NPK菌研究思路(充实)

1、 离子束注入诱变改良荒漠生境有益微生物的研究荒漠化地区表层土壤养分匮乏，是除水分外限制固沙植被发育的另一个限制性因子。应用根际微生物，固定空气中的氮素，将沙土中植物根系难以吸收的矿质分解为可溶的磷酸根与游离态钾，增加土壤中可利用养分的含量，并扩大植物根的吸收面积，具有重要意义。而通过离子诱变，进一步改善其富集营养元素的能力，提高环境微生物的抗逆性，从而使之更适应沙漠生境。1选用菌种：根据根际微生物与地表结皮微生物相结合，真菌与细菌结合，固氮菌与解磷解钾菌结合，自生固氮菌、联合固氮菌与根瘤菌相结合的原则，拟选用以下菌种：1.1菌根真菌(AMF)AMF可与绝大多数植物的根形成菌根。菌根是菌根真菌与

2、寄主植物之间共生生活达到高度平衡的联合体。菌根真菌从植物体内获取必要的光合碳物质营养，而植物从真菌那里得到它所需要的土壤矿质养分及水分等，二者达到一种互利互惠、互通有无的高度统一的联合体，从而这种互益关系为共生双方提供了更为广阔的生存和发展空间。菌根可以扩大寄主植物根系的吸收面积。菌根真菌菌丝体形成的菌丝网，可代替寄主细根或根毛吸收水分和养分，从而使根系吸收范围扩大，能够将更多的土壤营养吸收并传送给寄主植物，由此起到促进寄主植物快速生长的作用；菌根增加寄主植物对磷、氮及其它土壤矿质营养的吸收。外生菌根真菌产生磷酸酶，将土壤中的不溶性磷转变成可溶性磷，供给寄主植物利用。同时菌根对Zn、Cu、Mg

3、、Ca、Mn等微量元素的吸收也十分有益。还有相关报道指出，菌根还可提高植物对B、Si、Ni、Co等元素的吸收，供植物生长所需；菌根真菌能产生几乎所有的植物生长调节物质，如生长素类、赤霉素类、细胞分裂素类、脱落酸及乙烯等，这些物质对寄主直接产生生长促进作用。有研究发现菌根真菌产生的各种生长刺激物质在菌根形成之前就能对植物根系的生长发育起刺激作用，从而促进植物生根、萌发和生长；菌根可以提高寄主植物的抗逆性。植物感染菌根后可以提高寄主的抗旱、抗盐碱、抗极端温度、湿度和pH值、抗重金属毒害等能力，提高寄主植物对不良环境的综合抵抗能力，尤为突出的是可大大提高寄主的抗病能力，如外生菌根的菌丝套和哈蒂氏网对

4、病原菌的侵入起到直接的机械屏障作用，有些菌根真菌还能产生抗生物质，直接抑制病原菌的生长发育，还有些菌根真菌能寄生在病原菌上形成重寄生，杀死或溶解病原菌；菌根可以改善植物根际环境。菌根真菌分泌的多种酶类和有机酸，能促进土壤中矿质和有机质的分解，提高土壤中养分的有效性，加速土壤养分循环，对改善土壤结构、防止地力衰退起到重要的促进作用。利用菌根真菌“生物肥料”的作用，就可以降低速效化肥的用量，从而减轻硝态氮对地下水和地表水资源的污染程度；利用菌根真菌提高植物抗土传病害的作用，就可以减少部分农药的施用量以减轻对土壤、水资源和大气的污染；利用菌根真菌能提高植物抗旱性的作用，可以增强山旱薄地植物的抗旱性，

5、促进生长，并有利于水土保持。接种菌根可显著提高苗木移栽成活率，对荒山造林、水土保持、增加森林覆盖率具有重大意义。在理论方面，菌根的研究和发展可以丰富生物学的内容。因此，无论从理论上还是农林业生产与固沙实践中开展菌根研究均有极其重要的意义。1.2联合固氮菌：在固氮菌中有一类自由生活的类群，生长于植物根表和近根土壤中，靠根系分泌物生存，与植物根系关系密切，这类固氮菌称联合固氮菌。联合固氮的研究历史很短。1958年，由甘蔗根际分离到固氮细菌拜叶林克氏菌(Beijirinckiafluminensis),1966年在点状雀稗(Paspalumnotatum)根际发现有专适性的雀稗固氮菌(Azotoba

