正交设计优化茴香随机扩增多态DNA反应体系的研究

1、正交方案优化茴香随机扩增多态DNA反响体系的研究李海渤，王羽梅，何金明【关键词】茴香；正交方案；随机扩增多态DNA；反响体系；方差阐发Keyrds：Fennel;rthgnaldesign;RAPD;Reatinsyste;Varianeanalysis茴香Feniuluvulgareil1.为伞形科茴香属多年生宿根草本植物，原产地中海沿岸及西亚，在我国北方各地被普及种植。茴香的茎、叶、种子都含有挥发油，其重要身分为茴香醚及茴香酮，具有特别的香味。我国北方重要把茴香作调味品或馅食。其果实可作香料及药用，有温肝肾、暖胃气、散寒结的作用1。随机扩增多态DNA(RandAplifiedPlyrphi

2、sDNA，RAPD)标识表记标帜是由illias等和elsh等在PR技能底子上生长起来的一种分子标识表记标帜，普及应用于遗传多样性阐发、物种进化、品种断定、分类等研究范畴。为了更好地利用RAPD技能对茴香举行聚类阐发，确定品种间亲缘干系，进而为茴香育种提供理论引导，本研究以内蒙古茴香DNA为质料，接纳正交方案构建扩增方案，并对实行结果举行方差阐发，对各因素程度间举行了SSR法多重比力，终极创立了得当于茴香的RAPD最正确反响体系，以期为进一步的RAPD研究打下稳固的基矗1质料与要领1.1DNA的提取以SDS法提取内蒙古茴香总DNA，以1.0(V)琼脂糖凝胶电泳检测所得DNA质量，并用UV300

3、0型紫外分光光度计检测DNA浓度，ddH2稀释至30.0ng/l。1.2正交方案要领选用L2556正交表见表1。共方案25个处置惩罚，反响总体积为25l，每个反响体系均含10PRBuffer含20l/Lg2+2.5l，别的组分TaqDNA聚合酶、dNTPs北京鼎国生物技能有限责任公司提供；引物北京奥科生物技能有限责任公司提供；DNA按表1稀释并添加，再用ddH2将体系补至25.0l。表1RAPD反响体系的正交方案及扩增结果略1.3PR扩增与产物检测在FTH-04AB-102型PR仪杭州大和热磁电子上举行扩增，热循环参数为95预变性3in，94变性1in，45退火1in，72延伸2in，35个循

4、环，末了72延伸10in，4保存。扩增产物在1.0(V)琼脂糖凝胶中电泳，以DNAErI+Hind北京鼎国生物技能有限责任公司提供为arker，经EB染色。在hnageasterVDS凝胶成像体系上成像检测，照相并存盘。1.4数据阐发统计每个处置惩罚扩增后DNA片断数量，并参照arker电泳片断的亮度对处置惩罚所得片断亮度举行打分，打分尺度为：片断亮度大于即是21228bp片断，分值为5分；片断亮度介于51463530bp片断之间，分值为4分；片断亮度介于20271904bp片断之间，分值为3分；片断亮度介于15841375bp片断之间，分值为2分；片断亮度低于1375bp片断，分值为1分。均

5、匀片断亮度某处置惩罚片断亮度得分总和/某处置惩罚片断总数。对所得片断数量及亮度两个结果别离举行方差阐发及SSR法各因素程度间多重比力，得到较好的反响体系。1.5最正确反响体系的验证为验证最正确反响体系的不变性，接纳多个引物对多个茴香质料举行RAPD扩增，不雅察其重复性及不变性。2结果2.1正交方案的处置惩罚结果及阐发选用引物P41GTTTGT按表1方案对内蒙古茴香举行RAPD扩增见图1，表1。别离对表1扩增片断数量及扩增片断亮度举行方差阐发。结果见表3。图1反响体系的正交方案扩增结果略表2扩增片断数量方差阐发略表3扩增片断亮度方差阐发略图2最正确反响体系的验证略3讨论3.1正交方案方差阐发在R

6、APD反响体系构建中的应用应用正交方案构建最正确反响体系的研究已有较多报道24，但对付扩增结果举行量化阐发却鲜见报道。本文在接纳正交方案对茴香RAPD反响体系举行优化的底子上，对扩增结果举行方差阐发及SSR多重比力。研究结果表白，正交方案不但可以应用于RAPD反响体系的构建，同时应用数据阐发确定RAPD最正确反响体系具有现实应用代价。3.2关于最优程度组合与最正确处置惩罚的验证本实行接纳了SSR法对参试因素举行了多重比力，得到了最优程度组合。同时，按照正交方案表1创立了25个反响体系，扩增出25个实行结果，从中得到了最正确处置惩罚。经比力，本实行中最正确处置惩罚与最优程度组合碰巧雷同，故不再举

7、行进一步筛眩假设实行中最优程度组合与最正确处置惩罚结果差异，那么需方案实行对二者举行进一步的筛眩3.3RAPD各组分对扩增结果的影响从方差阐发结果可知，在RAPD扩增历程中，各实行因素对扩增结果无交互作用，而在到场研究的4个因素中，dNTPs及引物对实行结果表示极明显作用，Taq酶及模板DNA那么均作用不明显。说明在本实行方案的范畴之内，dNTPs及引物用量对实行结果影响较大，而Taq酶及模板DNA用量对实行结果影响较校别的，本实行利用的PRBuffer为含g2+20Buffer，故对影响RAPD扩增的另一紧张因素g2未加讨论。颠末研究，开端确定茴香的RAPD最正确反响体系为25.0l的反响体系中，含1Buffer2.5l，dNTPs3.0l，Taq酶1.0l，随机引物4.0l，模板DNA1.0l，ddH213.5l，可以应用于大量阐发。【参考文献】1宋元林，张君亭，陈永辉稀特蔬菜高效种植，第二版北京：中国农业出书社，2001：2502侯大斌，范理章，邓国涛,等正交方案在梨基因组RAPD优化体系中的应用J乐山师范