第七章高等动物基因1哺乳动物表达系统

1、基因工程 Genetic Engineering 陈武cwy_生命科学与生物制药学院8 基因治疗 转基因动物与动物反应器 哺乳动物表达系统 高等动物基因工程的基本概念第七章 高等动物基因工程第一节 高等动物基因工程的基本概念高等动物基因工程哺乳动物细胞表达系统高等动物转基因技术转基因动物个体动物工程细胞哺乳动物品种改良疾病模型用于药物筛选研究基因治疗蛋白多肽物质大规模生产药物筛选研究评价模型D 哺乳动物表达系统的基因转移方法第二节 哺乳动物表达系统C 哺乳动物表达系统的载体系统B 哺乳动物表达系统的受体系统A 哺乳动物表达系统的优缺点E 提高哺乳动物细胞表达重组蛋白的方法及应用优点：表达的蛋白

2、与天然蛋白在结构、糖基化、磷酸化、寡聚体类型和方式上几乎相同，且能正确组装成多亚基蛋白。如EPO（促红细胞生成素）缺点：哺乳动物细胞的表达水平低；获得高表达细胞株所需的时间长；细胞大规模培养的成本高；哺乳动物细胞生产的蛋白质类药物的成本较高； （一）哺乳动物细胞表达系统优缺点：哺乳动物细胞表达系统的构成受体系统载体系统转基因技术（1）正常的哺乳类动物细胞具有四大生物学特征: （二）哺乳动物宿主系统锚地依赖性：细胞必须附在固体上或固定的表面才能生长分裂血清依赖性：细胞必须具有生长因子才能生长接触抑制性：细胞与细胞接触后，生长便受到抑制形态依赖性：细胞扁平状，并有长纤维网状结构（2）高效表达外源基

3、因受体细胞应具备下列条件：细胞系特征 丧失细胞接触抑制性和锚地依赖性特征，便于大规模培养合适的标记 便于转化株的筛选和维持遗传稳定性 外源基因多次传代后不至于丢失，易于长期保存生长快且齐 分裂周期短，生长均一，便于控制安全性能好 不合成分泌致病物质，不致癌(3) 常用的高等哺乳动物受体细胞1. 迄今为止，用于医疗用品（药物、抗体、诊断试剂）大规模生产的高等哺乳动物受体细胞主要是中国仓鼠卵巢细胞（CHO）其优势有如下几个方面：遗传背景清楚，生理代谢稳定与人的亲缘关系接近，外源蛋白修饰准确基因转移和载体表达系统完善耐受剪切力，便于大规模培养被美国FDA确认为安全的基因工程受体细胞（GRAS）2.

4、1981年，Gluzman用编码野生型T抗原但复制起点缺失的SV40，转化允许SV40裂解性生长的非洲绿猴肾细胞CV-1，获得了三个细胞系：COS1、COS3、COS7。这三个细胞系均含有T抗原，保留完全的允许SV40裂解性生长的能力（被广泛地用于瞬时表达系统）。 T抗原作用：当表达产生的T抗原结合到SV40的复制点的DNA调控区，病毒DNA的复制即被启动。 思考：COS细胞作宿主细胞表达的优势？3. BHK-21：1961年从地鼠幼鼠的肾脏分离而来成果：用它表达的重组凝血因子VIII已获准投放市场。4. C127细胞：来自RIII小鼠乳腺肿瘤细胞，特别适用于带有牛乳头瘤病毒（BPV）载体的转

5、染：用C127细胞生产的重组人生长激素（hGH）已获准投放市场，用于治疗生长激素缺乏症。5. MDCK细胞：1958年从成年雌性的西班牙长耳狗的肾脏分离获得的，是贴壁生长的上皮样细胞：有报道用该细胞结合人巨细胞病毒早早期启动子可高效表达分泌蛋白，表达量占细胞分泌蛋白质总量的15%20%。(4) 高等哺乳动物受体细胞的遗传标记营养缺陷型的哺乳动物受体细胞5-磷酸核糖-1-焦磷酸（PRPP）次黄嘌呤核苷一磷酸（HMP次黄嘌呤（H）GMPAMP）尿嘧啶核苷一磷酸（UMP）胸腺嘧啶核苷一磷酸（TMP）胸腺嘧啶核苷（TR）嘌呤核苷酸生物合成途径嘧啶核苷酸生物合成途径次黄嘌呤磷酸核糖转移酶（HPRT）胸腺