6、cterpaspali)联合生活并进行高效的固氮作用，1975年,Dbereiner等提出联合共生固氮的概念，即认为根际中存在一类自由生活的能固氮的细菌,定殖于植物根表或近根土壤,部份则能侵入植物根的皮层组织或维管中,靠根系分泌物生存繁殖,与植物根系有密切的关系,但并不与宿主形成特异分化结构。大量的试验结果表明,接种固氮菌在各种环境和土壤条件下对牧草和谷物是有益的。然而,在这个系统中生物固氮由于受多种因素的限制,对植物生长的贡献却非常低。联合固氮菌对植物生长的促进效应,主要来自固氮菌分泌的植物激素使被接种植物的根形态和生理发生变化,从而增强了对水分和矿物营养的吸收。由于联合固氮菌与植物根系之间

7、只是一种松散的联合,没有分化出有形的结构,这使研究植物与细菌之间的相互关系遇到很大困难,致使这方面的知识仍非常有限,远不如共生细菌或病原菌与植物之间相互关系的研究那么深入。并且，阶段人们对联合固氮菌的研究大部分只停留在各种作物上固氮菌的筛选和分离、鉴定的基础阶段,并且所用方法普遍混杂,缺少一个系统的认识。另外，联合固氮菌对禾本科农作物(如水稻和小麦)、甘蔗和卡拉草(Leptochloafusca)等热带牧草研究偏多，而特殊荒漠生境下的沙生禾本科植物则很少。这是因为，联合固氮菌的固氮活动是耗能的，其固氮活力远低于根瘤菌，而农田土壤中的丰富的有机质，如糖类、有机氮等，比较适合联合固菌的生存与繁殖，

8、且农田中温度、土壤酸碱度等也比较便宜，但是荒漠环境下，这些条件都不具备。由固沙植物根际分离的联合固氮菌，应用离子束注入技术进行诱变改良后再回接到禾本科固沙植物根际，以改善禾本科植物的营养状况与生长发育，提高其在干旱贫瘠的荒漠环境的生存能力。这就是本项研究的主要目标。拟用由荒漠或干旱草原禾本科植物(以草地早熟禾、黑麦草、高羊茅为主)的根系分离出联合固氮菌。拟采用假单胞杆菌属(Pseudomonas)、芽抱杆菌属(Bacillus)和固氮菌属(Azotobacter)的细菌。这类固氮菌主要通过产生生长素改变根系形态而促进植物的生长。自生固氮菌：拟采用两种：棕色固氮菌(Azotobactervine

9、landii)和圆褐固氮菌(Azotobacterchrococcum)。自生固氮的固氮能力比联合固氮菌还弱，在荒漠生境下也面临着与联合固氮菌相同的问题。需要提高其在荒漠的干热环境下的生存能力与固氮能力。根瘤菌：根瘤菌(Rhizobia)是一类与农业生产关系甚为密切的革兰氏阴性细菌。它们与豆科植物共生，通过侵染豆科植物根部或茎部形成根瘤和少数茎瘤，将空气中氮气转化为氨，进而转化成植物可吸收利用的优质氮素谷氨酸和谷氨酚胺类物质。根瘤菌与豆科植物共生结瘤固氮是陆生生态系统中最重要的固氮体系，它们在所有的固氮体系中固氮作用最强。据统计地球上每年由豆科根瘤菌固定的氮素为8X1O10kg，约占全球生物固

10、氮总量的65%，相当于全世界工业合成氮肥量的2倍。但是根瘤菌专性寄生性极强，多数只能与豆科植物共生。根瘤菌由于其巨大的经济社会效益，早就引起了微生物学家的注意，并加以研究。目前国内外对根瘤菌资源收集与分类、生理生化、遗传转化进行了较深入的研究，这一方面为根瘤菌的后续研究提供了较好的基础，但另一方面，根瘤菌的筛选主要侧重于从天然分离的菌株中筛选，人工诱变工作除少数学者采用紫外线与Y射线进行诱变外，其他做得很少，尤其是根瘤菌的离子束诱变还没有人做。华中农业大学农业微生物国家重点实验室认为“离子束诱变根瘤菌是一个全新的领域”。因此，进行根瘤菌离子束诱变，不但能筛选到自然界难以分离到的优良菌株，而且可

