌丝初为白色，后期抱子呈绿色。形态特征：基部无足细胞，顶端不形成膨大的顶囊，其分生抱子梗经过多次分枝，产生

27、几轮对称或不对称的小梗，形如扫帚，称为帚状体。2.2.5菌株ACCC32491（原始编号：JZG12-1）形态学鉴定菌落特征：该菌生长迅速，呈不定型棉絮状或致密丛束状，其表面的颜色多呈绿色。菌丝有隔分枝，厚垣抱子有或无。分生抱子梗是菌丝的短侧枝，侧枝上对称或互生分枝，形成二级和三级分枝，分枝角度为锐角或近于直角，在分枝末端形成瓶状小梗。分生抱子多为卵圆形，无色或绿色，簇生于小梗顶端。2.2.6菌株ACCC32568（原始编号：JZG7-1）、菌株JZG8-3形态学鉴定菌落特征：该菌生长较快，菌落呈放射状向外延生，菌丝各细胞之间有横隔膜，菌丝初为白色，后期抱子呈绿色。形态特征：基部无足细胞，顶端

28、不形成膨大的顶1囊，其分生抱子梗经过多次分枝，产生几轮对称或不对称的小梗，形如扫帚。JZG7-I2.2.7菌株ACCC32567（原始编号：四6-5）形态学鉴定菌落特征：该菌落生长较快，呈丝绒状至絮状，致密，其表面颜色呈灰绿色。分生抱子头球形至辐射形，一般直径为52-125“m，小分生抱子头似青霉状，呈疏松柱形或散乱；分生抱子梗直接生于基质或生于气生菌丝，壁较厚，光滑，顶囊较小，近球形或稍呈椭圆形，分生抱子为球形或近球形，壁明显粗糙，具小刺。2.311株菌种的rDNA-ITS序列分析2.3.1为确定11株菌株在分类学地位，对其进行了ITS基因序列测定，所获的ITS基因序列长度在60Obp左右，

29、然后在NCBI中进行比对。2.3.2以下为11株菌种的ITS序列2321菌株ACCC31601的DNA-ITS区序列：CGCTTCGAATTTACACTCCAAACCCAATGTGAACGTTACCAAACTGTTGCCTCGGCGGGATCTCTGCCCCGGGTGCGTCGCAGCCCCGGACCAAGGCGCCCGCCGGAGGACCAACCAAAACTCTTATTGTATACCCCCTCGCGGGTTTTTTTATAATCTGAGCCTTCTCGGCGCCTCTCGTAGGCGTTTCGAAAATGAATCAAAACTTTCAACAACGGATCTCTTGGTTCTGGCATCGATG

30、AAGAACGCAGCGAAATGCGATAAGTAATGTGAATTGCAGAATTCAGTGAATCATCGAATCTTTGAACGCACATTGCGCCCGCCAGTATTCTGGCGGGCATGCCTGTCCGAGCGTCATTTCAACCCTCGAACCCCTCCGGGGGGTCGGCGTTGGGGATCGGCCCTCCCTTAGCGGGTGGCCGTCTCCGAAATACAGTGGCGGTCTCGCCGCAGCCTCTCCTGCGCAGTAGTTTGCACACTCGCATCGGGAGCGCGGCGCGTCCACAGCCGTTAAACACCCAACTTCTGAAATGTTGACCTC

31、GGATCAGGTAGGAATACCCGCTGAACTTAAGCATATCAATAAGCGGAAGAA通过比对确定其为Trichodermaharzianum（哈茨木霉）2322菌株ACCC32566的DNA-ITS区序列：TACCGAGTTTACAACTCCCAAACCCAATGTGAACGTTACCAATCTGTTGCCTCGGCGGGATTCTCTGCCCCGGGCGCGTCGCAGCCCCGGATCCCATGGCGCCCGCCGGAGGACCAACTCAAACTCTTTTTTCTCTCCGTCGCGGCCTACGTCGCGGCTCTGTTTTATTTTTGCTCTGAGCCTTTCTC

32、GGCGACCCTAGCGGGCGTCTCGAAAATGAATCAAAACTTTCAACAACGGATCTCTTGGTTCTGGCATCGATGAAGAACGCAGCGAAATGCGATAAGTAATGTGAATTGCAGAATTCAGTGAATCATCGAATCTTTGAACGCACATTGCGCCCGCCAGTATTCTGGCGGGCATGCCTGTCCGAGCGTCATTTCAACCCTCGAACCCCTCCGGGGGGTCGGCGTTGGGGATCGGCCCCTCACCGGGCCGCCCCCGAAATACAGTGGCGGTCTCGCCGCAGCCTCTCCTGCGCAGTAGTTTGC

