第4章植物细胞培养

1、第4章植物细胞培养第四章 植物细胞培养植物细胞培养（plant cell culture）： 指对植物器官或愈伤组织上分离出来的单细胞(或小细胞团)进行培养，形成单细无性系或再生植物的技术。优点：操作简便、重复性好、群体大等。分类：1.根据规模：小规模培养、大批量培养2.根据培养方式：悬浮培养、平板培养、看护培养、纸桥培养法3.根据要求的产物：诱变的细胞培养、生产次生产物的细胞培养引 言第四章 植物细胞培养植物细胞培养需要解决的问题（1）氧和二氧化碳的控制，过多氧过少氧均不利于生长；（2）营养物的供应；（3）细胞密度过高引起细胞团聚甚至分化，培养过程中细胞的分化的防止，（4）细胞取得中微生物的

2、去除；植物细胞培养的意义：（1）研究细胞生理代谢过程及各种影响因子；（2）用于植物品种的改良；（3）用于植物次生代谢物质的生产。细胞培养过程： 1. 择适宜的外植体； 2. 诱导疏松愈伤组织； 3. 选择适宜的培养基； 4. 悬浮培养； 5. 悬浮细胞的继代与选择； 6. 悬浮细胞的同步化； 7. 悬浮愈伤组织形成及植株再生。 第四章 植物细胞培养第一节 悬浮培养含义：将单个游离单细胞或小细胞团按一定密度悬浮在液体培养基中进行悬浮培养增殖的技术。由愈伤组织液体培养技术发展而来。第四章 植物细胞培养悬浮培养特点：1、培养细胞可不断增殖，且生长速度快，适于大规模培养及工业化生产有用的细胞次生代谢产

3、物。2、在液体培养基中，细胞和营养物质充分接触，细胞状态相对保持一致。3、大规模悬浮培养成本较高，因为它需要配置大型摇床、转床、连续培养装置、生物反应器、倒置显微镜等特殊设备。分批培养（Batch culture）分批培养含义： 分批培养是在一个封闭的系统中进行细胞培养，当培养物增加到一定量时，需继代培养，即取出少量培养物转接于新鲜培养液中。特点 培养基体积固定 培养过程中，细胞生长，其数目 不断发生变化，呈S增长。继代的方法和最佳时期继代方法： 用注射器或移管吸取一定量的含单细胞和小细胞团的悬浮培养物，并移到含有新鲜培养基的培养瓶里，继续进行培养。继代细胞生长曲线在整个培养过程中，细胞数目不

4、断发生变化，呈现出明显的由慢到快，再到慢，最后增长停止的细胞周期。细胞的生长呈S型曲线最佳继代时期滞后期对数生长期直线生长期缓慢期静止期培养时间培养细胞数目1234512345细胞生长各个时期的特点：缓慢期滞后期（延迟期） 细胞很少分裂，其长短与接种量大小和继代时原种细胞所处的生长期有关对数生长期细胞分裂活跃，细胞数目增加，增长速率保持不变直线生长期细胞生长和发育最明显的时期生长逐渐缓慢：培养液消耗将尽，有毒代谢物质增多，氧气减少静止期生长几乎处于停止状态，细胞数目增加极少，甚至开始死亡。讨论 （1）滞后期的长短主要取决于在继代时原种培养细胞所处的生长期和转入细胞数量的多少。（2）加入条件培养

5、基可以缩短滞后期。 条件培养基：曾培养过一段时间组织或细胞的培养基。（3）缩短两次继代时间间隔，则可使悬浮培养的细胞一直保持对数生长期。（4）如果使处在静止期的细胞悬浮液保持时间太长，则会引起细胞的大量死亡和解体。操作注意事项： 对悬浮培养细胞继代时，进液口的孔径要小，只能通过单细胞或小细胞团，使用吸管或注射器。 继代前，培养容器静置短时间，大细胞团沉降，再吸上层悬浮液。可建立良好的细胞悬浮培养物。连续培养(Continuous culture): 是用一定容积的非密闭系统进行细胞培养的方法，在培养过程中不断注入新鲜培养基，而使营养物连续得到补充，细胞生长和增殖连续进行，同时有等体积的培养物排