11、以填补学术上的空白。拟采用甘草根瘤菌和沙打旺根瘤菌。1.5磷细菌：磷素是植物生长需要量较大的三要素之一。在荒漠中磷素含量蕴藏丰富,然而这些磷素大多为植物不易吸收利用的难溶性有机态和无机态含磷物质。利用微生物分解活化沙土中磷素物质蕴藏，使其能为沙漠植物所用，具有积极意义。采用的菌种：解磷巨大芽胞杆菌（Bacillusmegaterium）和弯曲假单胞菌（Pseudomonasgeniculatal）。钾细菌：钾细菌是土壤一种特殊细菌，具有解钾、解磷、固氮和增强作物抗病能力等特点，应用于各种农作物，增产效果极为明显。但荒漠生境下钾细菌尚鲜见报道。通过离子束诱变的文法筛选出生长快、发酵周期短、产芽孢

12、能力强、产速效钾、速效磷量高的突变菌株，是技术的关键。采用的菌种：硅酸盐胶质芽抱杆菌（Bacillusmucilaginosus）。1.6结皮微生物广泛存在于广大干旱和半干旱地区，由各种低等生物及其代谢产物形成，土壤颗粒在它们的包裹下形成一层硬壳。藻类、细菌、真菌、苔藓和地衣等构成了生物结皮的主要生物类群，其中蓝藻占优势种群，对其形成和演化起关键作用。生物结皮的关键特征是富含能分泌丝状鞘和多糖的各种蓝藻，它的形成同土壤的质地、电导率、pH、湿度、温度以及植被等密切相关。生物结皮对干旱和半干旱地区生态系统稳定和相对平衡起重要作用。生物结皮集中于土壤表面的14mm,对生态系统的作用体现在影响土壤一

13、空气界面的相互作用。其主要功能包括：（1）维持土壤稳定性，保持和改善干旱和半干旱地区土壤理化结构。（2）增加土壤肥力，为高等植物生长提供营养。（3）保持土壤水分。（4）植物生长，生物结皮通过改善土壤的微环境，提高土壤的肥力等，促进了植物的生长。虽然生物结皮具有很强的抵抗不良环境的能力，由于本身处于生态环境非常脆弱的干旱和半干旱地区，人类的活动如放牧、土地开垦、旅游和军事活动等都会对其造成严重影响，许多地区的生物结皮正遭遇退化。生物结皮的退化对干旱和半干旱地区的生态环境有严重影响，如降低了土壤的肥力，增加了土壤的水分蒸发、土壤颗粒和理化性质受到破坏、增加了风力对土壤的侵蚀，使土壤表面裸露，加剧土

14、壤沙漠化。裸露的土壤颗粒覆盖其它区域的生物结皮，降低了结皮生物的光合作用，又加速了生物结皮的退化。此外，生物结皮的退化降低了干旱和半干旱地区的生物多样性。在自然情况下，生物结皮的恢复是非常缓慢的过程，如藻类结皮的恢复至少需要15年时间，而地衣结皮和苔藓结皮的恢复尤其漫长。长期以来，我国的干旱和半干旱地区的治理主要集中在植树造林和引水灌溉等措施上，由于这些地区的降雨少，蒸发量大，不断抽取地下水灌溉的后果是，相关地区地下水位的持续下降和枯竭。在干旱和半干旱地区，生物结皮在涵养水土、固沙等方面具有不可替代的作用，但由于过度放牧、盲目发展经济作物，加上周边农民的相对贫困，使的生物结皮遭受很大破坏。要恢

15、复和改善这些地区的土地沙化的状况，必须从恢复这些地区的最基本的生物群落生物结皮着手，进而改善沙化地区的植被状况，走一条水资源节约型的生态环境的新路子。为此，必须利用当代生命科学、材料科学和信息科学等诸多学科的新成果，进行技术集成，利用离子束生物工程技术改良结皮生物，筛选适应性广、生长速度快、抗逆性强、耐环境胁迫的结皮生物，结合新型吸水材料、植被改良技术，加强对沙化地区人民的人文关怀，传授节水型农业技术和发展设施农业，对沙化地区进行综合治理。项目的总体目标是，利用离子束生物工程技术，改良沙漠结皮蓝藻品系，集成材料科学、植被改良技术，促进结皮生长和群落演化，改善水分在沙土中的时空分布和传导，促进浅

