FUNDC1 and mitophagy全文英翻汉

1、在哺乳动物细胞中通过线粒体外膜蛋白FUNDC1介导缺氧诱导的线粒体自噬【摘要】越来越多的证据表明，功能失调的线粒体可以通过线粒体自噬被选择性地移除。线粒体自噬功能的失调与神经退行性疾病和代谢性疾病的发展方面是密切相关的。个别的线粒体是怎么被识别后清除的，并且这个过程是如何被调控的我们尚不清楚。我们在文章中所说的FUNDC1,是一种不可缺少的线粒体外膜蛋白，是一种由缺氧诱导的线粒体自噬受体。FUNDC1通过与典型的LC3结合基序Y（18）xxL（21）与LC3相互作用，LC3相互作用区的突变削弱了FUNDC1与LC3的相互作用以及随后的线粒体诱导。内源性FUNDC1的敲低显著阻止缺氧诱导的线粒体

2、，这可以被野生型FUNDC1的表达逆转，但不是LC3相互作用缺陷型FUNDC1突变体的逆转。机理/机制的研究进一步揭示了缺氧诱导FUNDC1脱磷酸化和增强其与LC3的选择性线粒体相互作用。因此，我们的研究结果提供了在哺乳动物细胞中的线粒体质量控制的深入了解。【目的、结果与方法】注：方法为实验操作与图结合【总目的】探究“自噬”选择性去除功能障碍的线粒体的机制【各论】一.线粒体外膜蛋白FUNDC1诱导线粒体自噬目的：1.1确定线粒体外膜蛋白的潜在功能探究线粒体外膜蛋白是否和如何导致线粒体自噬。方法：11（a）将HeLa细胞匀浆并分级分离，然后用Percoll梯度离心。通过用FUNDC1和不同细胞器

3、标记物例如线粒体蛋白（TIM23），内质网蛋白（钙联接蛋白）和高尔基蛋白（GM130）的western印迹分析梯度级分（b）将细胞固定,然后用FUNDC1抗体（绿色）免疫染色，并对线粒体蛋白细胞色素c（红色）进行复染色。比例尺，10口m。（c）用编码FUNDC1-Myc和Mito-dsRed的质粒转染GFP-LC3（绿色）稳定HeLa细胞24小时。然后将细胞固定，并用FUNDC1（紫色，抗Myc）免疫染色。比例尺，10“n。（d）用编码的质粒共转染HeLa细胞FUNDC1-Myc和GFP以4：1的比率或Myc和GFP对照载体。将FUNDC1-Myc阳性细胞和载体对照细胞（均为GFP阳性）分选并

4、用抗VDAC1抗体（10nm金颗粒）进行免疫金色电子显微镜检查。蓝色框（插图）表示VDAC1-阳性线粒体。绿色和红色框表示吞噬线粒体的自噬体。黑色箭头显示双膜自噬体。比例尺，500nm。d）用编码的质粒共转染HeLa细胞FUNDC1-Myc和GFP以4：1的比率或Myc和GFP对照载体。将FUNDC1-Myc阳性细胞和载体对照细胞（均为GFP阳性）分选并用抗VDAC1抗体（10nm金颗粒）进行免疫金色电子显微镜检查。蓝色框（插图）表示VDAC1-阳性线粒体。绿色和红色框表示吞噬线粒体的自噬体。黑色箭头显示双膜自噬体。比例尺，500nm（e）HeLa细胞用编码FUNDC1-Myc，GFP-LC3

5、的质粒转染24h，水稻dsRed和青色荧光蛋白LAMP1。收集代表性活细胞Z-Stack图像和三维重建示例。绿色和蓝色箭头表示线粒体碎片被LC3和LAMP1阳性自体溶酶体包围。比例尺，10口m.（f）用编码的质粒转染HeLa细胞，FUNDC1-Myc指示的时间和线粒体（TIM23，TOM20，VDAC1），内质网（钙联接蛋白）和高尔基标记（GM130）蛋白通过蛋白质印迹法检测。（g）HeLa细胞用编码FUNDC1-Myc的载体或质粒转染12小时，放入或不放入巴佛洛霉素A1（BFA）溶液中，然后是TIM23,TOM20或通过western印迹检测LC3。（h）Mito-Cherry稳定的HeLa