6、除系统。连续培养（Continuous culture）加入培养基排出培养基及其培养物 二者体积相等分：开放式连续培养 封闭式连续培养开放式和封闭式区别封闭式：排出液中的细胞用机械方法收集后，又放入原培养基，所以其培养细胞数目不断增加。开放式：在注入新鲜培养基的同时，培养细胞随同培养液一起流出，培养细胞数目保持恒定。连续培养意义：1、植物细胞代谢调节的研究。2、次生物质的大量生产。第四章 植物细胞培养植物细胞培养的特性（1）植物细胞较微生物细胞大得多，有纤维素细胞壁。（2）培养过程生长速度缓慢，易受微生物污染，需用抗生素；（3）细胞生长的中期及对数期易凝聚为团块，不能象微生物一样均匀分散，悬浮

7、培养较难；第四章 植物细胞培养（4）培养时需供氧。（5）细胞培养过程有结构与功能全能性,因而易分化。（6）悬浮培养中要求有一定的细胞浓度，否则不生长（25000-50000个/ML）。第四章 植物细胞培养悬浮培养步骤一、愈伤组织诱导二、悬浮系的建立与继代培养三、悬浮细胞的生长动态四、悬浮培养细胞的同步化细胞的悬浮培养(cell suspension culture) 是指将游离的植物细胞按一定的细胞密度，悬浮在液体培养基中进行培养的方法。1、起始悬浮液的制备愈伤组织液体培养基摇床振荡悬浮培养质地疏松，细胞分散程度大；质地紧密，细胞分散程度小，不适于悬浮培养转速30-150rpm防细胞破裂第四章

8、 植物细胞培养一、悬浮培养中起始物的建立选择适宜的外植体：幼胚、下胚轴、子叶。选择适宜的培养基：较高浓度；必要的附加物质。愈伤组织的要求：松散性好，增殖快，再生性强。第四章 植物细胞培养 悬浮培养物分散性良好，细胞团较小；均一性好，细胞形状和细胞团大小大致相同；细胞生长迅速，悬浮细胞的生长量一般2-3天增加1倍。二、悬浮系的建立与继代第四章 植物细胞培养四、悬浮培养细胞的同步化细胞同步化是指同一悬浮培养体系的所有细胞都同时通过细胞周期的某一特定时期。方法：分选法 梯度离心、过滤饥饿法 N、P同时饥饿处理一种海藻50 h，有二分之一的细胞处于G1期。加入DNA合成抑制剂，如5-氨基尿嘧啶。细胞不

9、能合成DNA，处于G1和S期。低温处理 - 4 DNA合成受阻，细胞趋向G1期五、影响细胞悬浮培养的因素1、基本培养基的组成（1）氮 硝酸盐是最常用的氮源。（2）磷 植物细胞能以各种方式吸收磷，其浓度是细胞分裂和生长的限制因子。（3）硫 硫的缺失使所有蛋白质合成自动停止。2、有机成分 氨基酸类、维生素类3、碳源 碳水化合物，二氧化碳4、植物激素 生长素，细胞分裂素，乙烯5、PH及渗透压，培养基成分、振荡频率第四章 植物细胞培养第二节 单细胞培养单倍体细胞培养主要包括三个方面：一为花药培养；二为小孢子培养；三为末受精的子房和卵细胞培养。第四章 植物细胞培养第二节 单细胞培养诱发植物产生单倍体主要

10、有四种方法：1、种间和属间杂交2、物理照射和化学诱变3、花药和花粉培养。可产生单倍体胚，或者先诱导单体愈伤组织再经适当途径产生单倍体植株。第四章 植物细胞培养第二节 单细胞培养单细胞培养方法：对分离得到的单个细胞进行培养，诱导其分裂增殖，形成细胞团，再通过细胞分化形成芽、根等器官或胚状体，直到长成完整植株的技术。细胞平板培养看护培养微室培养纸桥培养法植物单细胞培养方法：（一）平板培养法分散的植物细胞接种于含薄层固体培养基的培养皿内的培养过程称为平板培养法。优点：单细胞在培养基中分布均匀，便于在显微镜下对细胞进行定点观察。由于它具有筛选效率高、操作简便等优点，被广泛应用于细胞分裂、分化、生理生化

