工学第3章动植物细胞培养课件

1、生物制药基础化学化工学院陶洪文1第三章 动植物细胞培养制药技术2第一节 动物细胞培养制药技术概述动物细胞培养的特性动物细胞培养基的组成和制备细胞培养过程的检测动物细胞培养方法和操作方式动物细胞大规模培养技术的应用3一. 概 述 20世纪初，人们不知道神经纤维是由神经细胞的细胞质外突形成，还是由神经细胞周围的其他细胞融合而成。 1907年，美国生物学家哈里森(Harrison)从蝌蚪的脊索中分离出神经组织，把它放在青蛙的凝固的淋巴液中培养。蝌蚪的神经组织存活了好几周，并且从神经细胞中长出了神经纤维。 哈里森的实验解决了神经纤维的起源问题，开创了动物组织培养的先河。此后，动物组织培养不断改进并逐渐

2、发展成为动物细胞培养。1. 动物细胞培养的起源4动物细胞培养 就是从动物有机体中取出相关的组织，将它分散成单个细胞，然后，放在适宜的培养基中，让这些细胞生长和增殖.用培养的人细胞构建人造皮肤5动物胚胎或幼龄动物的组织、器官胰蛋白酶剪碎单个细胞培养液制成细胞悬浮液10代细胞部分细胞“癌变”，无限传代动物细胞培养不能最终培养成动物体50代细胞原代培养传代培养细胞贴壁剥离、分瓶细胞株细胞细胞系2.动物细胞培养过程：接触抑制遗传物质未改变遗传物质改变6动物细胞培养工艺流程7有关概念:原代培养： 从机体取出后立即培养的细胞为原代细胞。培养的第1代细胞与传10代以内的细胞称为原代细胞培养。传代培养：将原代

3、细胞从培养瓶中取出，配制成细胞悬浮液，分装到两个或两个以上的培养瓶中继续培养，称为传代培养。8细胞株：原代细胞一般传至10代左右细胞生长停滞，大部分细胞衰老死亡，少数细胞存活到4050代，这种传代细胞为细胞株。 细胞系：细胞株传代至50代后又出现细胞生长停滞状态，只有部分细胞由于遗传物质的改变，使其在培养条件下可以无限制传代，这种传代细胞为细胞系。 细胞株和细胞系的区别： 细胞系的遗传物质改变，具有癌细胞的特点，失去接触抑制，容易传代培养。9细胞贴壁：细胞悬液中的分散细胞贴附到培养瓶壁上。 要求培养瓶或培养皿的内表面光滑、无毒、易于贴附。 接触抑制：当贴壁细胞分裂生长到表面相互接触时，细胞会停

4、止运动，但不影响细胞分裂增殖。 密度抑制：细胞长满培养平板，达到一定密度后，细胞会停止分裂增殖。10动物细胞镜检形态高密度低密度悬浮型细胞11整体放大贴壁型细胞12二、动物细胞培养特性1.分裂期长12-48小时，细胞生长缓慢，易受微生物污染。2.细胞大，无细胞壁，机械强度低，环境影响大 动物细胞对周围环境十分敏感,渗透压、酸度、离子浓度、剪切力、微量元素等的变化都会影响其生长。动物细胞对培养基要求很高，需要 12种必需氨基酸、8种以上维生素、多种无机盐和微量元素、葡萄糖外，还需要多种细胞生长因子和贴壁因子.133. 培养需氧少，不耐强力通风和搅拌正常二倍体细胞的寿命是有限的，一般繁殖50代左右

5、，就逐渐死亡。4. 培养时有群体效应、锚地依赖性、接触抑制性和功能全能性5. 产物在胞外，成本高，但价格昂贵6. 与微生物有区别，培养时不可套用经验7. 原代培养一般50代及退化死亡14三、动物细胞培养基的组成与制备1)所有的与细胞接触的设备、器材和溶液都必须保持绝对无菌，避免污染； 2)必须有足够的营养保证，绝对不可有有害的物质，避免有害离子；3)保证有适量的氧气供应； 4)需随时清除细胞代谢中的有害产物； 5)有适于生存的外界环境，渗透压、离子浓度和酸度； 6)及时分种，保持合适的细胞密度。 1.动物细胞在体外培养所需条件 152.动物培养基的种类和组成 1）天然培养基：血浆凝块、血清、淋