6、嘧啶核苷激酶（TK）氨基喋呤（AP）氨基喋呤（AP）从头合成途径补救合成途径氨基喋呤（AP）二氢叶酸还原酶（DHR）黄嘌呤-鸟嘌呤磷酸核糖转移酶（XGPRT）高等哺乳动物受体细胞的遗传标记营养缺陷型的哺乳动物受体细胞含有胸腺嘧啶核苷激酶（TK）编码基因缺陷的（tk -）受体细胞不能在含有次黄嘌呤、氨基喋呤、胸腺嘧啶核苷的培养基上（HAT培养基）生长，载体上的标记基因tk能与之遗传互补含有次黄嘌呤磷酸核糖转移酶（HPRT）编码基因缺陷的不能在含有次黄嘌呤、氨基喋呤、胸腺嘧啶核苷的培养基上（HAT培养基）生长，载体上的标记基因hprt与之遗传互补（hprt -）受体细胞高等哺乳动物受体细胞的遗传标

7、记哺乳动物受体细胞常见的遗传选择标记遗传标记编码产物筛选药物作用机理APH 氨基糖苷磷酸转移酶 G418APH灭活G418DHFR- 二氢叶酸还原酶 氨甲喋呤DHFR变体抗氨甲喋呤 HPH- 潮霉素B磷酸转移酶 潮霉素BHPH灭活潮霉素B TK- 胸腺嘧啶核苷激酶 氨基喋呤 TK合成TMPXGPRT- 黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖转移酶 霉酚酸 XGPRT合成GMPADA- 腺嘌呤核苷脱氨酶 腺嘌呤木酮糖苷 ADA灭活Xyl-A （三）哺乳动物细胞载体系统 (1)哺乳动物细胞表达载体应具备的条件： 基本的元件：增强子、终止信号和poly(A)信号、多克隆位点、剪接信号、筛选标记等； 易于扩增至足够数量

8、，能够在哺乳动物细胞内稳定存在、不丢失：哺乳动物细胞无天然质粒； 能够在哺乳动物细胞内高效表达的强启动子：一般细胞不过量表达蛋白（1）病毒类载体人腺病毒DNA猴空泡病毒DNA（SV40）人乳多瘤病毒DNA（BKV）人牛痘病毒DNA1. 人腺病毒DNA 腺病毒科为线状双链DNA病毒，无包膜，呈二十面体，共有93个成员，分哺乳动物腺病毒和禽腺病毒两个属。目前已鉴定的人腺病毒腺病毒的生物学特性有6个亚属，其中常用来构建载体的主要是C亚属的2型（Ad2）和5型（Ad5）病毒。 腺病毒感染人细胞时呈裂解型，不致癌；但对啮齿目动物来说，绝大多数的腺病毒成员均能致癌。201.腺病毒结构腺病毒感染细胞过程人腺

9、病毒DNA腺病毒的基因组DNAITRITRE1E2E3E4IVa2VAL1L2L3L4L5 腺病毒基因组DNA全长36 kb，其包装上限为原基因组的105%， DNA两端各有一个反向重复序列（ITR）；E1-E4为早期基因，与病毒基因组的复制及晚期基因的表达调控有关，其中E3编码晚期基因的调控因子， L1-L5为编码病毒包装蛋白的晚期基因；IVa2和VA均为病毒RNA聚合酶的亚基编码基因。E3区缺失只会影响病毒颗粒的成熟，不影响基因组的复制功能，因而在构建载体时往往除去这个2.2 kb的片段，使得载体的装载量提高到4 kb以上。重组腺病毒表达载体构建原理1) 腺病毒载体2)转移载体3)构建重组