33、ACACTCGCACCGGGAGCGCGGCGCGGCCACAGCCGTAAAACACCCCAAACTCTGAAATGTTGACCTCGGATCAGGTAGGAATACCCGCTGAACTTAAGCAT通过比对确定其为Trichodermacitrinoviride（桔绿木霉）2323菌株ACCC32569的DNA-ITS区序列：ACCGAGTGCGGGCTGCCTCCGGGCGCCCAACCTCCCACCCGTGACTACCTAACACTGTTGCTTCGGCGGGGAGCGCCCCTCGGGGAGCGAGCCGCCGGGGACCACCGAACTTCATGCCTGAGAGTAATGCAGTC

34、TGAGCCTGAATAGTATAATCAGTCAAAACTTTCAACAATGGATCTCTTGGTTCCGGCATCGATGAAGAACGCAGCGAACTGCGATAAGTAATGTGAATTGCAGAATTCAGTGAATCATCGAGTCTTTGAACGCACATTGCGCCCCCTGGCATTCCGGGGGGCATGCCTGTCCGAGCGTCATTGCTGCCCATCAAGCCCGGCTTGTGTGTTGGGTCGTCGTCCCCCCCTCCGGGGGGGGGACGGACCCGAAAGGCAGCGGCGGCACCGTGTCCGGTCCTCGAGCGTATGGGGCTTTGTCAC

35、CCGCTCGACTAGGGCCGGCCGGGCGCCAGCCGGCGTCTCCAACCATTTTCTTCAGGTTGACCTCGGATCAGGTAGGGATACCCGC通过比对确定其为Aspergillusaureolatus（具黄曲霉）232.4菌株ACCC32491的DNA-ITS区序列：AGGGACCAACCAAACTCTTTCTGTAGTCCCCTCGCGGACGTTATTTCTTACAGCTCTGAGCAAAAATTCAAAATGAATCAAAACTTTCAACAACGGATCTCTTGGTTCTGGCATCGATGAAGAACGCAGCGAAATGCGATAAGTAATGTGAA

36、TTGCAGAATTCAGTGAATCATCGAATCTTTGAACGCACATTGCGCCCGCCAGTATTCTGGCGGGCATGCCTGTCCGAGCGTCATTTCAACCCTCGAACCCCTCCGGGGGTCCGGCGTTGGGGATCGGGAACCCCTAAGACGGGATCCCGGCCCCGAAATACAGTGGCGGTCTCGCCGCAGCCTCTCATGCGCAGTAGTTTGCACAACTCGCACCGGGAGCGCGGCGCGTCCACGTCCGTAAAACACCCAACTTCTGAAATGTTGACCTCGGATCAGGTAGGAATACCCGCT通过比对确定其为T

37、richodermaviride（绿色木霉）2.3.2.5菌株ACCC32572的DNA-ITS区序列：AGCGCCCCTCGGGGAGCGAGCCGCCGGGGACCACCGAACTTCATGCCTGAGAGTAATGCAGTCTGAGCCTGAATAGTATAATCAGTCAAAACTTTCAACAATGGATCTCTTGGTTCCGGCATCGATGAAGAACGCAGCGAACTGCGATAAGTAATGTGAATTGCAGAATTCAGTGAATCATCGAGTCTTTGAACGCACATTGCGCCCCCTGGCATTCCGGGGGGCATGCCTGTCCGAGCGTCATTGCT

38、GCCCATCAAGCCCGGCTTGTGTGTTGGGTCGTCGTCCCCCCCTCCGGGGGGGGGACGGACCCGAAAGGCAGCGGCGGCACCGTGTCCGGTCCTCGAGCGTATGGGGCTTTGTCACCCGCTCGACTAGGGCCGGCCGGGCGCCAGCCGGCGTCTCCAACCATTTTCTTCAGGTTGACCTCGGATCAGGTAGGGATACCCGCTGAAC通过比对确定其为Aspergillusaureolatus（具黄曲霉）2.3.2.6菌株ACCC32571的DNA-ITS区序列：CGCCCAACCTCCCACCCGTGACTACCTAAC

39、ACTGTTGCTTCGGCGGGGAGCCCCCCAGGGGCGAGCCGCCGGGGACCACTGAACTTCATGCCTGAGAGTGATGCAGTCTGAGCCTGAATACAAATCAGTCAAAACTTTCAACAATGGATCTCTTGGTTCCGGCATCGATGAAGAACGCAGCGAACTGCGATAAGTAATGTGAATTGCAGAATTCAGTGAATCATCGAGTCTTTGAACGCACATTGCGGCGTCTCCAACCTTATTTTTCTCAGGTTGACCTCGGATCAGGTAGGGATACCCGCTGAACTTAAGCATATCAATAAGC通过比对确