16、根系植物的生长。2离子束对菌种的诱变及筛选离子束微生物修饰与改良是本研究的中心环节，也是集成固沙技术体系的重要组成部分。基本研究思路是由荒漠或干旱草原的植物根际或表层土取样，带回实验室分离出所需的微生物，纯化后，按照离子束生物工程学微生物诱变技术规程，进入1轮以上的离子束诱变、筛选，从中选出得到改良的菌株，再回接到到根际或应用于表土形成结皮，从而更好地服务于固沙。2.1分离纯化方法2.1.1菌根真菌2.1.2联合固氮菌联合固氮菌由沙生禾本科植物(如草地早熟禾、黑麦草、高羊茅)的根系分离，根际区分为:距根系较远(lcm)土壤(NRS)、根表土壤(RS)、根系表面(RP)和根内(HP)。将沙生禾本

17、科植物的根系挖出，去除泥沙，将细根捣碎；也可取根际细沙，用无菌水浸出液，接种于NFM培养基和LB培养基上，对根际各部分样品进行固氮菌分离与纯化。将获得的纯菌株分别接种于盛有5mL半固体NFM培养基的血清瓶中(每菌株5个重复)，结合气相色谱仪，利用乙炔还原法确定菌株有无固氮活性。纯培养后进行鉴定研究。在研究不同培养基上菌落特征和生理生化特征基础上，对照细菌分类学手册，采用“伯杰氏”分类系统进行分类。并最终确定几种出发菌株。NFM培养基：葡萄糖10g，NaC10.2g,KH2PO40.2g,CaSO42H2O0.1g,MgSO40.2g,CaCO35g，琼脂20g,水1000毫升，pH值自然LB培

18、养基：胰蛋白10.0g,NaCl10.0g,酵母粉5.0g,H2O1000ml,pH值7.2。自生固氮菌分离方法同联合固氮菌。只是采样范围扩大，不限于禾本科植物根区，且可远离根区甚至无植被分布的区域采集。采用培养基配方：阿须贝培养基:甘露10.0g,NaCl0.1g,KH2PO40.2g,CaCO35.0g,MgSO47H2O0.2g,CaSO40.1g,H2O1000ml,pH值7.0。根瘤菌在78月份于荒漠区甘草或沙打旺(以下以甘草为例)盛花期采集根瘤，或带土挖掘其根系，带回实验室，在实验室中分离纯化根瘤菌。根瘤洗净后，用70%乙醇与0.1%升汞表面消毒并用无菌水冲洗后，用破棒压碎并吸取汁

19、液到YMA试管斜面上，于28C黑暗条件下培养，长出的菌落用平板划线法分离，挑取具典型特征的单菌落至YMA培养基上培养。反复转培几次，直到完全纯化为止。初步分离可得大约20株以上的菌株，初步研究其菌落特征与生化特征(实验操作可参照根瘤菌操作手册)。经镜检及生化特征研究判断其为根瘤菌株后，挑取纯化后的菌落拌种至YMA液体培养体中在黑暗中摇床培养(转速120rpm)5d。将甘草种子纯浓硫酸或80%工业硫酸处理2h后自来水冲洗干净，再经表面消毒，接种于装有1/2MS培养基的三角瓶中，观察其萌发情况，约3d后长成幼苗，移植于新的MS培养基上，光照箱中培养，10d后进行回接实验。将幼苗移至盛有无氮培养液的

20、灭过菌的塑料袋中，同时用所分离的菌株进行感染，5-26d后进行观察其结瘤情况，经回接结瘤的菌株才能断定为根瘤菌。YMA培养基配方：甘露醇(Mannitol)10g，酵母粉(YeastExtract)3g，磷酸氢二钾(K2HPO3)0.25g，磷酸二氢钾(KH2PO3)0.25g，氯化钠(NaCl)0.1g，硫酸镁(MgSO4)0.2g，碳酸钙(CaCO3)5g(保存菌种时加)，蒸馏水(distilledwater)1000ml，PH6.8-7.2磷细菌由荒漠地区分离。取沙生植物根际沙土或根组织，带回实验室后，接种于培养基上。巨大芽胞杆菌与众不同的主要特征是菌落有几层同心圆圈,而菌体异常粗短、近

