基因工程工具酶(2)

1、关于基因工程的工具酶 (2)第一张，PPT共四十一页，创作于2022年6月第一节 限制性核酸内切酶 一. 限制性内切酶的发现Hamilton O. Smith 1968年，Smith等人首先从流感嗜血杆菌d株中分离出Hind II和Hind III 。1978年获得诺奖。 此前（20世纪50年代），研究人员在噬菌体感染大肠杆菌试验中发现了寄主细胞的限制和修饰现象（R/M体系） 。第二张，PPT共四十一页，创作于2022年6月二. 寄主的限制和修饰现象第三张，PPT共四十一页，创作于2022年6月 限制(Restriction)：指一定类型的细菌可以通过限制性内切酶的作用，破坏入侵的噬菌体DNA

2、，导致噬菌体的寄主幅度受到限制。 限制作用:实际就是限制性内切酶降解外源DNA，维护宿主遗传稳定的保护机制。第四张，PPT共四十一页，创作于2022年6月修饰(modification)：指寄主本身的DNA，由于在合成后通过甲基化酶的作用得以甲基化，使DNA得以修饰,从而免遭自身限制性酶的破坏。修饰作用:宿主细胞通过甲基化作用达到识别自身遗传物质和外来遗传物质的目的。第五张，PPT共四十一页，创作于2022年6月1）菌株中有三个连锁的基因位点：hsdR、 hsdM、 hsdS。2）hsdR编码限制性核酸内切酶-识别DNA分子特定位点，将双链DNA切断。 （DNA分子转化细胞：受体细胞去掉hsd

3、R基因位点）3）hsdM编码产物是DNA甲基化酶-催化DNA分子特定位点的碱基甲基化反应。4） hsdS表达产物的功能是-协助限制性核酸内切酶和甲基化酶，识别特殊的作用位点。 三. 限制和修饰作用的分子机制第六张，PPT共四十一页，创作于2022年6月第七张，PPT共四十一页，创作于2022年6月四. 限制性核酸内切酶的概念和命名 概念：一类能够识别双链DNA分子中的某种特定核苷酸序列，并由此切割DNA双链结构的核酸水解酶。 命名： 1973年H. O. Smith和D. Nathams首次提出了命名原则，1980年Roberts在此基础上进行了系统分类：用具有某种限制性酶有机体的属名第一个字

4、母(大写)和种名的前两字母(小写)组成3个字母的略语作为该酶的基本名称。如果酶是存在于特殊的菌株中，还应在第3个字母后面标注菌株名称的符号株或型(strain) 。如果一种特殊的菌株具有几个不同的限制与修饰体系，则以罗马数字表示该菌株中发现某种酶的先后次序。第八张，PPT共四十一页，创作于2022年6月Hind III属名 种名 株名 发现顺序 H i n d III嗜血流感杆菌（Haemophilus influenzae ） d 株所发现的第三个限制性内切酶。EcoR 来自于Escherichia coli RY13的第一个限制酶。举例+读法第九张，PPT共四十一页，创作于2022年6月五

5、. 限制性内切酶的种类识别序列切割序列限制酶的作用模型识别序列：是一段特殊的DNA序列，该序列与其对应的限制性内切酶结合，是该酶切割DNA的前提。切割序列：识别完成后，限制性内切酶实施切割作用所在的DNA序列。第十张，PPT共四十一页，创作于2022年6月型酶: 1968年，M. Meselson和R. Yuan在E. coli B和E. coli K中分离出的核酸内切酶。特征：分子量较大，反应需Mg2+、S-腺苷甲硫氨酸（SAM）、ATP等。这类酶有特异的识别位点但没有特异的切割位点，而且切割是随机的，所以在基因工程中应用不大。 由于切割的随机性，不能得到目的片段。第十一张，PPT共四十一页

6、，创作于2022年6月 型酶: 这类酶可识别特定碱基序列，并在这识别位点下游的3端2426 bp处切开DNA，所以它的切割位点也是没有特异性的。 型酶（重点）1970年，Smith和Wilcox在流感嗜血d株中分离出来的限制酶。 分子量通常较小，只有一种多肽，以同源二聚体的形式存在。反应只需Mg2+的存在。特点：（1）识别位点是一个回文对称结构，并且切割位点也在这一回文对称结构上。 （2）许多型酶切割DNA后，可在DNA上形成粘性末端，有利于DNA片段的重组。第十二张，PPT共四十一页，创作于2022年6月 型酶: 这类酶可识别特定碱基序列，并在这识别位点下游的3端2426 bp处切开DNA，