6、巴液、胚胎浸液、羊水、腹水。 2）合成培养基：组成稳定可大量生产供应。成分为氨基酸（细胞合成蛋白质的原料）、维生素（维持细胞生命活动的低分子活性物质，形成酶的辅基或辅酶）、糖类（碳源）、无机盐（保持细胞的渗透压并参与代谢）、缓冲系统、矿物类、有机补充物、激素类、生长因子类。合成培养基中除了各种营养成分外，还需添加 5%-10%的小牛血清，才能使细胞很好地增殖.16添加小牛血清的作用：1、提供有利于细胞生长增殖所需的各种生长因子和激素；2、提供有利于细胞贴壁所需的贴附因子和伸展因子；3、提供可识别金属、激素、维生素和脂类的结合蛋白；4、提供细胞生长所必需的脂肪酸和微量元素。 17 3、无血清培养

7、基 无血清培养基在天然或合成培养基的基础上添加激素、生长因子、结合蛋白、贴附和伸展因子及其他元素。优点：增加确定性；性能更一致；供应充足、稳定；容易进行纯化和下游加工提高制品安全性和产量。18培养基的性质1.pH：哺乳类动物细胞生长需要合适的酸碱度，多为7.27.4,不超过6.87.6范围，同时pH值的测定也可以检查培养基的批间差异 2.渗透压：细胞必须生活在合适的渗透压环境中（690850kPa）；同时渗透压值的测定也可以检查培养基的批间差异3.温度：哺乳动物多为36.5 0.5 4.黏度：CMC和聚乙烯吡咯烷酮5.表面张力和泡沫19四、细胞培养过程的检测 （一）细胞生长的检测 细胞计数（血

8、小板计数器） 细胞常规检查（污染与否、pH） 生长情况、细胞形态、营养液、污染和细胞活性（死细胞着色 计数） 生物学检查和鉴定 支原体污染检查 20 细胞生长过程 每代贴附生长细胞的生长过程：游离期、贴壁期、潜伏期、对数生和长期停止期（平台期）。（1）游离期：细胞接种后在培养液中呈悬浮状态也称悬浮期。此时细胞质回缩，胞体呈圆球形。10分钟-4小时。（2）贴壁期：细胞附着于底物上，游离期 结束。细胞株平均在10分钟-4小时贴壁。 底物：胶原、玻璃、塑料、其它细胞等. 血清中有促使细胞贴壁的和纤粘素、胶原等糖蛋白，这些糖蛋白的促贴壁因子先吸附于底物上，悬浮细胞再与吸附有促贴壁因子的附着。21（3）

9、潜伏期：此时细胞有生长话动，而无细胞分裂。细胞株潜伏期一般为624小时。（4）对数生长期： 细胞数随时间变化成倍增长，活力最佳，最适合进行实验研究。（5）停止期（平台期）：细胞长满瓶壁后，细胞虽有活力但不再分裂。22培养物污染的预防细菌、真菌、病毒或细胞均可导致培养物污染。生物的组织材料、操作者自身、培养基、各种器皿、甚至环境均可引起污染。显著污染的标志是培养基PH值迅速改变、外形模糊、甚至出观漂浮的集落。常用抗生素：青霉素（200单位/mL）；卡那霉素（200ug/mL）。支原体污染的控制：抗生素处理；支原体血清处理；高热处理23防止交叉污染。从事体外细胞培养的工作者都必须遵循这样一个原则：

10、在任何时间，在一个工作区中决不能有一种以上的细胞系的细胞同时存在。一种细胞系的细胞所用的培养基、器皿、移液管等决不能为另一种细胞系的细胞所移用。一旦在同质的细胞群中出现不同形态的集落，则应怀疑是否发生了细胞污染，且用染色体组型及同功酶组型鉴定。24（二）细胞培养工艺控制1.温度控制：采用铅电阻温度计控制2.pH与溶解氧控制：碳酸氢盐缓冲溶液，另外可以通过通CO2,O2控制。3.葡萄糖和乳酸检测4.产物的收集和检测25五、动物细胞培养方法和操作方式根据不同的需要将离体培养的细胞分为三类：1、贴壁细胞 生长时必须要有给以贴附的支持物表面，细胞依靠自身分泌的或培养基中提供的贴附因子才能在该表面上生长

