Chemicell的Magnetofection(磁性转染)产品使用说明

1、磁性转染(Magnetofection)新颖的基因转染技术目录技术1.1介绍MagnetofectionTM试剂核酸剂量反应和转染动力学1.4.应用MagnetofectionTM的配套用品MagnetoFACTOR磁板供应的试剂盒3.1试剂盒组成联系方式实验步骤注意事项4.2常规实验步骤4.3在6孑L、12孑L、24孔或96孔板及T-75培养瓶中使用Magnetofectiori的方法PolyMAGCombiMAGCombiMAG-与Fugene(Roche)共同使用的实验步骤举例CombiMAG-与其他阳离子脂质转染试剂共用的实验步骤举例MagnetofectionTM-悬浮细胞Magne

2、tofectionTM-siRNAsiRNA-PolyMAG的实验步骤siRNA-CombiMAG的实验步骤MagnetofectionTM-病毒-CombiMAG的实验步骤高通量实验优化MagnetofectionTM-96孔板模式优化方法问题解决参考文献技术1.1.介绍磁性转染(MagnetofectionTM)是一种新颖、简单且高效的转染培养细胞的方法。它利用磁力将与磁性颗粒结合的基因载体吸向，甚至可能吸入靶细胞。这样所有加入的载体在几分钟之内即在细胞表面富集，使得100%的细胞与显著剂量的载体接触。这具有以下重要效果：.与标准转染方法相比，极大的提高了基于被转染细胞百分比的转染率.与标

3、准转染方法相比，短时间孵育即可获得提高达几千倍的转基因表达.使用极低剂量的载体即可获得高转染率和高转基因表达水平，节省昂贵的转染试剂.极短的处理时间。细胞与基因载体孵育几分钟即足以得到高转染率，而标准方法需几小时。DNAComplex时旳n自卅3帕11口NanoportiaiasMagreloFACTORPIei帕MagnetofectionTM试剂作为Magnetofection的生产商，Chemicell提供2种即用型Magnetofectiori试剂。PolyMAG是一种用于高效递送核酸的通用磁性颗粒制剂。它与欲转染的核酸在一个步骤中混合，成功转染了质粒DNA、反义寡核苷酸和siRNAs

4、。CombiMAG是为了与市售的如多聚阳离子脂质等任何转染试剂结合使用而设计的磁性颗粒制剂。它可与质粒DNA、反义寡核苷酸、siRNAs或病毒结合。它允许您根据您最喜欢的转染试剂制备您自己的磁性基因载体。购买须知MagnetofectionTM试剂及其所有组分仅为科研用途研发、设计和销售。不应用于人类疾病诊断或作为任何药物。MagnetofectionTM为注册商标1.3.核酸剂量反应和转染动力学蓮JeeJa扯paramagneticvehicleplusmagneticfedparamagneticvehiclenomagneticfedstandardgenetransfer（左图注释）转

5、染动力学：NIH3T3细胞与GenePorterTM（GeneTherapySystems）土CombiMAG孵育，在上表所示的时间段中放置于MagnetoFACTOR磁板上或不放置于MagnetoFACTOR磁板上。24小时后分析荧光素酶的表达。（中间注释）1顺磁载体加磁场顺磁载体无磁场标准基因转移（右图注释）用LipofectamineTM（Invitrogen）土CombiMAG转染NIH3T3细胞，在MagnetoFACTOR磁板上放置或不放置于磁板上15分钟的剂量反应曲线。24小时后分析荧光素酶的表达。1.4.应用MagetofectionTM通常适用于贴壁细胞，并已在下列各种永生细

6、胞系和原代细胞中试用。如果某种细胞类型或细胞株未列出，并不表明MagnetfectionTM不适用。另外在列出的细胞类型中，尚未用某种MagnetofectionTM试剂检测的，用“n.d.”（未确定）标示。CombiMAG试剂可以与任何多聚阳离子脂质转染试剂共同使用，也可与腺病毒和反录病毒载体一起使用。某些情况下，脚注中注明了目前为止经测试极其成功的与市售试剂共用的例子。核酸/病毒类型PolyMAGCombiMAG质粒DNAVV反义寡核苷酸VVsiRNAVV腺病毒n.d.V反录病毒n.d.V人原代脐带静脉内皮细胞放置在MagnetoFACTOR磁板上，与Cy3荧光标记的反义寡核苷酸孵育15分

7、钟，使用EffecteneTM（Qiagen；左图），或EffecteneTM+CombiMAG（右图）转染。数据由F.Kroetz.Ludwig-MaximiliansUniversityMunichti提供）贴壁细胞细胞系细胞类型来源PolyMAGCombiMAG*参考文献编号HeLa宫颈癌人+9.030,9.024,9.072,9.012,9.111,9.003,9.005,9016HEK293肾脏人+9.013,9.064,9054BHK肾脏仓鼠n.d.+CHO卵巢仓鼠+9.036,9.002,9.005,9006NIH3T3成纤维细胞小鼠+9.003,9.072,9.091,9.00