7、所以它的切割位点也是没有特异性的。 型酶（下节重点） 第十三张，PPT共四十一页，创作于2022年6月六. 型限制酶的基本特征绝大多数II型限制性内切酶都能识别由4-6个核苷酸组成的特定序列。6.1 每一种酶都有各自的特异识别序列限制性内切酶是在DNA分子双链的识别序列内切割DNA分子，因此识别序列又称为该限制性内切酶靶序列。 EcoR I: GAATTCBamH I: GGATCCPst I: CTGCAGSma I: GGGCCC第十四张，PPT共四十一页，创作于2022年6月六. 型限制酶的基本特征限制性内切酶II的识别序列具有双重（180度）旋转的对称结构，也就是说识别序列的核苷酸对是

8、呈回文结构。A G C G C TT C G C G AA C N G TT G N C A第十五张，PPT共四十一页，创作于2022年6月六. 型限制酶的基本特征习题：下列序列中哪些可能是II类限制酶的识别序列？ A：ATATCG B：CCCGGG C：GATATC D：AGCCGA2个方法：对折 or 写出互补链第十六张，PPT共四十一页，创作于2022年6月六. 型限制酶的基本特征6.2 限制酶的切割方式平末端的DNA片段5端具有粘性末端的DNA片段3端具有粘性末端的DNA片段切割位点位于识别序列的对称轴上，这样形式的断裂是形成具有平末端的DNA片断，不易重新环化。切割位点位于对称轴的两

9、侧，产生突出末端，在适当温度下，产生的末端可以退火互补，重新连接。C C C G G GG G G C C C55C C CG G GG G GC C C55Sma I第十七张，PPT共四十一页，创作于2022年6月六. 型限制酶的基本特征6.2 限制酶的切割方式第十八张，PPT共四十一页，创作于2022年6月识别序列切割位点粘性末端第十九张，PPT共四十一页，创作于2022年6月六. 型限制酶的基本特征6.3 限制酶的切割特点识别序列不同，切割方式也不同。EcoR I酶切产生的5粘性末端;Pst I酶切产生的3粘性末端；Pvu ll酶切产生的平头末端；第二十张，PPT共四十一页，创作于202

10、2年6月六. 型限制酶的基本特征6.3 限制酶的切割特点识别序列不同，切割方式也不同第二十一张，PPT共四十一页，创作于2022年6月第二十二张，PPT共四十一页，创作于2022年6月第二十三张，PPT共四十一页，创作于2022年6月六. 型限制酶的基本特征6.3 限制酶的切割特点识别序列不同，产生相同的粘性末端同尾酶。 一些限制性内切酶，它们虽然来源各异，识别的靶序列也各不相同，但都产生出相同的粘性末端，称之为同尾酶。 由一对同尾酶分别产生出的粘性末端共价结合形成的位点，称之为杂种位点(hybrid site)。实例（百度文库自学）：1. 利用三引物PCR和同尾酶连接的策略实现多基因片段的重

11、组。2. 同尾酶技术在构建疟疾多价重组DNA疫苗中的应用。 第二十四张，PPT共四十一页，创作于2022年6月 杂种位点（hybrid site）：由一对同尾酶分别产生的粘性末端共价结合形成的位点。 一般不能被原来的任何一种同尾酶识别。Bam H G GATC C Bcl T GATC A C CTAG G A CTAG T 杂种位点 T GATC C A CTAG G Sau3A第二十五张，PPT共四十一页，创作于2022年6月第二十六张，PPT共四十一页，创作于2022年6月六. 型限制酶的基本特征6.3 限制酶的切割特点识别简并序列 简并序列是指序列中有的核苷酸位点可以是不同的核苷酸。

12、例如：GTYRAC Y=C或T R=G或A Hind实际上可以识别4个特定序列。 第二十七张，PPT共四十一页，创作于2022年6月六. 型限制酶的基本特征6.3 限制酶的切割特点 识别序列相同，切割位点不同同位酶。 一些限制性内切酶，具有相同的识别位点，但切割部位不同，这类酶称为同位酶。Sma CCCGGGCCCGGGXma 双酶切 & 酶的价格第二十八张，PPT共四十一页，创作于2022年6月 一些来源不同的限制性内切酶，具有相同的识别位点和切割位点，这类酶称为同裂酶。 如：Hpa II / Msp I。 C CGGHpa II 不能切割Msp I 能够切割C*CGGC*CGG表示甲基化6