6、细胞用编码FUNDCl-Myc的质粒共转染24小时或48小时,（Fdcl）和GFP以4：1的比率或与Myc对照载体一起孵育48小时。通过共聚焦捕获每个样品的五个随机挑取的区域z轴，并扫描GFP阳性细胞的总面积和体积，进行线粒体计算和定量（平均值土s.e.m。；n=90个细胞来自三次独立实验）；*P0.01。未裁剪的图像印迹如附图所示。S6。结果：11异位表达的FUNDC1诱导绿色荧光蛋白（GFP）-LC3斑点的显著增加，与线粒体的片段化密切相关。12如图1d所示，在电子显微镜下用表达FUNDC1-Myc的质粒转染的细胞中，在双膜自噬小泡中，通过抗VDAC1的免疫胶体（10nm）可以清楚地观察到

7、被隔离的线粒体的积聚。自噬泡囊完全不存在空转染的细胞向量。三维成像研究表明，如图1e所示。片段化线粒体被封闭在GFP-LC3和LAMP1阳性自噬溶酶体中。有趣的是，FUNDC1诱导总线粒体蛋白由于巴佛洛霉素A1能够增强LC3-II的水平，FUNDC1可诱导自噬通量的增加（图1g）。如预期的，总的线粒体体积在FUNDC1表达后显著降低（图1h）。此外，FUNDC1能够诱导在MCF7细胞和新鲜分离自小鼠的小鼠胚胎成纤维细胞的线粒体自噬（补充图S2）。结论：FUNDC1是介导线粒体自噬，线粒体质量控制的重要机制。二作为含有LIR基序的蛋白质的FUNDC1是选择性线粒体的受体目的：21探究FUNDC1

8、对线粒体的自噬的作用22尝试了解分子机制其中FUNDC1介导有丝分裂2.3论证FUNDC1是否通过LIR与LC3相互作用方法：2.1共免疫沉淀检查：（a,b）将来自细菌（a）或HeLa细胞裂解物（b）的纯化的FUNDC1蛋白与固定的GST或GST-LC3B珠孵育，然后用FUNDC1抗体检测FUNDC1。使用考马斯染色观察GST和GST-LC3B蛋白。（c,d）用GFP或GFP-LC3B转染HeLa细胞。转染后24小时，收集细胞用于用抗GFP或抗FUNDC1的免疫沉淀（IP），并分别用FUNDC1或GFP抗体分析。IB，免疫印迹。（e）FUNDC1与LC3家族蛋白相互作用。将来自HeLa细胞的细

9、胞提取物与固定的GST或所示的GST融合蛋白一起孵育。免疫沉淀FUNDC1用FUNDC1抗体检测。使用PonceauS染色来显现GST和GST-融合蛋白。引发一系列突变，例如Y18A，L21A，Y18A/L21A双突变体和来自氨基的缺失突变体酸18至21，在宫颈癌细胞中过表达这些突变体。（f）典型的LIR序列与FUNDC1一起手工比对用于比较。阴影区域表示FUNDC1的推定LIR中的高度保守残基。（g）用编码FUNDC1-Myc的质粒或指定的突变体转染HeLa细胞。转染后24小时，裂解细胞与固定的GST-LC3B温育。通过用Myc抗体的western印迹检测共沉淀的蛋白质。使用PonceauS