10、腺病毒表达载体(续)人腺病毒DNA基因重排低 外源基因与病毒DNA重组后能稳定复制几个周期腺病毒DNA载体的特点安全性能好 不整合人的染色体DNA，不会导致恶性肿瘤宿主范围广 对受体细胞是否处于分裂期要求不严格使用效果好 外源基因在载体上容易高效表达2. 猴多瘤病毒DNA（SV40） SV40属于乳多瘤病毒科多瘤病毒属，呈小型二十面体，由VP1、VP2、VP3三种衣壳蛋白包装而成，基因组为5224bp的双链环状DNASV40的生物学特性SV40可以与所有哺乳动物宿主细胞中的组蛋白H2、H3、H4结合，从而使其DNA形成类似核小体的微型染色体结构。 SV40感染猴细胞时呈裂解型，不致癌；但感染啮

11、齿类动物后，便发生非同源整合而致癌。猴多瘤病毒DNA（SV40）SV40的基因组DNA t / T基因编码病毒的小抗原和大SV40 DNAoriVP2TVP3VP1t抗原与病毒的致癌作用密切相关 SV40在裂解宿主细胞前的晚期状态时，每个宿主细胞含有105个病毒DNA拷贝，因此十分适合用于高效表达外源蛋白猴多瘤病毒DNA（SV40）SV40 DNA-质粒DNA杂合载体的构建 重组的SV40 DNA分子必须经过包装后才具有感染能力，因此插入的外源DNA片段不能太大。为了尽量提高SV40的装载量，必须删除一些基因片段，因此重组的SV40分子必须与野生型病毒共感染受体细胞，才能形成有感染力的重组病毒

12、颗粒。Aproriviral genegptSV40 oripV2-GPTpBR322pBR322SV40 pV2-GPT是一种SV40 DNA与大肠杆菌质粒DNA杂合的载体，其中gpt为细菌来源的谷氨酸-丙氨酸转氨酶基因，用于筛选重组子。该载体曾被成功地用于在猴肾细胞中表达有生物活性的兔b-珠蛋白.猴多瘤病毒DNA（SV40）利用SV40 DNA载体表达外源基因的程序SV40 载体病毒晚期基因启动子筛选标记ori缺陷的SV40 辅助病毒去除细菌序列插入外源基因重组分子分离病毒DNA转化筛选增殖感染猴多瘤病毒DNA（SV40）基因表达好 外源基因能高效表达SV40 DNA载体的特点基因重排高

13、病毒基因组和重组分子常发生重排和缺失现象宿主范围窄 只能转染猴细胞装载量较小3. 人乳多瘤病毒DNA（BKV） 人乳多瘤病毒（BKV）属于乳多瘤病毒科乳头瘤病毒属，其基因组为双链DNA，感染宿主细胞后基因不发生整合，独立于染色体而自人乳多瘤病毒的生物学特性主复制，每个宿主细胞最高可达500个拷贝。人乳多瘤病毒DNA（BKV）人乳多瘤病毒表达载体的构建BKV - E.coli 穿梭载体BKV oriBKV geneDREMMTPAp rE.coli oriSV40 PNeo r删除编码病毒核心蛋白和外壳蛋白的基因，并与大肠杆菌质粒拼接，构成穿梭载体，它不能整合，同时也不能形成成熟的病毒颗粒裂解受

14、体细胞。安装细胞色素P450 dioxin介导的增强子DRE，控制小鼠乳腺癌启动子MMTP，由其带动外源基因的表达。SV40来源的启动子控制Neor 标记基因，以G418筛选重组子。以此载体在人细胞系中表达b1-干扰素和单纯疱疹病毒B蛋白获得成功。4. 人牛痘病毒DNA 人牛痘病毒是一个大型DNA病毒，基因组长185 kb，能在宿主细胞质中自主复制。以前外源基因插在病毒基因组的非必需区内，构建人牛痘病毒的生物学特性出的重组病毒具有感染力，而且一经转染，外源基因即可在最邻近的病毒启动子的控制下高效表达。然而由于牛痘病毒基因组较大，体外DNA重组很困难，因此通常采用体内重组的方式进行。人牛痘病毒D