13、.3 限制酶的切割特点六. 型限制酶的基本特征第二十九张，PPT共四十一页，创作于2022年6月型限制性内切酶不具甲基化功能。、型限制性内切酶本身具有甲基化酶的功能。型限制性内切酶甲基化：由相应的甲基化酶承担。6.3 限制酶的切割特点GAATTCCTTAAGEcoR 甲基化酶AAEcoR 六. 型限制酶的基本特征第三十张，PPT共四十一页，创作于2022年6月七. 型限制酶的主要用途在特异位点上切割DNA，产生特异的限制酶片段。建立DNA分子的限制酶图谱。构建基因文库。用限制酶切出的相同粘性末端，以便重组。改建质粒。第三十一张，PPT共四十一页，创作于2022年6月八. 酶切反应的操作大部分I

14、I型限制性核酸内切酶需要相似反应条件： Tris-HCl 50mmol/L pH7.5 MgCl2 10mmol/L NaCl 0-100mmol/L DTT 1mmol/L Volume 20-100L Temperature 37 Time 1-1.5h 1个单位限制性核酸内切酶：在建议使用的缓冲液及温度下，在20L反应液中反应1h，使1g标准DNA完全消化所需的酶量。bufferHMKL ？第三十二张，PPT共四十一页，创作于2022年6月电泳紫外分析37 1h加反应液CKMBuffer (10X) 2.0 L （总体积决定）Water 16.5 L （可变）DNA 1.0 L or 1

15、.0 g （可变）Enzyme 0.5 -1.0 LVolume 20.0 L 1.0kb1.0kb0.4kb0.5kb0.6kbCKMTT八. 酶切反应的操作第三十三张，PPT共四十一页，创作于2022年6月对盐浓度要求相同的酶，原则上可以同时酶切。对盐浓度要求不同的酶，可采取下列方法：使用较贵的酶的盐浓度，加大便宜酶的用量，同时酶解。低盐酶先切，然后补加盐，高盐酶再切。一种酶先切，然后更换缓冲液，另一种酶再切。0.1倍体积的 5 M NaAc pH 5.4；2.5倍体积的冰冷乙醇；冰浴 5 分钟、高速冷冻离心10分钟、干燥；九. 联合酶解（双酶切）沉淀DNA的方法第三十四张，PPT共四十一

16、页，创作于2022年6月十. 影响限制性核酸内切酶活性的因素DNA样品的纯度 DNA样中混有蛋白质、苯酚、氯仿、乙醇、 SDS、 EDTA、NaCl等,都有可能抑制酶活性。 可采用以下方法，提高酶活性： 加大酶的用量，1g DNA用10U酶 加大反应总体积 延长反应时间第三十五张，PPT共四十一页，创作于2022年6月十. 影响限制性核酸内切酶活性的因素 DNA样品的甲基化程度 大肠杆菌中的dcm甲基化酶在5CCAGG 3或5CCTGG3序列中的胞嘧啶C5位上引入甲基，受其影响的酶有EcoR II等，但Bgl I、Kpn I不受影响。采用去甲基化酶的E. coli菌株来制备质粒DNA，可防止D

17、NA的甲基化。第三十六张，PPT共四十一页，创作于2022年6月十. 影响限制性核酸内切酶活性的因素 酶切反应的温度 多数标准反应温度是37，如Sma I为25或30，Sfi I为50 。 反应温度过度或过低都会影响酶活性，甚至导致酶失活。 DNA分子结构 某些酶切割超螺旋质粒DNA时，酶量比切割线性DNA时高出许多倍，最高可达20倍。第三十七张，PPT共四十一页，创作于2022年6月十一. 限制性内切酶的星活性高浓度的酶、高浓度的甘油、低离子强度、极端pH值等条件下，会使一些核酸内切酶的识别和切割序列发生低特异性变化即所谓的Star activity现象。 例如：EcoR I在正常条件下识别并切割 5GAATTC 3序列，但在甘油浓度超过5%（v/v）时，也可切割5PuPuATPyPy 3或者5AATT 3第三十八张，PPT共四十一页，创作于2022年6月十一. 限制性内切酶的星活性星活性产生的原因如下： 反应体系中甘油的浓度大于5%。 酶用量过大，大于100U/gDNA 低离子强度，小于25mmol/L 高pH，大于8.0 含有机剂如乙醇、二甲基亚砜、二甲基乙酰胺等。 Mn2+、Cu2+、Co2+、Zn2+等非Mg2+的二价离子的存在。 常发生星活性的内切酶有：EcoR I、Hind 、Kpn I、Pst I、Sal I、Hinf I等。