11、和繁殖，在培养过程中，随着培养条件的变化细胞形态也会发生改变。 262、悬浮细胞 生长不依赖支持物表面，在培养液中悬浮生长，如淋巴细胞等。 3、兼性贴壁细胞 根据生长条件的不同可贴壁也可悬浮生长，中国地鼠卵巢细胞。 271.细胞培养方法1)悬浮培养 优点：操作简单、培养条件均一、传质和传氧比较好，容易扩大培养规模，可借鉴细菌发酵的经验。缺点：体积小，较难采用灌流培养。常用反应器为搅拌和气升式2)贴壁培养 优点：适用的细胞种类多，较容易采用灌流培养，达到高密度细胞。缺点：操作比较复杂，需要合适的贴附材料和足够的面积，培养条件不易均一，传质和传氧较差。 283)固定化培养（1）吸附培养 细胞贴附于

12、支持物表面 （2）共价贴附 化学键结合（3）离子/共价交联（4）包埋和微囊培养，包埋或包裹在凝胶载体和微囊内的细胞可获得保护，避免了剪切力的损害；可以获得较高的细胞密度；通过控制微囊膜的孔径可使产品浓缩在微囊内有利于下游处理；可采用多种生物反应器进行大规模培养 292.细胞培养的操作方式1）分批式培养操作2）流加式培养操作3）半连续式培养操作4）连续式培养操作5）灌注式培养操作30六、动物细胞培养的应用1.用于生物制品的生产：如病毒疫苗、干扰素、单克隆抗体2.基因工程中受体细胞的培养：选用合适宿主、改变细胞的某些酶基因、改进控制培养条件使产物正确糖基化。3.组织工程研究:通过对细胞大量培养，并

13、用细胞直接作为一种治疗手段用于临床，或用细胞进一步加工构成一种组织，如皮肤、肝脏、胰腺等用于临床治疗。31第二节 植物细胞培养制药技术 植物细胞培养：指在离体条件下，将愈伤组织或其他易分散的的组织置于液体培养基中，进行振荡培养，得到分散成游离的悬浮细胞，通过传代培养使细胞增殖，从而获得大量的细胞群体的一种技术。一、概述32植物细胞培养流程 33二 、植物细胞培养的特性与营养 （一）植物细胞的特性 1.植物细胞的组成 植物细胞由细胞壁和原生质体组成，原生质体包括 细胞质、细胞核和液泡。 2.细胞后含物和生理活性物质 细胞中除含有生命物质原生质体外，还有许多非生命物质，细胞的代谢产物，一类是后含物

14、，储藏物质，分布于液泡内，生物碱、糖类、苷、盐类、有机酸、挥发油等，另一类是生理活性物质，对细胞内生化代谢和生理活动起着调节作用。 34 3.细胞的全能性: 即单一的离体细胞在一定的环境条件下能分化成不同细胞组织乃至整个植株的能力。 4.细胞分化：是指导致细胞形成不同结构，引起功能改变或潜在发育方式改变的过程。细胞分化也可以说是相同基因型的细胞所具有的各个不同的表现型。 它包括：时间上的分化：一个细胞在不同的发育阶段上可以有不同的形态结构和功能；空间上的分化：对于多细胞生物来讲，同一细胞后代，由于所处的环境不同而可以有相异的形态结构和功能。 5.脱分化：植株上已经分化的细胞或组织离体后在培养条

15、件下逐渐恢复到分生状态的过程。细胞脱分化的结果通常是形成愈伤组织（未分化的细胞团）。35植物细胞培养的特性 植物细胞重量的增加主要在对数期，次级代谢产物的累积主要在稳定期。与动物细胞培养类同，生长速率慢，为防止培养过程中染菌，需加抗生素；细胞大，细胞壁以纤维素为主要成分，表现为抗张力强度大，抗剪切力能力小。植物细胞常生长成各种大小的团块，增加了悬浮培养的难度等。细胞培养需氧，但培养时不需要很高的气液传质速率，而是要控制氧量，以保持较低的溶氧水平泡沫性质不同于发酵，气泡大，黏度也大，通常要采用化学或机械方法加以控制。产物在细胞内且产量低。36（二）植物细胞的营养成分及其培养基 培养基的成分由无机