8、2,9.005,900416HB140气管上皮人+n.d.9.010,EJ28膀胱癌人+n.d.-HBL-100乳腺人n.d.+MCF7乳腺癌人+9.014,9.040,9.041,9115MCS7乳腺癌人+n.d.HCT116结肠腺癌人n.d.+U373星形细胞瘤人n.d.+9.056,U87胶质母细胞瘤人n.d.+9.056,U251胶质母细胞瘤人n.d.+9.056,T98G胶质母细胞瘤人n.d.+9.056,YK6-1胶质母细胞瘤人n.d.+9.056,YH-13胶质母细胞瘤人n.d.+9.056,A549肺泡基底表皮人+9.075,9.101,A172胶质母细胞瘤人n.d.+9.05

9、6,9.074,LN229胶质母细胞瘤人+9.074,LN18胶质母细胞瘤人+9.074,SW480结肠腺癌人n.d.+-LoVo结肠腺癌人n.d.+-HCT15结肠腺癌人n.d.+-CEMx174T/B-淋巴细胞杂交细胞人n.d.+9.060,CHO卵巢人+1A431表皮样癌人n.d.+-HT-1080纤维肉瘤人+n.d.-HFF包皮成纤维细胞人+-HepG2肝细胞癌人+9.012,9.048,HaCat角质细胞人n.d.+-293T肾脏人+9.030,293T-17肾脏人n.d.+9.030,SK-MES-1肺癌人+n.d.-MRC5胚胎肺人+-MeWo黑色素瘤人n.d.+NYGM脑胶质瘤

10、人n.d.+9.056,SK-MEL-28黑色素瘤人n.d.+-MEP哺乳动物上皮人n.d.+9.047,MOLT-4急性淋巴母细胞白血病人n.d.+9.044,SHSY-5Y神经母细胞瘤人n.d.+9.111,9.050,SV40转化成纤维细胞人+n.d.9.027.A549非小细胞肺癌人n.d.+9.057,9.101SaOS-2骨肉瘤人n.d.+BTK-143骨肉瘤人n.d.+-SaOS-2骨肉瘤人n.d.+-BEAS-2B肺上皮细胞人+n.d.9.012181RDB胰腺人n.d.+-HN12头颈癌人n.d.+9.028PC-3前列腺癌人n.d.+-H9幼成淋巴细胞人n.d.+9.077

11、H295R肾上腺皮质癌人n.d.+COCOoo055J98HOS骨肉瘤人n.d.+9.077HSG唾液腺，颌下腺人n.d.+-He99肺癌人+9.100HMEC-1微血管内皮人+n.d.9.038,9.092NCI-H441肺腺癌上皮人+9.073NCI-H292粘液表皮样癌人+n.d.o-Loo丄96055NCI-H82小细胞肺癌人+n.d.-SK-N-BE2神经母细胞瘤人+n.d.9.031MDAMB231乳腺癌人+n.d.9.035ECV-304膀胱癌人n.d+-11.5dpcXY性腺外植体小鼠n.d+9.109Cal27口腔腺鳞癌小鼠n.d+9.028CT-26结肠癌小鼠+n.d.9.

12、003,9.005C127鼠类乳腺癌小鼠n.d+9.042F9胚胎性癌小鼠+n.d.-L929结缔组织成纤维细胞小鼠+n.d.9.016MEF成纤维细胞小鼠+n.d.9.039,9.098HT-22海马神经细胞小鼠n.d+-mIEnd肠系膜淋巴结小鼠n.d+9.085mlC-(cl2)小肠小鼠n.d+-B16F10黑色素瘤小鼠+n.d.9.076,9.005N2a神经母细胞瘤小鼠+n.d.9.063,9.086NS20Y神经母细胞瘤小鼠n.d+-bTC-tetB-细胞系小鼠+9.020Hepa1c1c7鼠类肝癌小鼠+n.d.9.084SVEC鼠类细胞系小鼠n.d+9.028OP9骨髓源基质小鼠

13、n.d+9.047SM10营养细胞小鼠n.d+-STC-1肠内分泌细胞小鼠+9.033A7r5主动脉平滑肌大鼠n.d+9.094PC12肾上腺嗜铬细胞瘤大鼠+n.d.-PC6-3PC12的女儿细胞系大鼠+n.d.-C6神经胶质瘤大鼠n.d+-H4IIE肝癌大鼠n.d.+9.062L6骨骼肌细胞大鼠+n.d.-RIE1-a5小肠大鼠+n.d.9.088HNSCC头颈癌大鼠n.d.+9.015,9.028,9051RV静脉大鼠+n.d.COS-7肾脏猴+9.030CV-1肾脏猴+n.d.-COS-1肾脏猴n.d.+Vero肾脏猴n.d.+099DOO亠44D65B11抗紫外线卵巢仓鼠n.d.+9.