11、、遗传变异、次生代谢产物合成等。缺点：通气状况不好，排泄物质易积累造成毒害或影响组织吸收。第四章 植物细胞培养（二）看护培养Muir(1953)首创此法获得烟草单细胞体系。优点：简便易行，效果好。缺点：不能在显微镜下追踪细胞分裂、生长过程。指利用生长的愈伤组织所产生的物质来培养单细胞或者异种愈伤组织等的方法第四章 植物细胞培养三、微室培养在人工制造的无菌小室中，将一滴悬浮细胞液培养在少量培养基上，使其分裂增殖形成细胞团的方法。优点：可对培养细胞连续进行显微观察，了解一个细胞的生长、分裂、分化等过程。缺点：培养基少，营养和水分难以保持，PH变动幅度大，培养细胞仅能短期分裂。四、纸桥培养法 将滤纸

12、的两端浸入液体培养基中，使滤纸中间部分露出培养基表面，将所要培养的细胞放在滤纸的表面上培养。单细胞液体培养基滤纸单细胞的分离由完整的植物器官分离单细胞由培养组织（如愈伤组织）中分离单细胞1、由完整的植物器官分离单细胞机械法酶解法叶片是分离单细胞的最好材料机械法Ball&Joshi (1965)Noggle (1967)Joshi &Ball (1968)研究者和时间：研究材料：花生成熟叶片第一种方法：用刀片刮叶片具体方法:撕去下表皮露出叶肉细胞用解剖刀刮下细胞第二种方法：叶片研碎、离心研碎成粉加研磨介质过滤、离心 只有薄壁组织排列松散，细胞间结触点很少时用机械法分离叶肉细胞才能取得成功。酶解法

13、Takebe等（1968）最早报道：用果胶酶处理可以分离大量的叶肉细胞加果胶酶过滤、离心机械法和酶解法比较机械法酶解法细胞不受到酶的伤害；不用质壁分离；细胞产量低；细胞易破。细胞受到酶的伤害；要质壁分离；细胞产量高；细胞不易破。2、由培养组织（愈伤组织）分离单细胞材料：胡萝卜肉质根步骤：1 诱导产生愈伤组织2 愈伤组织反复继代，使组织不断增殖，提高愈伤组织的松散性；由愈伤组织分离单细胞的方法：1、将未分化、易散碎的愈伤组织转到有液体培养基的三角瓶中进行振荡培养，获得悬浮细胞液。2、用孔径为200um的无菌网过滤，4000RPM/M离心，除去比单细胞小的碎片，获得纯净的细胞悬浮液。3、用60-1

14、00UM的网过滤，再用20-30UM的网过滤，离心除去细胞碎片。4、回收获得的单细胞，并用液体培养基洗衣净，可用于培养。单倍体的应用价值：1、在植物育种中使后代迅速纯合、提高选择效率3、排除杂种优势对后代的影响、4、遗传研究的良好实验材料体系，消除致死原因5、突变体的筛选，选育新型自交系6、遗传转化的受体材料，基因表达研究的良好材料第四章 植物细胞培养第三节 培养细胞的次生代谢及产物积累一、概述植物次生代谢产物是指植物中一大类并非植物生长发育所必需的小分子有机化合物，其产生和分布通常有种属、器官组织和生长发育期的特异性。植物次生代谢产物种类酚类化合物含氮有机化合物萜类化合物其 它醌类黄酮类简单

15、酚类高等萜类低等萜类多炔类有机酸胺类生物碱生氰苷莨菪碱酪醇花青素紫草宁青蒿素人参皂甙AA类似物苦杏仁苷 类别 次生代谢产物 用途 黄酮 银杏黄酮，大豆黄酮 治疗心血管疾病 芦丁，槲皮素 食品添加剂和化妆品 醌 胡桃醌 抗菌，镇静 紫草宁 抗菌、抗炎、抗病毒、止血 简单酚类 香豆素 香料，抗菌消炎萜 类 紫杉醇 抗癌 青蒿素 抗疟疾生 物 碱 长春新碱 抗癌 奎宁 抗疟疾酚类化合物罂粟：吗啡、可卡因镇痛药物香豆素葡萄糖磷酸烯醇丙酮酸丙酮酸乙酰辅酶A甲戊二羟酸活性异戊二烯蒽醌甾类化合物萜类化合物甲瓦龙酸途径三羧酸循环有机酸脂肪族氨基酸生物碱多酮途径脂肪酸、环状化合物磷酸戊酸途径4-磷酸赤藓糖糖酵解