16、盐类、碳源、维生素、植物生长激素、有机氮源、有机酸和一些复合物质组成。1. 无机盐 有大量元素和微量元素，30 毫克每升为界限，大量有氮、硫、磷、钾、镁、钙、氯、钠。微量有铁、锰、碘、钼、铜、锌。2、有机质 有机营养物质（提供C、H、O和N） 生理活性物质373、植物生长调节剂 植物激素是植物代谢过程中形成的生长调节物质，在极低浓度（小于 1 微摩尔）时即能调节植物的生育过程，并能从合成部位转运到作用部位而发挥作用。常见的植物激素有生长素、分裂素、赤霉素、脱落酸、乙烯。植物组织和细胞培养物的生长过程主要取决于生长素和分裂素的比例，比值高可刺激细胞分裂，比值低则刺激细胞生长。384.附加物：琼脂

17、、蔗糖、活性碳等，非必须，但对生长有利。5.成分未知的天然汁液,提供必要的微量营养成分、生理活性物质和生长激素物质。39选择培养基的原则：需要根据不同培养对象、培养目的及培养条件探索适宜培养基。 选择的培养基在培养过程使细胞总体积倍增时间1天左右为宜。 培养基的配制过程：母液配制、混合、稀释、pH调节、分装、包扎、灭菌。40（三）植物细胞的培养 植物细胞培养的基本步骤（1）植物材料的准备和清洗、消毒等 用于植物组织培养的外植体必须无菌。 常用表面灭菌试剂的特点是灭菌后易于除去或容易分解的试剂，根据所处理材料对灭菌试剂的敏感性选择适当的处理时间。常用灭菌试剂有次氯酸钙、次氯酸钠和氯化汞。 次氯酸

18、钙为工业漂白粉过滤后的饱和溶液，适用于草本植物和柔软组织的灭菌处理，时间为5-30分。 氯化汞灭菌效果好，但不易除去，时间不易过长，以免杀死植物细胞，当其用于休眠种子的灭菌剂最为理想，适用浓度为 0.1%，2-10 分钟，种子皮较厚时可延长至 20分以上。 41（2）准备培养基 培养基是指人工配制的含有营养 物质供培养物生长分化的介质。通常含无机营养物质(大量元素和微量元素)、碳源(1%-4%蔗糖)、生长调节剂以及有机附加物(维生素、甘氨酸)等几类物质组成。（3）接种 在无菌条件下操作，把材料放进培养基42（4）愈伤组织的培养和诱导愈伤组织：原指植物体的局部受到创伤刺激后，在 伤口表面新生的组

19、织。它由活的薄壁细胞组成。在离体培养条件下，外植体中的活细胞经诱导脱分化，恢复其潜在的全能性，转变为分生细胞，继而其衍生的细胞分化为薄壁组织而形成愈伤组织 愈伤组织类型：结构致密型：表面光滑有光泽，结构致密，多为淡黄色或白色，易于再生芽 结构松散型：多为白色，可以用于悬浮系建立43（5）诱导产生器官或体细胞胚 调节培养基营养组织营养成分组成，愈伤组织在传代培养若干代后，产生细胞团(器官原基),该细胞群能适应进一步的的悬浮培养，形成器官（先芽后根），从而建立稳定的悬浮培养植物细胞系（6）移栽4445三.植物细胞培养的类型与技术 根据所处状态的不同，分为悬浮培养与固定化植物细胞培养法。 悬浮培养法