14、028V79肺成纤维细胞仓鼠+n.d.-PT-11肾脏牛n.d.+-MDCK肾脏犬+n.d.9.067CRFK肾脏猫n.d.+-VSa13骨（类软骨细胞）鱼+n.d.AM-C6SC8肾脏猪n.d.+-成纤维细胞非洲爪蟾+n.d.-EMC间质细胞（心外膜）n.d.+-悬浮细胞细胞系细胞类型来源PolyMAGCombiMAG*参考文献编号THP-1急性髓细胞样白血病人n.d.+-Jurkat急性T-细胞淋巴癌人n.d.+9.044,9.073BL-41B-细胞淋巴癌人+n.d.-K562慢性髓细胞样淋巴癌人n.d.+9.002P815肥大细胞瘤小鼠n.d.+-U937组织细胞性淋巴瘤人+-原代细胞

15、细胞类型来源PolyMAGCombiMAG*参考文献编号内皮细胞（脐带血）人+n.d.9.054主动脉内皮细胞人+n.d.9.028,9.032上皮（HUVEC）人+9.029,9.034,9.092,9113,9.114,9.003,9.007,9.008,9.021,9.029,9.034,9.005,9.004成纤维细胞人+-二倍体成纤维细胞人+-胃腺人+-贴壁胃细胞人n.d.+9.069胃肌成纤维细胞人+n.d.9.043神经胶质瘤人+n.d.-角化细胞人n.d.+9.005前列腺癌细胞（LNCaP）人n.d.+-淋巴细胞人+9.005,9.102哺乳动物上皮细胞人n.d.+-鼻腔上皮

16、细胞人+9.005胰腺癌人+n.d.-外周血淋巴细胞人+9.005,9.102基质细胞（子宫内膜）人n.d.+-T细胞人+9.102,9.089软骨细胞人+9.107,9.022,9.024滋养层细胞人n.d.+-成纤维细胞（MEF）小鼠n.d.+9.018,9.053神经元小鼠+9.071迷走传入神经兀小鼠n.d.+9.071贴壁胃细胞小鼠n.d.+9.061外周血淋巴细胞小鼠n.d.+-成肌细胞小鼠n.d.+9.053T细胞小鼠+n.d.-海马神经元大鼠+9.017,9.070,9.050,9.052,9.093,9.090,9.105,9.10主动脉平滑肌细胞大鼠n.d.+9.094心肌

17、细胞大鼠n.d.+9.055肝细胞大鼠n.d.+上皮细胞（HUVEC）大鼠+9.028,9.054皮层神经元大鼠n.d.+9.052,9.063,9.097主动脉内皮细胞牛+n.d.-颈动脉平滑肌细胞牛+n.d.嗜铬细胞牛n.d.+-晶状体牛+n.d.-气管上皮细胞猪n.d.+-软骨细胞猪+-纤维软骨细胞猪+-pSM，平滑肌猪n.d.+-*对应于CombiMAG与不同的市售转染试剂，如FuGENETM(Roche)，LipofectamineTM，METAFECTENE(BiontexGmbH)和DMRIE-CTM(Invitrogen)；腺病毒；EffecteneTM(Qiagen)共同使用

18、成功转染的。n.d.=notdetermined(未确定)MagnetofectionTM的配套用品21.MagnetoFACTOR磁板除了选用合适的磁性纳米颗粒，MagnetofectionTM需要适当的磁场。专门为MagnetofectionTM设计的MagnetoFACTOR磁板提供这样的磁场。特殊设计的MagnetoFACTOR-96磁板不仅在96孔板的每个孔下产生强磁场，而且同样适用于其他培养板，如T-75培养瓶，6孔和12孔板。对于较大的板，根据磁力线的几何形状，MagnetoFACTOR磁板会形成高密度和低密度转染细胞分布的区域。MagnetoFACTOR-24磁板是专门为24孔

19、板设计的。MagnetoFACTOR磁板与大多数厂家生产的有孔板兼容。MagnetoFACTOR-96磁板MagnetoFACTOR-24磁板特价作为新客户，购买MagnetoFACTOR磁板,赠送足够转染200ugDNA的PolyMAG和CombiMAG各一管。足够做3000次转染实验（96孔板形式）以优化使用MagnetofectionTM的转染实验。供应的试剂盒试剂盒组成货号品名规格促够转染npgDNA）转染数目（96孔板形式）价格EUR/USD9001PolyMAG-100100100095/1259002PolyMAG-5005005000365/4809003PolyMAG-100