21、椭圆形,常成单个或成双及短链状。选取具有典型菌落特征的菌落，并镜检，重新接种，如此几次，直到完全纯化为止。培养基配方：葡萄糖10.0g,FeSO40.03g,MgSO47H2O0.3g,NaCl0.3g,(NH4)2SO40.5g,KC10.3g,MnSO40.03g,CaHPO4或Ca3(PO4)28.0g,H2O1000ml,pH值7.0。钾细菌基本同磷细菌。培养基配方：甘露醇10.0g,酵母粉0.4g,MgSO47H2O0.2g,K2HPO40.5g,CaCO31.0g,MgCl20.2g,H2O1000m1,pH值7.27.4。结皮微生物分离由荒漠中的结皮分离。离子注入方法2.2.1稀

22、释倍数确定将出发菌株之一斜面活化，用接种环刮取菌苔，接入液体培养基，进入对数生长期后，取菌液1ml，稀释至梯度倍数后，取1ml均匀涂布在培养皿上，在超净工作台上吹干，另取1ml直接接种于平板上。之后加入一定量的灭菌去离子水，接种于平板上，于28C条件下培养。平板长出菌落后统计得活菌个数。由此确定菌液干燥对活菌数的个数的影响，得出适宜的稀释倍数。离子注入参数探索方法同上。根据剂量做3-6个培养皿。同时，另取1ml稀释的菌液，接种于YMA平板上。CK1:稀释的菌液，直接接种于平板上；0：吹干的菌液，经真空。以以三种不同的离子(H+、Ar+和N+)，以不同能量(10keV-30keV)，以0、1、2

23、、3、4、5X1016ions/cm2剂量于离子束生物工程装置的小靶室注入。注入结束后，加3ml无菌水，稀释一定浓度后涂布于平板上，每个剂量做3个皿，于28C黑暗条件下培养，长出菌落后统计菌落个数，统计三个皿的平均值。重新进行液体培养，重复三次。以处理的菌落数与0剂量的菌落数之比为存活率，得出剂量存活率曲线。由此，得到最佳的注入参数。2.2.3离子注入将各出发菌株斜面活化后，按上述方法进行离子注入。2.3筛选方法与指标室内培养结瘤率(根瘤菌)大试管中加入珍珠岩或蛭石作栽培基质，加入一定量的无N营养液，灭菌后。植物种子表面消毒后播入大试管中，并在种子周围接种培养至对数生长期的菌液，28C培养2d

24、后转入正常温度培养，20-30d后检查结瘤情况。固氮酶活性(所有固氮菌)气相色谱乙炔原法在单个根瘤水平上检测，将根瘤或富集的固氮菌放在小药瓶中，同时充入乙炔，气相色谱法测定生成的乙烯的量，经计算可得根瘤菌或固氮菌的瞬时固氮酶活性；2.3.2.2用15N示踪法测定自生与联合固氮菌：将分离纯化的可能的联合固氮菌在充满15N2气体的环境中培养后，测定菌体内15N丰度。生长素分泌能力菌根菌与绝大多数根际细菌都有分泌生长素类物质的能力，以IAA为主。生长素可以刺激植物根系发育，提高植物抗旱性及吸收养分的能力。具体筛选方法有：Salkowski比色法标准曲线采用纯的3-IAA制作。测定菌株分泌的IAA时将

25、菌株液体培养液在10000转离心10min,取上清液1ml加比色液在黑暗中静止0.5min取出立即用分光光度计测定，波长是530nm。ThakuriaD,TalukdarNC,GoswamiC.etal.CharacterizationandscreeningofbacteriafromrhizosphereofricegrowninacidicsoilsofAssam.CurrentScience,2004,86(7):978-985EricG,YvesD.AcriticalexaminationofthespecificityoftheSalkowskiReagentforindolicc