16、莽草酸莽草酸途径芳香族氨基酸黄酮生物碱第四章 植物细胞培养2.植物次生代谢产物在医药、食品、轻化工业等领域具有重要意义。 李时珍（1593）在本草纲目中所开列的1892种药物绝大多数是植物药物，其药物的有效成分均为次生产物。许多植物次生代谢产物是优良的食品添加剂和名贵化妆品原料，可以用于杀虫、杀菌，而对环境和人畜无害，是理想的环保产品。第四章 植物细胞培养3规模化细胞培养是生产植物次生产物的理想途径 保护生态环境 提高生产效率 发展新型生物技术产业来自于植物体和细胞培养的紫草宁含量比较生产方式生产周期紫草宁含量（干重）完整植株2-3年1-2植物细胞培养3 周14第四章 植物细胞培养次生代谢产物

17、的工业化生产20世纪40年代后期，首次报道银胶菊植物组织可获得橡胶。20世纪80年代以来，细胞大规模培养生产有用的物质，如药物、食品、调料、香精、颜料等再生资源。第四章 植物细胞培养植物次生代谢产品的市场潜能产品成分用途年销售额（亿美元）长春花碱治疗白血病18-20（美国）阿吗灵循环系统障碍药5-25（全世界）奎宁治疗疟疾5-10（美国）致热素杀虫剂20（全世界）毛地黄心脏病药20-55（全世界）紫杉醇：二萜类化合物最早由太平洋红豆杉Taxus brevifolia的树皮中分离广泛用于治疗卵巢癌、乳腺癌、非小细胞肺癌等十几种癌症目前主要来源于红豆杉属植物紫杉醇简介理化性质英文名：Paclita

18、xel, Taxol or TM分子式：C47H51NO4水溶性：ml稳定性：pH48 稳定；pH 8 易分解；在特定条件下紫杉醇可被氧化，但极难还原；紫杉醇研发过程年 代进 展1958 NCI开始大规模植物药研发筛选1967 发现紫杉醇抗癌活性1968 从红豆杉中分离出紫杉醇1971 完成结构鉴定1979 发表作用机制1983 临床试验1985 临床II期1991 临床III期1992 FDA批准上市NCI称其为过去15年中开发的最好的抗癌药物20世纪90年代抗肿瘤药的三大成就之一汤姆森科技桂冠奖Ramesh Panchagnula, International Journal of Pha

19、rmaceutics.1998(172)1-15.市场需求抗癌一线用药销售额年增长率5亿美元 理论需求量 2g /人, 500万人/年 1000kg/年实际销量350 kg/年紫杉醇供需相差十分悬殊 图1：国际紫杉醇原料药需求走势图（单位：公斤）图2：国际紫杉醇销售额（亿美元）紫杉醇开发的关键问题上游产业药源问题 下游制剂产业药效（活性、水溶性）安全性生物相容性药源问题红豆杉 主要原料植物 国家一级保护野生植物，全球十大濒危物种 之一生长缓慢 分布有限 Taxol含量低 树皮中Taxol含量:0.00001-0.069% 3000棵树=10吨树皮=1kg Taxol=500病人人工栽培 寻找红

20、豆衫的替代物 优点：生长周期缩短 简便、直接缺点：1、紫杉醇含量低 生长缓慢 2、提取工艺复杂药源问题解决办法（一）药源问题解决办法（二）化学合成全合成 1994年获得成功 现有六种途径半合成 以10-DAB和Baccatin 作为半合成原料获得紫杉醇 新方法用10-DAT 缺点：1、合成过程烦琐复杂，几十步 2、费用高，化学试剂昂贵 3、总收率太低（2%）优点：1、原料枝叶含量丰富、 提取相 对容易，充分利用再生资源 2、产率高 3、最具实用价值可以工业化生产 4、获取紫杉醇构效关系信息，进行结构改造缺点：合成过程相对复杂 （11步化学转化和7步分离）药源问题解决办法（三）生物方法组织和细胞