10、染色来显现GST-融合蛋白。（h）在显示Y18evL21的LIR的线粒体外膜中的FUNDC1蛋白的示意图。2.3（i）用编码FUNDC1-Myc的质粒或指定的突变体（紫色，抗Myc）和GFP-LC3共转染FUNDC1-敲低的HeLa细胞24小时。与野生型FUNDC1相比，FUNDC1的LIR突变体具有削弱的诱导GFP-LC3点数目增加的能力。比例尺,10口m。（j）用ImageJ（平均值土s.e.m。；来自三次独立实验的n=90个细胞）定量用Myc载体或编码野生型或LIR-突变体FUNDC1的质粒转染的细胞中GFP-LC3点的数量。（k）Western印迹检测由Myc载体和野生型和LIR突变体

11、FUNDC1诱导的LC3-II的变化。印迹的未裁剪图像显示在补充图。S6。结果：2.1FUNDC1确实与LC3B（图2a-d）和其他LC3同源物进行了物理性的相互作用（图2e）。2.2自噬受体如p62和Atg32与LC3及其同源物，通过具有核心共有序列的典型的线性基序序列W/YxxL/I结合（图2f）；表明FUNDC1和LC3之间的相互作用是通过LIR区域（图2g）；表明FUNDC1是一个线粒体外膜蛋白，通过其在细胞溶胶暴露N端的LIR与LC3相互作用（图2h）2.3数据表明FUNDC1诱导的线粒体自噬高度依赖于它与LC3的相互作用三内源性FUNDC1在线粒体中的生物学意义目的：了解内源性FU

12、NDC1在线粒体中的生物学意义方法：.（a）FUNDC1-敲低HeLa细胞与Myc载体和编码FUNDC1-Myc，FUNDC1118-21，FUNDC1W32-33A（SEQIDNO：蓝色，抗Myc）和GFP-LC3孵育24小时。如图1的标题中所述进行实验。图像显示LIR结构域缺失突变体而不是W32-33A突变体不能诱导GFP-LC3点数目的增加，尽管它诱导线粒体片段化。比例尺，10口m。定量含有断裂线粒体的细胞数（平均值土标准误差n=来自三次独立实验的100个细胞）。（b）用Myc载体和编码FUNDC1-Myc和FUNDC1118-21的质粒共转染FUNDC1-敲低的HeLa细胞。24小时后

13、，处理细胞并通过电子显微镜分析（黑色箭头，自噬空泡）。比例尺，600nm（c）转染的对照细胞和ATG5敲低（ATG5KD）细胞中LC3和TIM23表达的Western印迹分析编码FUNDC1-Myc的质粒12和24小时。（d）使用共聚焦显微镜观察在用编码FUNDC1（红色，抗Myc）和GFP-LC3（绿色）的质粒转染的对照和ATG5敲低细胞中的自噬体的出现24小时。比例尺，10口m。定量自噬细胞的数量（平均值土s.e.m。；来自三次独立实验的n=100个细胞）。（e）对照细胞和BECN1敲低细胞中LC3和TIM23表达的Western印迹分析用编码FUNDC1-Myc的质粒转染12和24小时。

14、（f）共聚焦显微镜用于显示在用编码FUNDC1（红色，抗Myc）和GFP-LC3（绿色）的质粒转染的对照和BECN1敲低细胞中24小时的自噬体的出现。印迹的未裁剪图像显示在补充图。S6。结果：FUNDC1诱导线粒体依赖于ATG5，因为ATG5的敲低HeLa细胞完全阻断GFP-LC3斑点的形成LC3-I向LC3-II的转化和TIM23的减少，诱导的FUNDC1（图3c,d）。然而，BECN1的敲低不能预防FUNDC1诱导的mitophagy（图3e，f）。结论：数据表明FUNDC1通过相互作用介导选择性的线粒体LC3通过LIR与核心自噬机制耦合四.FUNDC1介导缺氧诱导的mitophagy目的