20、0100010000665/8759004CombiMAG-10010050050/659005CombiMAG-5005002500180/2359006CombiMAG-100010005000350/4609007MagnetoFACTOR-96磁板-350/4609009MagnetoFACTOR-24磁板-350/4609008特价:MagnetoFACTOR磁板PolyMAG-200CombiMAG-20020020020001000350/460保存：MagnetofectionTM试剂盒的所有组分在打开前应在室温（20-25oC）下保存。第一次使用后在4oC保存。不要冻存磁性纳

21、米颗粒不要在磁性纳米颗粒储存液中加入任何物质运输条件：室温联系方式chemicellGmbHEresburgstrasse22-2312103BerlinGermany HYPERLINK mailto:info infoTel.:+49-30-2141481Fax.:+49-30-21913737e-mail: HYPERLINK mailto:info infoInternet: HYPERLINK 实验步骤注意事项以下例举的实验步骤在多个细胞系中成功使用。请注意最佳实验条件根据细胞系不同而不同因此，DNA或RNA的使用量及各个成分之间的比例可能需要调整，以得到最佳效果。以下建议可作为用最

22、短的孵育时间获得好的转染效果的指导。4.2.常规实验步骤接种贴壁细胞，在铺满60-80%时进行磁性转染。使用4.6.节的实验步骤转染悬浮细胞。如有必要可以在更换新鲜培养基（可以不含血清）后，立即进行转染。建议的转染时贴壁细胞和悬浮细胞数目见下表。建议的DNA量，PolyMAG体积和转染体积。组织培养皿每孔细胞数DNA量（闪）PolyMAG或CombiMAG(pL)转染体积*96-孔0.5-2x1。40.1-0.50.1-0.5200|dL2牛孔0.5-1x1050.5-20.5-2500|dLwell12-孔1-2x1052-42-41mL6-孔1-4x1052-62-62mL60mm培养皿5

23、-10 x1056-86-85mL90-100mm培养皿1-2x1068-128-1210mL75培养瓶2-5x10615-2515-2515-20mL*总转染体积=培养基+PolyMAG或CombiMAG复合物转染后48小时之后使用下列实验步骤（4.4，4.5，4.5.1，4.5.2和4.6节）可以形成稳定转导的细胞。将细胞转移到含有适当抗生素的新鲜培养基中进行筛选。重要的是至少等48小时再将转导的细胞置于选择性培养基中。用无血清无添加剂的培养基或生理盐水准备载体，因为血清可影响转染复合物的形成。由于将无血清和无添加剂的转染复合物加到已被完全培养基覆盖的细胞中，因此，加入转染复合物后导致如血

24、清、抗生素或配制标准培养基的其他添加剂被稀释。虽然对于大多数细胞类型，使用MagnetofectionTM转染后不必更换培养基，然而对于对血清/添加剂浓度敏感的细胞，可能有必要更换培养基。另一种做法是在MagnetofectionTM转染过程中将细胞置于无血清培养基中。这种情况下，MagnetofectionTM转染后必须更换培养基。4.3.在6孔、12孔、24孔或96孔板及T-75培养瓶中使用MagetofectionTM的方法原则上讲，每平方厘米培养皿面积使用50ng到300ngDNA就可得到好结果。然而，需要强调的是对于每一个细胞系都需要优化DNA的量及载体的配方。形成复合物的最简单的方

25、法是将需要量的磁性颗粒置于微量离心管中，加入用无血清培养基（如DMEM）稀释的需要量的DNA。孵育15分钟后，向细胞加入磁性颗粒/DNA复合物。将6孔培养板在MagnetoFACTOR磁板上放置10-20min,随后更换培养基（选做）。6孔培养皿：适用于6孔板形式的DNA量是每孔2ug到6ug，磁性颗粒/DNA的比例是1:1。在每孔1.8ml的细胞中加入200uL磁性颗粒/DNA复合物。12孔培养皿：适用于12孔形式的DNA量是每孔2ug到4ug，磁性颗粒/DNA的比是1:1。每孔0.8ml细胞加入200uL磁性颗粒/DNA复合物。24孔培养皿：适用于24孔形式的DNA量是每孔0.5ug到2u

26、g，磁性颗粒/DNA的比是1:1。每孔0.3ml细胞加入20Q_uL磁性颗粒/DNA复合物。96孔培养皿：适用于96孔形式的DNA量是每孔0.1ug到0.5ug，磁性颗粒/DNA的比是1:1。每孔0.15ml细胞加入50ul磁性颗粒/DNA复合物。T-75培养瓶：适用于T-75培养瓶形式的DNA量是15ug到25ug，磁性颗粒/DNA的比是1:1。每孔14ml（19ml）细胞加入1ml磁性颗粒/DNA复合物。PolyMAG根据第4.2.节表格内的建议，使用适当的组织培养皿和合适体积的培养基在转染前一天接种贴壁细胞，或恰在转染前接种悬浮细胞。实验步骤简单：每ugDNA使用1ulPolyMAG。将