15、NA 目前广泛使用的牛痘病毒表达系统是一种预先构建好的重组病毒其基因组上插入了一个可表达的大肠杆菌T7RNA聚合酶编码基因。在人牛痘病毒DNA表达载体的构建外源基因导入受体细胞之前，先以上述的重组病毒感染细胞，使其大量表达T7RNA聚合酶，然后再将含有外源基因和T7启动子的细菌型重组质粒导入哺乳动物受体细胞，此时外源基因整合在受体细胞染色体DNA上，并在T7RNA聚合酶的作用下表达出重组蛋白。 人囊状纤维化基因就是采用这种战略高效表达的。人牛痘病毒DNA利用人牛痘病毒载体表达外源基因的程序牛痘病毒启动子T7 RNA聚合酶基因T7启动子外源基因细菌重组质粒感染转化培养收集哺乳动物细胞的物理转化法

16、哺乳动物细胞的病毒转染法（四）哺乳动物细胞的基因转移(1) 哺乳动物细胞的物理转化法 利用物理方法转化高等哺乳动物细胞的主要优点是外源基因表达盒中不含任何病毒基因序列，这对外源基因表达产物的分离纯化减轻了负担。但外源基因表达盒进入受体细胞后，往往以多拷贝的形式随机整合在染色体DNA上，导致受体细胞基因灭活、外源基因不表达。哺乳动物细胞的物理转化法 将待转化的DNA溶解在磷酸缓冲液中，加入CaCl2溶液混匀，此时DNA被包裹在磷酸钙晶体颗粒内；此时细胞膜形成吞噬泡，磷酸钙晶体局部溶解膜结构，DNA便进入受体细胞；1. 磷酸钙共沉淀法 将上述制备的颗粒悬浮液滴入细胞培养皿中，37保温4-16小时

17、弃去DNA溶液，加入新鲜培养基，继续培养7天即可筛选转化株。 如果在外源DNA中掺入少量的受体细胞内源性DNA可以提高转化效率。利用磷酸钙共沉淀法转化肿瘤病毒DNA，可使正常细胞转化为癌细胞，这是人们对肿瘤发生机制的最早理解。哺乳动物细胞的物理转化法 将待转化的DNA溶解受体细胞悬浮液中，然后加入电击转化仪的样品槽内，两端施加瞬时高压电场，使细胞膜产生细小的缝隙，此时 电击转化法常用于对磷酸钙共沉淀法无效的细胞类型，如生长在悬浮液中的淋巴细胞等。2. 电击转化法DNA片段便可不经过胞饮作用直接进入受体细胞。电转化设备哺乳动物细胞的物理转化法 将待转化的DNA溶解与天然或人工合成的磷脂混合，后者

18、在表面活性剂的存在下形成包埋水相DNA的脂质体结构。合，DNA随即进入胞质和核内。 利用上述程序曾将外源基因成功地导入了小鼠的淋巴细胞和HeLa3. 脂质体介导法 将这种脂质体悬浮液加入到细胞培养液中，便会与受体细胞膜融细胞。脂质体介导的基因转移技术脂质体(liposome)是用人工方法将磷脂和相似的两性脂质在水溶液中形成一种脂质双层包围水溶液的微球。哺乳动物细胞的物理转化法 血影细胞是指哺乳动物的红细胞在机械作用、病毒诱导、低渗环境下发生溶血，血红蛋白大量溢出，最后形成仅被细胞膜包裹的细胞同时，外源DNA也容易进入。当上述外界条件消失后，红细胞膜又可恢复原来的通透性。因此，可先将外源DNA转

19、入血影细胞，然后再将4. 血影细胞介导法核结构。在溶血过程中，红细胞膜的通透性大增，在血红蛋白溢出的血影细胞与受体细胞在适当条件下发生融合，从而将外源DNA转入受体细胞。(2) 哺乳动物细胞的病毒转染法 以病毒DNA为载体可以将外源基因直接转染或与野生型病毒颗粒共转染特定的受体细胞。这种方法具有定向性好、实验重复性佳、导入效率高等优点，但也存在一定的缺陷，如目前常用的载体宿主范围有限，往往无法转染一些具有重要经济价值的家禽和牲畜细胞等。提高哺乳动物细胞高效表达外源蛋白的基本方法利用哺乳动物工程细胞生产人源化的小鼠抗体利用哺乳动物工程细胞生产人组织型纤溶酶原激活剂利用哺乳动物工程细胞生产人凝血因