15、：4.1进一步明确FUNDC1在线粒体中的作用4.2进一步证明FUNDC1是缺氧诱导的mitophagy的特异性调节剂方法：4.1（a）将HeLa细胞暴露于缺氧条件指定的时间。TIM23，细胞色素c，钙联接蛋白和LC3蛋白通过蛋白质印迹分析。（b）在存在或不存在巴佛洛霉素A1（BFA）的情况下，HeLa细胞用缺氧处理0和12小时;TIM23，TOM20,FUNDC1和LC3。（c）GFP-LC3稳定HeLa细胞维持在缺氧条件下24小时。然后用抗VDAC1抗体（5nm金颗粒）处理样品用于标记线粒体（箭头）和抗GFP抗体（10nm金颗粒）以标记自噬体（箭头）的免疫金色电子显微镜。比例尺，300nm

16、。（d）对照和FUNDC1敲低（KD）HeLa细胞用1%02处理0或18小时，并通过用不同抗体的western印迹分析。4.2在FUNDC1所在的细胞中进行的救援实验：（e）对照HeLa细胞和FUNDC1敲低稳定HeLa细胞维持在缺氧条件下24小时或对照HeLa细胞在常氧条件下培养24小时。通过电子显微镜分析样品。棒，500nm。（f）对照HeLa细胞和FUNDC1敲低的稳定HeLa细胞在常氧下生长或暴露于1O224小时。细胞用TIM23染色。通过共聚焦z轴扫描捕获每个样品的三个随机挑取的区域，并且定量线粒体的总面积和体积（平均值土s.e.m。;来自三次独立实验的n=90个细胞）。*P0.01

17、。（g）FUNDC1敲低细胞用FUNDC1或FUNDC1突变体转染24小时，然后暴露于低氧条件另外24小时。收集样品用于western印迹。（h）对照和FUNDC1敲低细胞暴露于1O224小时。线粒体被细胞色素c抗体染色。计算片段化线粒体的百分比（平均值土s.e.m。；来自三次独立实验的n=100个细胞）。*P0.01。（i）对照和FUNDC1敲低细胞用GFP-LC3转染24小时，然后暴露于1O20或24小时。定量每个细胞的GFP-LC3点的数目（平均值土s.e.m。；来自三次独立实验的n=100个细胞）。NS,无显着性。印迹的未裁剪图像显示在补充图。S6。结果：4.1生化分析显示线粒体蛋白T

18、IM23和细胞色素的水平c在缺氧处理中以时间依赖性的方式降低，而内质网蛋白钙联接蛋白不受影响（图4a）。低氧诱导的线粒体蛋白如TIM23，TOM20和FUNDC1的降解可以被巴弗洛霉素A1抑制（图4b）。GFP-LC3（10nm免疫胶质）-阳性，通过电子显微镜分析可以清楚地观察到含有由VDAC1（5nm免疫胶质）标记的线粒体的双膜自噬体（图1,4c）。最重要的是，线粒体蛋白的降解可以通过Western印迹分析显示的FUNDC1的敲低（图4d）。4.2击倒FUNDC1导致线粒体完整性的显着保护（图4h），而不影响一般自噬如在缺氧处理的细胞中LC3-II的转化和GFP-LC3斑点的总数所示（图4d

19、，i）。敲除FUNDC1对饥饿诱导的LC3转化或TIM23和TOM20蛋白的减少没有影响（补充图S3a-c）。结论：在缺氧条件下，FUNDC1介导高选择性线粒体清除率不影响一般自噬。五.FUNDC1的去磷酸化激活缺氧诱导的线粒体目的：如何调节FUNDC1和LC3之间的相互作用以响应缺氧。方法：（a）如通过抗-p-FUNDC1（Tyr18）和抗-p-Src（Tyr416）抗体所指示的,FUNDC1和Src激酶在缺氧条件下脱磷酸化的时间过程。（b）用编码FUNDC1-Myc的质粒共转染编码GFP,Src-GFP或Src（mt）-GFP（激酶死亡）的质粒，并通过抗Myc抗体免疫沉淀（IP）样品，并用