40、定其为Aspergillusnidulans（构巢曲霉）2327菌株ACCC31726的DNA-ITS区序列：GGCTCACGCCCCCGGGCCCGCGCCCGCCGAAGACACCCCCGAACTCTGTCTGAAGATTGAAGTCTGAGTGAAAATATAAATTATTTAAAACTTTCAACAACGGATCTCTTGGTTCCGGCATCGATGAAGAACGCAGCGAAATGCGATACGTAATGTGAATTGCAAATTCAGTGAATCATCGAGTCTTTGAACGCACATTGCGCCCCCTGGTATTCCGGGGGGCATGCCTGTCCGAGCGTCATTGC

41、TGCCCTCAAGCCCGGCTTGTGTGTTGGGCCCCGTCCTCCGATTCCGGGGGACGGGCCCGAAAGGCAGCGGCGGCACCGCGTCCGGTCCTCGAGCGTATGGGGCTTTGTCACCCGCTCTGTAGGCCCGGCCGGCGCTTGCCGATCAACCCAAATTTTTATCCAGGTTGACCTCGGATCAGGTAGGGATACCCGCTGAACTTAAGCATATCAATAAGCGGAGG通过比对确定其为Trichodermaovalisporum（卵抱木霉）2328菌株ACCC32568的DNA-ITS区序列：GGGGACGCACGTCTCC

42、GGGCCCGCGCCCGCCGAAGCGCTCTGTGAACCCTGATGAAGATGGGCTGTCTGAGTACTGTGAAAATTGTCAAAACTTTCAACAATGGATCTCTTGGTTCCGGCATCGATGAAGAACGCAGCGAAATGCGATAAGTAATGTGAATTGCAGAATTCCGTGAATCATCGAATCTTTGAACGCACATTGCGCCCCCTGGCATTCCGGGGGGCATGCCTGTCCGAGCGTCATTTCTGCCCTCAAGCACGGCTTGTGTGTTGGGTGTGGTCCCCCCGGGGACCTGCCCGAAAGGCAGCGGCGACG

43、TCCGTCTGGTCCTCGAGCGTATGGGGCTCTGTCACTCGCTCGGGAAGGACCTGCGGGGGTTGGTCACCACCATGTTTTACCACGGTTGACCTCGGATCAGGTAGGAGTTACCCGCTGAACTTAAGCATATCAATAAGC通过比对确定其为Penicilliumpinophilum（嗜松青霉）2329菌株ACCC32567的DNA-ITS区序列：GCCACCTCCCACCCGTGAATACCTAACACTGTTGCTTCGGCGGGGAACCCCCTCGGGGGCGAGCCGCCGGGGACTACTGAACTTCATGCCTGAGAGTGAT

44、GCAGTCTGAGTCTGAATATAAAATCAGTCAAAACTTTCAACAATGGATCTCTTGGTTCCGGCATCGATGAAGAACGCAGCGAACTGCGATAAGTAATGTGAATTGCAGAATTCAGTGAATCATCGAGTCTTTGAACGCACATTGCGCCCCCTGGCATTCCGGGGGGCATGCCTGTCCGAGCGTCATTGCTGCCCATCAAGCCCGGCTTGTGTGTTGGGTCGTCGTCCCCCCCGGGGGACGGGCCCGAAAGGCAGCGGCGGCACCGTGCGACGTCTCCAACCATTTTTCTTCAGGTTGACC

45、TCGGATCAGGTAGGGATACCCGCTGAACTTAAGCATATCAA通过比对确定其为Aspergillussydowii（聚多曲霉）23210菌株五3-303的DNA-ITS区序列：ATGGTTGGAGACGCCGGCTGGCGCCCGGCCGGCcCTAGTCGAGCGGGTGACAAAGCCCCATACGCTCGAGGACCGGACACGGTGCCGCCGCTGCCTTTCGGGTCCGTCCCCCCCCCGGAGGGGGGGAACGACAACCCAACACACAAGCCGGGTTTTTATGGGCAGCAATGACGCTCGGACAGGCATGCCCCCCGGAATGCCAGGGGGCGCAATGTGCGTTCAAAGACTCGATGATTCACTGAATTCTGCAATTCACATTACTTATCGCAGTTCG