20、子VIII（五）提高哺乳动物细胞表达重组蛋白的方法及应用(1) 提高哺乳动物细胞高效表达外源蛋白的基本方法 目的基因在哺乳动物细胞，如CHO中的高效表达的策略主要针对三个方面来进行考虑：载体、目的基因和宿主细胞 一、载体改造 基因扩增是外源基因在哺乳动物细胞内高效稳定表达的一种特殊方式。氨甲喋呤（MTX）是动物细胞中的关键代谢酶二氢叶酸还原酶数细胞死亡，但在极少数幸存下来的抗性细胞中，dhfr基因均得以扩增。这些抗性细胞正是通过增加相关基因的拷贝数、提高关键代谢酶1.增加目的基因的拷贝数（DHFR）的特异性抑制剂，细胞培养物经氨甲喋呤处理后，绝大多的表达水平，从而抵消氨甲喋呤的抑制效应。更重要

21、的是，扩增的区哺乳动物细胞内的基因扩增现象域远远大于dhfr基因本身，即与dhfr基因相邻的DNA区域同时被扩增。1）运用共扩增基因做选择标记增加目的基因的拷贝数(1) 转录前水平DHFR-MTX高效表达系统外源基因dhfr转染dhfr -细胞系单克隆培养转移0.05 mM MTX培养单克隆转移培养单克隆转移5 mM MTX0.25 mM MTX培养单克隆外源基因扩增至100拷贝GS-MSX高效表达系统 谷氨酰胺合成酶（GS）能解除甲硫氨酸亚砜（MSX）对动物细胞的毒害作用。先将带有GS编码基因的载体转入培养的哺乳动物细中不必使用GS缺陷型的受体细胞，而且在正常的MSX浓度下就能筛选到含有高拷

22、贝外源基因的转染细胞，这是GS-MSX系统比DHFR-胞中，由于只有多拷贝的GS编码基因才能抗MSX，所以在转染过程MTX系统优越之处。具体实例：将选择基因通过一段寡聚核苷酸连在目的基因的3端（如图）。前体mRNA 在翻译时, 位于目的基因3端下游的共扩增基因的翻译起始的效率大大降低, 导致翻译水平明显低于上游的目的基因.2）通过选择基因的弱化表达增加拷贝数1）在载体上添加染色体上的某些特定序列 在载体上添加染色体上的某些特定序列（如骨架/ 基质附着区SAR/MAR) 使表达载体整合到宿主细胞的染色体后能模拟染色体的高转录活跃区，从而使形成的阳性克隆较均一地高效表达目的基因。2）基因定点整合至

23、高表达区 类似基因打靶，在重组酶的介导下定点整合到染色体转录活跃区2.整合位点的优化(2) 转录水平 转录水平的调控可以概括为顺式作用元件与反式作用因子的相互作用。它们分别由表达载体和宿主细胞提供。因此,表达载体的元件组成及结构是CHO 细胞高效表达外源基因的关键因素之一。 在载体上安装病毒或细胞来源的强启Ap rM13 oriColE1 oriCMVPPolylinkerGeneIntronSV40 TPolyA signal高效表达载体mRNA前体AAAAAAAAAmRNA动子和增强子，是使外源基因高效表达的一种手段，如： 细胞巨化病毒CMV的启动子（CMVP)SV40的终止子（SV40T

24、) 1.选择强启动子和增强子2.在目的基因编码区尾端添加强的终止子区域 其它强终止子：T抗原、乙型肝炎病毒表面抗原序列或2珠蛋白终止子等。1、选择高效多聚腺苷酸加尾信号( pA) 真核基因的hnRNA 的加工过程需要多聚腺苷酸加尾信号(pA)。前者多采用SV40 的晚期及早期pA、牛生长激素基因的pA 和人工合成的 pA. PolyA是mRNA由核进入胞质所必需的形式。 PolyA大大提高mRNA在胞质中的稳定性。 Poly(A)的作用: （3）转录后水平2.剪接信号的运用 绝大多数哺乳动物细胞的表达型载体上携带内含子结构，因为mRNA前体的剪切能促进成熟mRNA向胞质的运输，有利于翻译。 动