27、需要量的PolyMAG（根据DNA量决定）加入微量离心管或96孔板的U-型孔内。如必需或你的实验步骤仅需要少于1ul的PolyMAG，用去离子水预先稀释PolyMAG。注意：取用前要剧烈震荡PolyMAG。用无血清无添加剂的培养基将需要量的DNA稀释到200ul（如DMEM）。将200uLDNA溶液加入PolyMAG，立即快速吹吸混匀。孵育15分钟后，将200uL复合物加入细胞中。注意：建议的每孔的总转染体积（培养基+PolyMAG复合物）见上表。将细胞培养板置于MagnetoFACTOR磁板上，在标准细胞培养条件下孵育10-20分钟。移走MagnetoFACTOR磁板。6a.可选择更换培养基

28、。评估转基因表达之前在标准条件下培养细胞。标准转染方法MagnetofectionTM用PolyMAG转染的长满的人原代角质细胞CombiMAG很多供应商出售高效的转染试剂。所有这些产品都可简单与CombiMAG混合进行磁性转染，通常这会极大提高这些试剂的效率。有两种方法使用CombiMAG：一种方法是根据生产厂家的说明准备标准的DNA和转染试剂的复合物，然后与CombiMAG混合。.第二种方法是先混合DNA和CombiMAG，然后再与转染试剂混合。在这种情况下，除了将DNA和CombiMAG的混合物而不仅仅是DNA加入转染试剂外，其他步骤与厂家的说明相同。根据转染试剂不同，不同成分混合的顺序

29、可能影响最终的转染效率。建议在初始实验中每ugDNA使用1uLCombiMAG。然而，根据转染的细胞系和所选用的市售转染试剂，最佳的成分组成可能高于或低于上述比例。注意：如果你的实验需要，预先用ddH2O稀释CombiMAG。（左图说明）GFP报告基因质粒与DMRIE-C（Invitrogen）结合转染CT-26大肠癌细胞15分钟（右图说明）GFP报告基因质粒与DMRIE-C（Invitrogen）+CombiMAG结合，在磁板上转染CT-26大肠癌细胞15分钟（数据由Ch.Plank.TechnicalUniversityMunich提供）CombiMAG-与Fugene（Roche）共同使

30、用的试验步骤举例转染前一天在24孔培养板内每孔接种0.5x105贴壁细胞，悬浮细胞在接种后立即转染。在97.6uL无血清无添加剂的培养基（如DMEM）中加入2.4uLFugene，剧烈振荡2秒钟。用无血清无添加剂的培养基（如DMEM）将0.8ugDNA稀释到100uL。吹吸混匀DNA溶液和Fugene稀释液，室温下孵育15分钟。将得到的200uLDNA复合物加入1.6uLCombiMAG，立即快谏吹吸混匀.取用CombiMAG前要振荡混匀。继续孵育15分钟后，将DNA/Fugene/CombiMAG复合物加入细胞。6.将细胞培养板置于MagnetoFACTOR磁板上，在标准细胞培养条件下孵育1

31、0-20分钟。移开磁板，在评估基因表达前，在标准条件下培养细胞。可以选择更换培养基。根据选用的市售转染试剂，此实验步骤可能需要改动。注意：如果你的实验需要，预先用ddH2O稀释CombiMAG。人角质细胞猪软骨细胞转染原代细胞VectorFugeneTM（Roche）+CombiMAG，放置在MagnetoFACTOR磁板上转染15分钟（数据由Ch.Plank.TechnicalUniversityMunich提供）452CombiMAG-与其他阳离子脂质转染试剂共用的实验步骤举例与使用Fugene的步骤相同。准备DNA复合物的步骤类似于生产厂家的说明。例如，在第一步中，使用3.2uLLipo

32、fectamine+96.8uL培养基或4.0uLGenePorter+96uL培养基而不是Fugene。其他实验步骤相同。但是，需要提醒使用者的是不同的混合顺序（首先混合DNA和CombiMAG，然后再与脂质混合）可能更好。类似地，也可用多聚阳离子试剂ExGen500或Superfect（Qiagen潜代脂质。MagnetofectionTM-悬浮细胞PolyMAG/DNA或CombiMAG/转染试剂的组成和制备与上述相同（第4.4和4.5节）。在PolyMAG/DNA或CombiMAG/转染试剂孵育形成复合物的同时，将欲转染的细胞用培养基（有或无血清-或添加剂；根据细胞类型和细胞对无血清条