20、抗磷酸酪氨酸抗体。（c）在Src-GFP或GFP存在下，用编码Myc，FUNDC1-Myc和突变体的质粒转染HeLa细胞。用抗Myc抗体免疫沉淀裂解物并用所示抗体进行免疫印迹。（d）体外激酶测定：将GST，GST-FUNDC1或GST-FUNDC1Y18W与或不与Src孵育20分钟，然后通过western印迹分析样品。（e）Cherry-LC3阳性FUNDC1敲低细胞用编码FUNDC1或FUNDC1Y18W的质粒在Src-GFP或GFP存在下共转染24小时。显示了代表性的共焦显微镜图像。比例尺，20口m。（f）自噬体（AV）的总面积被定量（平均值土s.e.m。；来自三次独立实验的n=200个细

21、胞）。*P0.01。NS，无显着性。（g）用编码GFP或Src-GFP的质粒转染的HeLa细胞维持在缺氧条件下或在常氧条件下保持12小时。通过蛋白质印迹分析细胞。（h）将FUNDC1-Myc转染体裂解物与固定的GST或GST-LC3B珠孵育，并通过western印迹检测。使用PonceauS显现GST和GST-LC3B。（i）将HeLa细胞暴露于含氧量正常或缺氧条件下24小时。内源性LC3用抗FUNDC1抗体或IgG免疫沉淀。通过western印迹分析样品。（j）HeLa细胞用缺氧或常氧处理。通过用抗LC3（红色）和抗FUNDC1（绿色）抗体的免疫荧光显现样品。比例尺,20口m。（k）FUND

22、C1在缺氧反应的线粒体中的假设模型。FUNDC1在Tyr18在含氧量正常的Src酪氨酸激酶磷酸化，并在缺氧条件下脱磷酸化。这增加其与LC3-II的结合，其在缺氧处理下大量产生。LC3结合的隔离膜的募集将导致线粒体周围的隔离膜的扩展以形成自噬体，其然后与溶酶体融合降解。印迹的未裁剪图像显示在补充图。S6。结果：4.1计算分析预测，Src激酶可能负责FUNDC1的Tyr18磷酸化（参考文献29,30）。FUNDC1的孵育其突变Y18W与Src激酶进一步证明FUNDC1是Src激酶的直接底物（图5d）。此外，Src激酶抑制FUNDC1介导的线粒体反应缺氧（图5g）。这些数据表明FUNDC1的去磷酸化

23、触发了线粒体的激活响应缺氧。FUNDC1是选择性的受体通过其特征性LIR来应答缺氧的线粒体特异性地与LC3相互作用。在正常生理条件下，FUNDC1介导的mitophagy被其磷酸化抑制在Src激酶的LIR基序的Tyr18位置。关于缺氧刺激，已发现FUNDC1是如何作为一个mitophagy受体与核自噬机制耦合（文献：34）。以前的研究表明Atg32通过其LIR主题与Atg8高度相互作用在酵母中的特异性mitophagy19,20,Atg32和FUNDC1在有丝分裂期间减少（图5和S4b，c）。线粒体碎裂是一个先决条件，但不足以用于自噬体形成。敲低FUNDC1减少LC3的募集线粒体和预防线粒体碎

24、片缺氧，可降低线粒体的水平。FUNDC1是保守的在高等真核生物中并在大多数组织中高度表达（补充图S4a），表明有丝分裂的机制对于细胞功能是重要的。Nix参与缺氧诱导的自噬并且是不可缺少的用于在网织红细胞期间程序性消除线粒体成熟（文献：15,27,36）。显然，FUNDC1诱导的机制线粒体与Nix或其同源物BNIP3的不同。另外，尽管发现两者都是参与由缺氧诱导的线粒体诱导，增加的表达观察到Nix或BNIP3，而FUNDC1的水平降低。此外，Nix和BNIP3定位在其他细胞器，参与调节凋亡或程序性坏死影响线粒体呼吸27,39,40。显然，FUNDC1不影响FUNDC1后缺氧条件下的细胞活力击倒（补