26、ompoundsproducedbyphytopathogenicbacteria.AppliedandEnvironmentalmicrobiology.1995,2:793-796ELISA法将菌液离心取上清后，加80%甲醇浸提，采用ELISA法测定IAA含量(可以参照南京农大ELISA试剂盒说明书)。如能自行开发特异结合的IAA抗体，且可以显色，则可以进行单个菌体的高通量筛选。这也是课题所要研究的内容之一。HLPC法测定IAA含量菌体用乙醇乙酯提取，低温下蒸发干燥，再用100%乙醇溶解，采用HLPC法进行测定，以3-IAA标准溶液为对照。2.3.4解磷能力主要针对磷细菌与钾细菌进行。同时

27、，一些固氮菌也有解磷能力。2.3.4.1平板筛选：固体培养基中分别加入难溶性磷酸盐，如磷酸二钙、磷酸钙、磷酸十钙、氯磷酸钙或磷矿粉，接种培养，测定磷深斑数量及尺寸，并测定溶磷量。取1mL菌株悬浮液接种于50mL液体培养基中(每一菌株5个重复)，置于轨道摇床上(28C,160r/min)培养10d之后在4C下离心(10000r/min)15min,取上清液用钼酸铵比色法测定有效磷(P)的含量。2.3.4.2摇瓶筛选：液体培养基中加入难溶性磷酸盐，如磷矿粉或纯磷酸钙，500mL三角瓶中装培养液100mL，接斜面菌种1环，摇床转速为150r/min，28C培养5d，以不接种摇瓶作对照，每菌株重复3次

28、培养液过滤后冷藏保存供可溶性磷测定用。培养物通过超声波细胞破碎机进行细胞破碎,使之释放出细胞内的有效磷,然后进行离心。无机磷培养液的上清液可以直接用钼锑抗比色法测定培养液中的有效磷。2.3.5解钾能力主要针对钾细菌（硅酸盐细菌），可依据分解钾长石后得到的可溶性K+的量来筛选。具体有以下两种：2.3.5.1摇瓶发酵：摇瓶中加入钾长石，发酵后测定K+。以钾长石为底物，500mL三角瓶中装培养液100mL,接斜面菌种1环，摇床转速为150r/min,28C培养5d,以不接种摇瓶作对照，每菌株重复3次培养液过滤后冷藏保存供速效钾测定用。采用火焰原子吸收分光光度法测定钾。235.2盆栽试验：栽培基质中加

29、入钾长石，测定一段时间后基质中与植物体内的K+水平。耐氨能力筛选耐氨性强，在高N营养条件下也具有较高固氮能力的根瘤菌株。平板筛选：固体培养基中加入氨盐（NH4C1或（NH4）2SO4），筛选发育良好的根瘤菌菌落；盆栽法：用高N营养液或完全营养液浇灌，观察结瘤情况并测定固氮酶活性。耐逆性主要有耐盐性、耐酸碱性和耐热性等。将离子束注入后的平皿（含对照）用无菌水洗脱，依次接种于含高浓度NaCl的筛选平板上。挑取成活菌落，并逐步提高筛选压力，直到不能形成菌落为止。将初筛获得的耐盐菌系再分别进行接种于pH值为2-12的平板上，进行耐酸碱性筛选；将菌种接种于平板上后，置于一定梯度的高温下进行耐热性筛选，以

30、获得耐盐、耐酸碱（pH值）及耐热的菌株。优良菌株经纯培养后，一20C保存备用。生长快，发酵周期短结合发酵实验进行筛选。盆栽表现平板筛选和离体筛选获得的优良菌株，接种于播种了固沙植物的花盆中，设两个对照：CK1:未接种的但播种了植物；CK2:未接种也未播种植物。栽培一段时间观察比较植物生长发育的表现。特别地，在单独筛选磷细菌时，基质中加入磷酸钙或磷矿粉，钾细菌时则加入钾长石。主要测定项目有：栽培基质与植物体内营养元素含量。浓酸消化后，取部分消化液进行测定。含N量采用凯氏定氮法，含P量采用钼氨酸比色法，含K量采用火焰原子吸收分光光度法或等离子体发射光谱法。生物量测定项目主要有株高、主根长、侧根数等形态指标，叶绿素、可溶性糖、总糖、可溶性蛋白、氨基酸、核酸等的含量，以及鲜、干重等。主要测定方法可参照常规植物生理学实验。沙漠试验表现将筛选出的优良菌株应用于沙漠中，测定项目基本同盆栽实验。对于根瘤菌，应注意比较田间占瘤率，以鉴定接种菌株