33、件的敏感度决定）稀释到5x105-1x106/mL，用以下3种方法之一使细胞沉到培养皿的底部，以增加与磁性颗粒的接触。选择1：在聚赖氨酸包被的板上接种细胞，按适用于贴壁细胞的实验步骤操作。选择2：短暂离心细胞（2分钟）使其形成细胞团，然后按适用于贴壁细胞的实验步骤操作。选择3：将细胞悬浮液与CombiMAG混合，每mL细胞加3OuLCombiMAG。-孵育10-15分钟。将细胞放入置于磁板上的组织培养皿中（含细胞的培养基的体积依培养皿规格而定；参看第4.2.节表格中建议的转染体积）孵育15分钟将制备好的PolyMAG/DNA或CombiMAG/转染试剂加入细胞，这时细胞培养板依然放在Magne

34、toFACTOR磁板上。继续孵育15分钟。小心地将上清培养基从细胞中移除，加入新鲜的完全培养基，这时培养板仍旧置于MagnetoFACTOR磁板上。小心不要把由于磁力下沉的细胞吸走。将培养板从MagnetoFACTOR磁板上移开。在检测转基因表达之前培养细胞。MagnetofectionTM-siRNARNA干扰是一种降低组织和细胞中基因表达的非常有效的技术。这种沉默效果是研究基因功能的非常有用的工具，并且有希望成为一种新型治疗方法。双链短RNA（siRNA:小干扰RNA，shRNA:小发夹RNA和dsRNA:双链RNA）结合并降解它们特异性的mRNA靶标，因而选择性极强，并从而抑制蛋白质合成

35、。PolyMAG高效率的使双链siRNA进入多种类型的细胞中，使得低剂量siRNA即可造成极好的敲低效果。实验步骤极其简单。具体各种化合物的量和转染体积请参考下表。如6孔板上siRNA的终浓度为20nM,则加入2uLPolyMAG（转染体积2mL）siRNA（1uM储备液*）和PolyMAG/CombiMAG的稀释过程举例:培养容器96-孔24-孔12-孔6-孔稀释用无血清培养基100|dL100|dL100|dL200|jLngsiRNA/ngsiRNA/ngsiRNA/ngsiRNA/siRNA终浓度|dLPolyMAG|dLPolyMAG|dLPolyMAG|dLPolyMAGorCom

36、biMAGorCombiMAGorCombiMAGorCombiMAG2nM5.4/0.519.5/1.027/2.054/2.05nM19.5/0.539.75/1.067.5/2.0135/2.010nM27/0.567.5/1.0135/2.0270/2.020nM54/0.5135/1.0270/2.0540/2.050nM135/0.5337.5/1.0675/2.01350/2.075nM202.5/1.0506.25/2.01012.5/2.02025/2.0*siRNA的ng根据MW=13500g/mol计算471siRNA-PolyMAG实验步骤转染前一天或恰在转染前在适当的

37、组织培养皿内用建议的培养基体积接种细胞（参看第4.2节表格）。用无血清和无添加剂的培养基（如DMEM）将siRNA稀释到100uL（或200uL）（siRNA的稀释过程请参看表格）使用前振荡PolyMAG小管。如需要，仅用去离子水稀释PolyMAG。不要用血清或无添加剂的血清稀释PolyMAG。将适当体积/量的PolyMAG直接加入100uL（或200uL）稀释的siRNA溶液，立即快速吹吸4-5次混匀。室温下孵育形成的siRNA/PolyMAG复合物15分钟。一滴一滴将100uL（或200uL）二者的复合物加入细胞。注意:对于某些细胞，孵育的前3个小时用无血清条件可能得到更好的基因沉默效果。

38、然而，大多数试验中，siRNA在含血清的培养基中被成功送入细胞。将细胞培养板置于MagnetoFACTOR磁板上，在标准细胞培养条件下孵育10-20分钟。移开MagnetoFACTOR磁板。9.标准条件下培养细胞，直到检测基因沉默。根据siRNA的量、基因靶标和细胞类型，可在转染后24到96小时内监察试验。我们建议对于RNA敲低和蛋白质敲低分别监察48小时和96小时。注意：如果细胞对血清/添加剂浓度敏感，转染后8-24h可选择更换新鲜培养基。472或RNA-ombiMAG实验步骤例如：6孔板内siRNA的终浓度为20nM时使用2uLCombiMAG（转染体积2mL）1转染前一天或恰在转染前在适

39、当的组织培养皿内用建议的培养基体积接种细胞（参看第4.2节表格）。2制备siRNA/阳离子脂质试剂二者的复合物，方法与生产厂家的说明相似。终体积应为100uL（或200uL）无血清和无添加剂培养基（如DMEM）（siRNA稀释过程参看表格）。使用前振荡CombiMAG小管。如需要，仅用去离子水稀释CombiMAG。不要用血清或无添加剂的血清稀释CombiMAG。将适当体积/量的CombiMAG直接加入100uL（或200uL）siRNA/阳离子脂质试剂复合物，立即快速吹吸4-5次混匀。室温下孵育形成的siRNA/阳离子脂质试剂/CombiMAG复合物。将100uL（或200uL）三者的复合物逐