25、充图S5b-d）。结论：总的来说，FUNDC1和BNIP3在诱导有丝分裂中的角色是不同的，虽然我们不能排除他们用于线粒体有合作的可能性。六.一般方法方法动物：基于由InstitutionalAnimalCareCommittee批准的动物方案维持和护理所有小鼠。将成年C57BL/6（B6）小鼠在缺氧室中在含氧量正常或8%缺氧条件下处理72小时，然后制备脑组织，并通过western印迹检测线粒体蛋白如TIM23，FIS1，MFN1和FUNDC1。抗体：抗TIM23（1:1,000），抗TOM201:1000（BDBiosciences），抗GFP（1:2000，单克隆;SantaCruz），抗细

26、胞色素c（1:1000），抗钙粘蛋白-1（1：1,000），抗钙联蛋白单克隆抗体（1：1,000），抗GM130单克隆抗体（1：1,000;BDBiosciences）;抗LC3B多克隆抗体（1:1000），抗肌动蛋白单克隆抗体（1:10,000;Sigma）;抗c-Myc单克隆抗体（1：1,000;SantaCruz）;抗FUNDC1多克隆抗体(1：1,000;AVIVA);抗GFP多克隆抗体(1:2,000;Invitrogen);抗VDAC1单克隆抗体(1:2000)，抗Bnip3多克隆抗体(1:1000;Abeam);抗Src(1：1,000)和抗Sre(Tyr416)多克隆抗体(1：

27、1,000;CellSignaling);抗GST(1:3,000);通过用纯化的磷酸肽在FUNDC1中免疫兔并亲和纯化(Abgent)产生抗P-FUNDC1(Tyr18)多克隆抗体(1：1,000)。使用以下荧光二抗：山羊抗小鼠IgG异硫氰酸荧光素(FITC)，Cy3(DAKO);山羊抗兔IgG(DAKO);山羊抗小鼠Cy5(Invitrogen)。通过使用pET28a表达载体在大肠杆菌中产生的重组FUNDC1(6跨膜结构域)蛋白免疫兔产生针对FUNDC1的多克隆抗体。对于免疫沉淀测定，抗GFP多克隆抗体1:1000(Invitrogen)，抗FUNDC11:1000,抗Mye1:100;用

28、于免疫荧光，抗TIM231:100，抗TOM201:100，抗细胞色素e1:100，抗Mye1:100，抗FUNDC11:50，抗LC3B(纳米工具)1:50。使用以下荧光二抗：山羊抗小鼠IgGFITC1：100;山羊抗小鼠IgGCy31:100;山羊抗兔IgGFITC(DAKO)1:100;山羊抗小鼠Cy5(Invitrogen)1:100。BafilomyeinA1和新霉素购自Sigmao免疫金抗体(1:50)购自Jackson实验室和Sigma。6.3细胞培养和转染：HeLa细胞在补充有10%胎牛血清(Hyclone)和1%青霉素-链霉素的DMEM中在37C，5%CO2下生长。用用1%0

29、2，5%CO2和95%N2的预分析气体混合物冲洗的缺氧室(Billups-Rothenberg)实现缺氧条件。在FUNDC1中用于RNA干扰的靶序列是50-GCAGCACCTGAAATCAACA-30;ATG5中的靶序列为50-GAAGTTTGTCCTTCTGCTA-30;加扰RNA干扰序列为30-GACATTTGTAACGGGATTC-50;在用于RNA干扰的beelin-1中的靶序列是50-CTCAGGAGAGGAGCCATTT-30。根据制造商的说明书(Ambion)设计短发夹RNA的引物，并克隆到pSileneer2.1-neo载体中。为了建立稳定的细胞系，用相应的载体转染HeLa细胞

