实验四-质粒DNA的提取与酶切

1、质粒DNA的提取与酶切实验四今天实验分2个部分：质粒DNA提取质粒的酶切（电泳检测下次进行）一、实验原理质粒质粒是存在于细菌体内的一类 独立于染色体的自主复制的遗传成分，在细胞内它们常以共价闭环的超螺旋形式存在。质粒 (plasmid)质粒是存在于细菌体内的一类 独立于染色体的自主复制的遗传成分，在细胞内它们常以共价闭环的超螺旋形式存在。 质粒已成为目前最常用的基因克隆的载体分子。有一些质粒能携带外源DNA，可以作为目的基因进入受体细胞的运载工具。2.目的基因 和质粒载体 的连接 3.将重组DNA分子导入受体细胞 4.选择5.目的基因表达 1.目的基因的获取 DNA片段（目的基因）与载体DNA

2、分子相连接，形成重组DNA选出含有所需要的重组体DNA分子的受体细胞目的基因在受体细胞中高效表达，合成产物（蛋白质)重组DNA技术的一般过程基因克隆示意图宿主基因组大肠杆菌+重组质粒质粒载体及其拷贝数质粒 复制子 拷贝数 pBR322 及其衍生质粒 pMB1 1520 pUC 系列质粒及其衍生质粒 突变的pMB1 500700 pACYC 及其衍生质粒 p15A10212pSC101 及其衍生质粒pSC101 5 ColE1ColE11520质粒DNA的一般特性 ：质粒是细菌内的共生型遗传因子，有相对独立性。它能在细菌中垂直遗传并赋予宿主细胞一些表型它是双链闭合环状DNA，分子量大小不等质粒的

3、三种构型：闭合环状DNA开环DNA如果两条链中有一条发生一处或多处断裂，分子因旋转而消除链的张力。线状DNA如果两条链均断开，即为 线状DNA。质粒DNA与宿主菌染色体DNA的区别：宿主菌染色体DNA通常比质粒DNA要大得多分离纯化质粒DNA 的三个主要步骤：培养细菌使质粒扩增（DNA的扩增与选择）细菌的收集与裂解 收集高速离心的方法质粒DNA的纯化 所有纯化方法都是利用了质粒DNA相对较小及共价闭合环状的性质。碱法抽提质粒的主要溶剂溶液：由葡萄糖、EDTA、TrisCl组成.葡萄糖的作用是增加溶液的粘度,减少抽提过程中的机械剪切作用,防止破坏质粒.EDTA 的作用是络合掉镁等二价金属离子,防

4、止DNA酶对质粒分子的降解作用。TrisCl能使溶菌液维持溶菌作用的最适PH范围溶液：SDS、NaOHSDS的作用是解聚核蛋白并与蛋白质分子结合使之变性； NaOH的作用是破坏氢键，使DNA分子变性。溶液：KAc、HAc溶液能中和溶液的碱性，使染色体DNA复性而发生缠绕并使质粒DNA复性。SDS碱裂解法制备质粒DNA的原理： 在有EDTA、溶菌酶及SDS存在的条件下，用碱处理细菌，可以使细菌的细胞壁破裂，释放出细胞内容物（染色体DNA、蛋白质和RNA等）。 强碱环境可以使细菌线性分子染色体DNA氢键断裂，双链解开变性，而质粒DNA的超螺旋共价闭合环状的双链并不完全分离再加入高浓度酸性盐在有高盐

5、存在的条件下：线性染色体DNA凝聚成不溶性沉淀物；变性的蛋白质与SDS和K+形成的复合物也形成沉淀；小分子的质粒DNA却呈天然构型，能溶解在buffer中 通过离心可以把线粒体DNA、不稳定的大分子RNA、蛋白质-SDS复合物等一起除去 如果要提高DNA的纯度，则可以用RNA酶消化除去RNA，并用酚抽提法除去残留的蛋白质。实验步骤：加1.5ml培养物于EP管，12000rpm30s（可重复一次） 去上清（除净），加入100l 溶液I，充分重悬加入200 l 溶液II，立即、轻柔振荡数次加入150 l 冰溶液III，震荡10s，冰浴35min，12000rpm10min裂解细菌、释放质粒DNA转

6、移上清到新EP管，加入等体积饱和酚（约450 l）振荡混匀，离心12000rpm10min转移上清到新EP管，加入等体积氯仿：异戊醇（共约450 l）振荡混匀，离心12000rpm5min除去杂质、纯化质粒DNA转移上清到新EP管加入2倍体积乙醇（约800 l）混匀，冰浴15min离心12000rpm15min弃上清， 100 l 70%乙醇洗沉淀，12000rpm2min弃上清，静置干燥，0.1TE 20 l 溶解DNA酶切鉴定（10 l） 保存（10 l）除去杂质、纯化质粒DNA常见问题：提取的DNA不纯，含有其它杂质（蛋白、多糖）变性不充分；关键过程反应时间过短；离心时间或速度不够。提取

7、的DNA成涂布状：操作过程中用力过猛，动作粗暴；操作系统有污染。混有染色体DNA：变性过程不完全试剂配置有问题。第二部分：酶切鉴定（双酶切）反应体系（20ml）试剂或样品用量（ml）BamH I1Hind III1Buffer2H2O6pUC119-U610共10ml，配好多份之后再分装酶切反应实验操作酶切反应液包含BamH I, Hind III, Buffer, H2O （已由准备实验的老师配好）每人一份，每份10l将酶切底物（质粒）与反应液混合充分混匀，瞬时离心37C，孵育1-3小时电泳检测（下次进行）基因工程诞生的技术突破 限制性内切酶（restriction enzymes）1970年H.O. Smith等分离出第一种限制性核酸内切酶。 Werner Arber 理论预见限制酶Daniel Nathans 用限制酶切得SV40 DNA片断Hamilton O. Smith 得到第一个限制酶1978年Nobel生理或医学奖限制性核酸内切酶 是一类能够识别双链DNA分子中的某种特定核苷酸序列（48bp），并由此处切割DNA双链的核酸内切酶来源：原核生物功能：自我保护细菌的限制和修饰系统（R/M体系） pUC119图谱重组质粒BamH IHind III双酶切电泳检测5-G G A T C C-33-C C T A C G-5B