40、滴加入细胞。注意：对于某些细胞，孵育的前3个小时用无血清条件可能得到更好的基因沉默效果。然而，大多数试验中，siRNA在含血清的培养基中被成功送入细胞。将细胞培养板置于MagnetoFACTOR磁板上，在标准细胞培养条件下孵育10-20分钟。移开MagnetoFACTOR磁板。标准条件下培养细胞，直到检测基因沉默。根据siRNA的量、基因靶标和细胞类型，可在转染后24到96小时内监察试验。我们建议对于RNA敲低和蛋白质敲低实验分别监察48小时和96小时。注意：如果细胞对血清/添加剂浓度敏感，转染后8-24h可选择更换新鲜培养基。细胞培养条件：细胞60-80%铺满时转染效果最好。如需要，可以在8

41、-24小时后洗去含转染混合物的培养基，更换新鲜培养基。siRNA浓度：在10nM到50nM的浓度范围内，我们常观察到好的siRNA敲低效果。然而效率可能受到细胞系、靶标（半衰期，表达水平）和所用的siRNA的影响。因此，我们建议开始时先测试一系列不同的siRNA浓度，以便获得最佳实验条件。MagnetofectionTM标准转染未经处理的细胞siRNA的磁性转染。合成的eGFP的siRNA从MWGBiotech，Ebersberg,Germany购买。RNA与PEI包被的磁性颗粒及更多游离的线性PEI（25kDa，Polysciences，Warrington，PA，USA）在DMEM中混合。

42、孵育30分钟后，用含10%FCS的DMEM稀释51.2倍，使siRNA终浓度为65nM。将每份混合物（150ul）加入已经用编码eGFP的反转录病毒稳定转导的HT1080细胞（5000个细胞/孔，96孔培养板）中。在孵育过程的前15分钟，将培养板放置于磁板上。24h后更换新鲜培养基。上图显示的是转染后65h的细胞，证明eGFP表达被有效敲低。（数据由Ch.Plank.TechnicalUniversityMunich提供）MagnetofectionTM-病毒-CombiMAG实验步骤病毒感染高度依赖于细胞表面受体。例如，腺病毒感染依赖细胞表达CAR（柯萨奇和腺病毒受体），HIV感染依赖细胞表

43、达CD4。然而，很多在基础研究和基因治疗中重要而有意思的靶组织不允许病毒介导的基因传递（肿瘤组织和肺上皮顶面可能表达改变的、极少的或没有所需的受体）。.病毒载体和CombiMAG结合足以促使病毒感染非允许细胞，这点已通过腺病毒感染证实。.MagnetofectionTM也提高了反录病毒的感染能力。NIH3T3细胞（缺失柯萨奇病毒和腺病毒受体，CAR）被与CombiMAG混合的重组腺病毒（编码LacZ）转染，在培养板下不放置（左图）和放置磁板（右图）。实验步骤使用标准病毒介导的基因传递所要求的方式接种细胞。例如，细胞铺满程度对于腺病毒载体可以高，然而对于反录病毒载体必须要低，后者感染要求细胞分裂

44、。细胞必须在转染前一天接种。将适量CombiMAG（见下文例子）置于一个足够容纳第三步中要加入的病毒制剂的体积的管中。将病毒制剂（如反录病毒上清或用HBS、PBS或细胞培养基稀释的纯化的腺病毒）加入有CombiMAG的管中，立即吹吸混匀或轻微振荡。然后，在室温下孵育15分钟。病毒/CombiMAG的比例应根据病毒滴度和细胞类型决定。优化时，我们建议实验初始时用1.5uL,3uL,6uL和12uL的CombiMAG与固定量的病毒制剂/上清混合。将第3步制备的混合物加入细胞，做2或3个重复。将细胞培养板置于磁板上，在标准细胞培养条件下孵育10巳0分钟。移开MagnetoFACTOR磁板。可选择更换

45、新鲜培养基。&标准条件下培养细胞，直到检测基因表达。9.根据所用的病毒载体的类型，病毒的量和所用的细胞类型，此实验步骤可能必须修改。细胞类型病毒CombiMAGK562腺病毒（200MOI）6pL人PBL腺病毒(500MOI)3一6pLNIH-3T3腺病毒(200MOI)3一6pLNIH-3T3反录病毒(1-5x103XgalCFU/ml)3一6pL4.9.高通量筛选的优化PolyMAG或CombiMAG与DNA的比例可以通过试剂的体积加倍或增加多倍的方法改变。类似地，试剂可以预先用去离子水稀释，稀释后的溶液分成小份分别与DNA或如上所述的预先形成的DNA复合物孵育。最后，可以系列稀释配制的磁