20、 分批培养法半连续培养法连续培养法 固定化培养法 包埋技术吸附技术共价结合技术461.分批培养法 与微生物的分批培养类同。由于操作简单，从实验室到大型罐广泛应用。分批培养中，植物细胞的生长曲线一般呈S型，可明显观察出诱导期、对数生长期、减速期、静止期和衰亡期。但是与细菌和酵母菌的培养相比，即使是生长速率快的烟草细胞，分批培养时间（一个周期）也要6天以上，生长缓慢。主要采用气升式反应器，其培养过程用通气代替搅拌，细胞产量高。47 生物种类 (h-1) 平均世代时间 (h) 烟草 0.0320.044 421.717.3 番茄 0.0140.026 49.526.7 胡萝卜 0.021 33.0

21、酿酒酵母 0.50.65 1.391.07 红曲霉 0.125 5.54 植物与微生物细胞生长速率的比较48 目前，无论在实验室还是在工厂中，大至20吨罐，广泛采用分批式操作。 藤田开发的二步培养法是分批培养法的一种变形，同时使用两个反应器，第一个反应器主要是为大量培养细胞，即使用生长培养基使细胞大量增殖，达到了一定的细胞密度。第二个反应器是为增加目的产物的含量。改用适合细胞产物积累的培养基，促进细胞启动，次级代谢途径并提高产物的产量。 分批培养中，在一定范围内增加底物浓度，可增加目的产物的产量，但浓度过高又会造成接种细胞的死亡。492.半连续培养法 在反应器中投料和接种培养一段时间后，将部分

22、培养液和新鲜培养液进行交换的培养方法称之为半连续培养法。反应过程通常以一定时间间隔进行数次反复操作以达到培养细胞与生产有用物质的目的。 503.连续培养法 采用连续培养反应器，在投料和接种培养一段时间后，以一定速度连续采集细胞与培养液，并以同样速度供给新鲜培养基，此种培养方式可使细胞生长环境长期维持恒定。连续培养法细胞生产能力一般较分批法高，但因细胞生长缓慢，培养时间长，要维持系统无菌状态，技术条件要求相当苛刻。514.固定化培养法 固定化培养采用固定化反应器，这类反应器有网状多孔板、尼龙网套及中空纤维膜等形式。将细胞固定在尼龙网套内或固定于中空纤维膜反应器的膜表面，或固定于网状多孔板上，放在

23、培养液中进行培养，可通入净化空气代替搅拌。固定化培养法的优点在于细胞位置固定，易于获得高密度细胞群体及建立细胞间物理学和化学联系，维持细胞间物理化学梯度，易于控制培养条件及获得次生产物。 52常用固化剂有琼脂、明胶、藻酸盐、羟乙基纤维素。 培养温度为 25左右，常需光照。由于植物组织在培养基上生长时要不断消耗养分、散失水分和累积代谢产物，因此外植体在培养周左右必须移至新鲜培养基上，以保持继续生长。移换一次培养基成为一次继代培养，经过一定次数的继代培养，其培养物可用于悬浮培养。53优点：简便易行、所占空间小缺点：是外植体或愈伤组织仅有一部分与培养基接触，培养基中产生浓度差，愈伤组织生长不平衡；外

24、植体基部插入培养基中，该处气体交换不畅阻碍了组织呼吸正常进行，会堆积生长过程中的有害物质；在愈伤组织细胞间出现极化现象，细胞群体不均一。54四、影响植物次级代谢物累积的因素1、组织来源：外植体、季节、休眠、分化等；2、化学培养条件：无机盐、碳源、物质生长调节剂、维生素、氨基酸、核酸、抗生素、天然物质和前体等；3、物理条件：温度、光（光照时间、光强、光质）、通气（氧气）、pH和渗透压551.组织来源外植体直接影响所诱导的组织和细胞的生长，而且也关系到其次级代谢产物的生产能力。外植体的前处理也可严重影响次级代谢产物的累积方式。一定培养条件下不同植物细胞及同一植株不同部位细胞生长速度不同，次生物产率

25、也不同，应选择生长速度快及次生物产率高的细胞为培养材料。562.化学培养条件1）培养基的组成，基本培养基的各种成分是愈伤组织和悬浮细胞培养的物质基础。碳源：自养培养的二氧化碳和异养培养的糖类，性质和数量往往对培养细胞的生物量有很大的影响。糖的作用有：延长稳定期；通过蔗糖分解后的产物（葡萄糖）所产生的对内源性生长素合成的抑制作用；增强戊糖磷酸化途径有关酶的活性磷：低磷会导致次级代谢产物的累积，缺乏磷会导致生物量的大幅度降低。57氮：硝酸盐、铵盐、有机氮源。如天冬氨酸、尿素、酪蛋白水解物或蛋白胨铜：作为邻及对-二酚可抗坏血酸氧化酶活性基团的作用，是次级代谢产物累积的必要元素，还可作为非生物诱导子。