25、物珠蛋白基因的内含子、SV40的内含子2.提高转录因子的表达水平 转录因子通过 DNA 结合结构域特异识别并结合目标基因的调控序列， 并通过转录激活结构域激活或募集转录作用因子(如RNA聚合酶)至启动子从而增强基因的转录。(4) 翻译水平1、添加Kozak序列2、通过内部核糖体进入位点IRES表达多亚基蛋白3、通过翻译增强子提高翻译效率1. 添加Kozak序列 Kozak系统分析了mRNA的5端的序列与翻译效率的关系。结果表明：最有效的翻译起始的共有序列是5 CCA/GCCATGG3(划线的为起始密码子) ，而且最重要的是3位的嘌呤，其次是+ 4 位的G. 实验表明： 具有Kozak 序列与否

26、将使翻译起始的差异在一个数量级。 内部核糖体进入位点（IRES ）是从细小RNA 病毒中发现的，由它连接的开放阅读框架可以同时翻译。IRES 序列被广泛应用于构建双顺反子或多顺反子哺乳动物细胞表达载体。 用IRES 构建多个顺反子表达载体， 可以表达多亚基蛋白。2. 通过 IRES 表达多亚基蛋白3. 通过翻译增强子提高翻译效率 翻译增强子是具有与 IRES 不同二级结构的另一类提高翻译起始效率的顺式调控元件。1998 年stein 等发现在组织缺氧情况下 VEGF mRNA寿命大为提高。 VEGF 翻译增强的程度可高达40 倍，由此发现了翻译增强子。（1) 利用密码子的偏好性 根据密码子的偏

27、好性，在不改变蛋白质编码序列的前提下尽量使用CHO细胞常用的密码子对基因进行改造实例：Kim 等用人高表达基因偏爱的密码子系统地设计了人的EPO 基因， 再以酵母偏爱的密码子编码人的EPO基因作对照来比较优化后的人EPO 基因的表达效率。结果表明，优化的人EPO 基因密码子比非优化的人EPO 基因密码子的表达效率高23 倍。二、基因改造（2) 尽量使用基因组DNA 基因组DNA 比cDNA 表达量要高。 因此，在可能的条件下，尽量使用基因组DNA。 若用cDNA，则尽量切除cDNA中的不必要序列，一方面降低转录、翻译时不必要的能量消耗，另一方面减少5未翻译前导区和克隆中的GC 尾部对表达水平的

28、不良影响。三、宿主改造（1）增强 CHO 细胞抗细胞凋亡活性；（2）使 CHO 细胞可在无血清培养基（PFM） 中自分泌生长；（3）减少 CHO 细胞中有害代谢物的产生；（4）控制 CHO 细胞增殖速率； 迄今为止，已有大约300种重组蛋白药物正在进行临床试验，但在哺乳动物工程细胞中大规模生产的只有少数几种：b 干扰素g 干扰素凝血因子VIII凝血因子IX促红细胞生成素（EPO）人生长因子（hGH）白介素 2（IL-2）乙型肝炎表面抗原单克隆抗体 CD4受体组织型纤溶酶原激活剂（tPA）（2）利用哺乳动物工程细胞生产重组蛋白的实例1. 利用哺乳动物工程细胞生产人源化的小鼠抗体大多数恶性淋巴Neor鼠金属硫蛋白启动子b 肌动蛋白启动子抗体轻链cDNAb 肌动蛋白终止子pLdhfrSV40启动子b 肌动蛋白启动子抗体重链cDNAb 肌动蛋白终止子pH瘤细胞表面上都有一种特异性的糖蛋白campath，用人源化的小鼠抗campath抗体治疗非霍杰金淋巴细胞瘤患者，效果良好。重组抗体采用DHFR-MTX系统表达。2. 利用哺乳动物工程细胞生产人组织纤溶酶原激活剂 第一