30、并用新霉素选择。6.4实时PCR分析：使用TRIzol试剂(Invitrogen)制备RNA。使用SuperSeriptVILOeDNA合成试剂盒(Invitrogen)合成互补DNA。通过使用QuantOneStepqRT-PCR(Probe)试剂盒(Tiangen)和CFX96实时PCR检测系统(AppliedBiosystems)进行实时PCR。对于半定量PCR，(ATGGCATCCCGGAACCCCC-3050AGATGCCAGGCCTAGCAAAAAG-3050HPRTCACAGGACTAGAACACCTGC-3050-GCTGGTGAAAAGGACCTCT-30（反向）。引物如下正

31、反正FUNDC150向向向对于实时PCR引物如下:FUNDC150-GCAGTAGGTGGTGGCTTTC-30（正向）和50TGCTTTGTTCGCTCGTTT-30反向），50-GAPDHTGCACCACCAACTGCTTAGC-30（正向）和50-TCTTCTGGGTGGCAGTGATG-30（反向）。6.5细胞活力测定：根据标准方案使用膜联蛋白V-异硫氰酸荧光素/碘化丙啶测定试剂盒(BDBioseienees)通过膜联蛋白V标记评价细胞凋亡事件。使用商业LDH测定试剂盒(JianchengBioengineering)根据制造商的说明书检测LDH活性。6.6免疫荧光显微镜：细胞在盖玻片

32、上生长至60%汇合。处理后，用PBS洗涤细胞两次，并在37C下用新鲜制备的3.7%甲醛固定15分钟。通过用0.2%TritonX-100处理增加抗原可及性。将细胞与第一抗体孵育1小时，并且在用PBS洗涤后，用第二抗体染色另外45分钟。用LSM510Zeiss共聚焦显微镜捕获细胞图像。电子显微镜。如上所述培养和处理细胞。对于免疫电泳显微术，首先将细胞用2%多聚甲醛和0.2%戊二醛在二甲胂酸钠缓冲液（pH7.4）中37C孵育2小时，然后脱水在分级乙醇系列中并嵌入丙烯酸树脂（LRWhite）中。70nm超薄将切片安装在镍网上，用1%BSA/PBS孵育并孵育在4C下用1%BSA/PBS中的一抗（抗GF

33、P抗体（稀释度1/200）和/或抗VDAC1抗体，终浓度为2ug/ml）的混合物过夜，洗涤5次，每次5min，然后在5%（或20nm）的山羊抗小鼠对于VDAC1和10nm山羊抗兔对于在1%BSA/PBS中的GFP-LC3金缀合的颗粒标记2小时。最后在0.5%BSA/PBS中将网格洗涤4次，每次5分钟，在1%戊二醛/PBS中孵育15分钟，在PBS中洗涤2次，在蒸馏水中洗涤3次，在室温下染色和干燥。使用120kVJeol电子显微镜在80kV下观察样品，并使用AMT数字照相机捕获图像。SDS和western印迹：在裂解中裂解细胞或膜级分缓冲液（20mMTris，pH7.4,2mMEGTA，1%NP-40，蛋白酶抑制剂）。当量蛋白质量（20ug）进行SDS，并转移至硝酸纤维素膜。用所示的一级抗体，随后是合适的HRP缀合的二级抗体（KPL）探测膜。用化学发光试剂盒（Pierce）显现免疫反应条带。免疫沉淀。使用钙瞬时转染HeLa细胞磷酸盐法。转染后24小时，将细胞用0.5ml裂解缓冲液加蛋白酶抑制剂（RocheAppliedScience）在冰上30分钟。在12,000g离心15分钟后，裂解物进行免疫沉淀与特异性抗体和蛋白A-Sepharose（Invitrogen）在4过夜。然后，用裂解缓冲液洗涤沉淀物三次，免疫复合物用含有1%SDS的样品缓冲液洗脱5分钟在95C下