26、生长调节物质：其种类和数量对培养细胞的生长、分化和次生代谢产物的产量有很大影响。(2) 诱导子: 植物抗毒素是在植物防御系统内能对抗微生物进攻的某些次级代谢产物，有些时候连续合成，或仅在被诱导下其产量才能增加。触发形成植物抗毒素信号的物质称为诱导子，能够诱导植物细胞中的一个反应，并能形成特征性自身防御反应的分子。583.物理培养条件的影响（1）温度：温度对植物细胞培养有一定影响。如烟草NC2512细胞分别于20，25及30培养时，发现20及25时细胞生长速度均良好，但25时尼古丁产率更高；甘薯悬浮细胞培养物从30和32向25转移后，对培养基中蔗糖及氨利用率下降，细胞生长速度减慢。次级代谢产物的

27、最佳产生温度是 20-28 ，低温时细胞不再生长，产物不合成。59(2)光的影响：光照时间的长短、光质、光强对次级代谢产物的累积有不同影响。如在连续红光或远红光作用下，玫瑰细胞培养物形成的挥发油成分与连续黑暗培养者相似；而用蓝光或白色荧光照射15h或24h所形成的成分相似，但不同于暗培养者。有时光照对某些次生物质的合成亦有抑制作用，如烟草NC2512细胞培养物连续暗处理，其尼古丁含量高于连续光照处理；有些植物细胞次生物产率不受光照影响，如橙叶鸡血藤细胞培养物的蒽醌产率不受光照影响。植物细胞培养过程，光照影响是复杂的，故需根据不同培养对象，采取不同光处理措施。60（3）通气 细胞生长过程需维持其

28、正常呼吸作用，悬浮细胞及固定化细胞培养时供氧方式有不同，前者可采用搅拌和通气方式，后者仅能采用通气方式，搅拌转速通常为rmin，过快则易破坏细胞；通气过程，一般用含的洁净空气为佳，通气量适当，供氧量过多或过少均影响细胞生长及次生物产量。 （4）酸度： 一般植物细胞培养基pH5一6为宜，如甘薯细胞培养时，维持其pH为6.3，次生物产量较不控制pH高一倍，当pH降至4.时，其色氨酸积累完全抑制。61（5）培养容器的影响：因为容器的大小和搅拌装置的不同会产生不同的次级代谢产物。搅拌速度也有影响，表现在发酵液中的溶氧浓度和机械搅拌对细胞所产生的剪切力上。 62（五）植物细胞培养的应用1 利用植物细胞培

29、养进行药物生产 太平洋紫杉细胞生产抗癌药物紫杉醇、人参细胞培养人参皂苷和人参多糖、毛地黄细养转化毛地黄毒苷典型案例：紫杉醇生产63 紫杉醇(Paclitaxel)是继阿霉素和铂类抗癌药之后本世纪后期最受人们重视的一种抗癌新药，是一新发现的有丝分裂抑制剂，其作用机理在于阻止微管正常生理聚集，抑制癌细胞的有丝分裂和纺锤体的形成，从而使癌细胞的复制受到阻断而凋亡。 1967年美国化学家Wall和Wani等首先从太平洋紫 杉（短叶红豆杉，Taxus. brevifolia）树皮中提取出来。该药于1990年进入期临床试验， 1992年底获美国FDA批准上市。 64 紫杉醇存在于红豆杉属植物的树皮、叶及茎中， 其中树皮中的含量最高，大约从12000株成年紫杉树中才能提取1KG的紫杉醇，而且紫杉的生长周期很长，在世界分布很少。 紫杉醇的国际市场价格为450美元/g 65 日本有关组织从红豆杉中诱导产生愈伤组织，筛选得到细胞培养4周就增殖了5倍，紫杉醇