46、性转染混合物到极低浓度。4.10.MagnetofectionTM-96孔形式的优化步骤我们建议优化转染条件以得到MagnetofectionTM的最佳结果。几个参数可以被优化：.PolyMAG/CombiMAG和核酸或病毒的比例.核酸的量.细胞密度.孵育时间对于贴壁细胞，转染前一天或至少几小时之前，用每孔总体积为150uL悬浮于培养基中的细胞接种96孔板。在4个管中，用无血清无添加剂的培养基（如DMEM）稀释7.2ugDNA。在96孔板的A1,A4,A7,A10孔中分别加入3.6uL,7.2uL,10.8uL和14.4uL的PolyMAG（转染DNA时）或CombiMAG试剂（使用DNA-转

47、染试剂复合物时）。将352.8uL第1步中准备的DNA溶液加入有PolyMAG的A1,A4,A7,A10孔中，并吹吸混匀。室温下孵育15分钟。（可选步骤）为欲转染的细胞更换培养基。移除接种细胞时用的培养基,加入150uL新鲜培养基（有或无血清或添加剂）。同时在96孔板的第1、4、7、10列的其他孔（B1-H1,B4-H4,B7-H7,B10-H10）中加入180uL无血清无添加剂的培养基（如DMEM）。第3步孵育后，从A1,A4,A7,A10中转移180uL溶液到B1,B4,B7,B10，吹吸混匀；从B1,B4,B7,B10中转移180uL到C1,C4,C7,C10中，吹吸混匀，如此继续直到H

48、1,H4,H7,H10。从第1,4,7,10列转移2次50uL到接种了欲转染细胞培养板的其他列中（第2/3列，5/6列,8/9列,11/12列）&将细胞培养板置于MagnetoFACTOR磁板上，在标准细胞培养条件下孵育10-20分钟。移开MagnetoFACTOR磁板。10.（可选步骤）更换新鲜培养基，特别是如果转染是在无血清培养基中做的。11.继续按需要培养细胞。OptimizationProtocolfor96-wellplateDNA(pg)7.23.6701.8350.9170.4580.2300.1140.0571234567891O1112AooooooooooooBoooooo

49、oooooocooooooooooooDooooooooooooEoooooooooooofooooooooooooGooooooooooooHoooooooooooo10.814.4A1,A4,A7,A10：3.67.2PolyMAG(|JL)4.11.问题解决低转染效率.缓冲液成分不当：为形成PolyMAG/DNA-或combiMAG/DNA复合物，必须使用无血清缓冲液或培养基，否则血清中的蛋白质将与PolyMAG或CombiMAG结合。PolyMAG/DNA-或CombiMAG/DNA复合物形成后就可以加入在含血清的培养基中培养的细胞了。PolyMAG或CombiMAG和核酸或病毒的比例

50、欠佳：使用96孔板优化步骤（第4.10节）决定PolyMAG或CombiMAG与DNA的最佳比例。正确使用MagnetoFACTOR磁板：使用MagnetoFACTOR磁板时使磁铁向上。向细胞中加入PolyMAG/DNA-或CombiMAG/DNA复合物后，将细胞培养板放置于MagnetoFACTOR磁板上。阳性对照：用一个定性清楚的报告基因（如绿色荧光蛋白，荧光素酶）做阳性对照转染实验。支原体污染：支原体污染改变转染效率。细胞状况：培养时间过长的细胞可能不易被转染。使用传代至少一次的解冻不久的细胞。细胞毒性.转染时细胞密度（铺满的百分比）欠佳：接种贴壁细胞使MagnetofectionTM转

51、染时细胞密度达到铺满60-80%。如果细胞密度太低，可能发现毒性提高。对于悬浮细胞，需要使细胞沉在孔的底部（第4.6节）。DNA量欠佳（第4.10节）：与Lipofection相比，使用MagnetofectionTM所需的DNA量大约少5倍。.转染分子的纯度：检查要递送的目的分子的纯度（属于内毒素的脂多糖将引起细胞死亡）。PolyMAG或CombiMAG的量：更高的PolyMAG或CombiMAG的量可能对细胞有毒性，且可进一步降低转染效率。.在MagnetoFACTOR磁板上孵育的时间：较长的与PolyMAG/DNA-或CombiMAG/DNA复合物孵育的时间（如4hr）,加上使用磁场可造

52、成毒性作用。.MagnetofectionTM转染后的孵育时间：减少复合物与细胞孵育的时间。可在转染后4hr用新鲜培养基替换转染培养基。参考文献：9.001PlankC.,SchererF.,SchillingerU.,AntonM.Magnetofection:Enhancementandlocalizationofgenedeliverywithmagneticparticlesunderinfluenceofamagneticfields.J.GeneMed.2000;2（5）Suppl.）:S24.9.002SchererF.,AntonM.,SchillingerU.,HenkeJ.

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