21、培养微生物发酵生物合成 研究阶段 红豆杉生物合成途径基本明确 10种相关酶基因被克隆表达 利用基因工程手段改造红豆杉提高紫杉醇产量 优点：1、摆脱自然因素，可长期稳定 生长 2、适应市场、方便调节 3、成分简单，有利于分离纯化 4、成本低、生长周期短 5、为半合成提供原料 6、有望工业化生产缺点：1、产量低、不稳定 2、工业化放大研究红景天是景天科(Crassulaceae)红景天属(Rhodiola L.)植物，为多年生草本或亚灌木，常具肉质匍匐根状茎。我国对红景天的应用已有很久的历史，在千金翼方、本草纲目、四部医典中早有记载。高山红景天(Rhodiola sachalinensis A.B

22、or)又名库页红景天，为景天科红景天属（Rhodiola L.）多年生草本植物，是长白山珍稀药用植物之一，具有增强记忆、改善心脑血管系统功能、增强免疫、抗疲劳、耐缺氧、抗肿瘤、降血糖、抗病毒、抗微波辐射。 以红景天为例UTP+葡糖糖-1-磷酸UDP-葡糖糖+pi尿苷转移酶UDP-葡糖糖+酪醇红景天甙+UDPUDP-葡萄糖基转移酶红景天甙生物合成最后一步反应机制已经清楚，植物体内的尿苷二磷酸葡萄糖基转移酶（UDP-glucosyltransferase，UDPGT，UGTs）以尿苷二磷酸葡萄糖（UDPG）和酪醇为底物催化合成红景天甙 表达量技术路线尿苷二磷酸葡萄糖基转移酶基因生物信息学分析 基因

23、及表达特性分析基因分离功能分析构建植物高效表达载体转化回高山红景天高山红景天UDP-葡萄糖基转移酶基因（UGT1）的分离及特性分析高山红景天UDP-葡萄糖基转移酶基因分离策略UGT1的全长cDNA序列总RNART高山红景天愈伤组织3 RACE简并引物5 RACE特异引物高山红景天UDP-葡萄糖基转移酶基因(UGT1)的克隆3 RACE扩增结果5 RACE扩增结果cDNA全长扩增结果500bpM 11.5KbM 11.1kbM 1UGT1（accession number: AY547304)；全长1598bp，含有完整的编码框，编码480个氨基酸。UGT1 基因的生物信息学分析UGT1基因特性

24、分析UGT1基因的Southern blot杂交分析 2.5Kb2.0KbBamH KpnUGT1基因的Northern blot杂交分析 18S28SC L高山红景天HPLC色谱图 C290.8L179.7TC-转基因愈伤；L-野生型植株叶片；TL-转基因植株叶片；C-野生型愈伤UGT1转化高山红景天及基因功能分析 红景天甙HPLC测定UGT1功能分析构建植物高效表达载体农杆菌介导法转化高山红景天UGT1基因潮霉素阳性愈伤组织的分子生物学检测PCR技术方案潮霉素阳性植株的分子生物学检测PCRPCR-SouthernPCR-SouthernSouthernNorthern植物高效表达载体pBS

25、UGT的构建UGT1BamH IKpn IHid+ BamHDigestionLigationBamH+KpnDigestionLigation750bpM1pBSROK酶切鉴定 1.5Kb3M42156781.6Kb3M4215678pBSUGT1酶切与PCR鉴定 高山红景天抗性选择标记潮霉素（Hyg）适宜浓度的确定 Hyg0潮霉素浓度为5mg/L时，外植体生长减慢，致死率达到50.17%；潮霉素浓度为10mg/L时，致死率高达93.0%；潮霉素浓度为15mg/L时，叶片全部死亡。 UGT1转基因抗性愈伤组织的遗传转化及筛选 DBCAUGT1转基因高山红景天植株的获得 ABC高山红景天转基因

26、材料分子鉴定1.6kbM71920RCKPCK1PCR鉴定 RCKPCK720PCR-Southern鉴定 高山红景天转基因愈伤组织分子鉴定2.0kb1.5kbPCK1920Southern鉴定 高山红景天转基因植株分子鉴定1.6kbM569RCKPCK2PCR鉴定 PCR-Southern鉴定 RCKPCK29高山红景天转基因材料分子鉴定及转基因高山红景天愈伤组织红景天甙含量的HPLC测定290.8CTC569.2TCLTLCTC-转基因愈伤；L-野生型植株叶片；TL-转基因植株叶片；C-野生型愈伤Northern鉴定 第四章 植物细胞培养高等植物提供的天然物质、性质及用途培养植物种属产物组

27、 莨菪属、蔓陀罗属 穿心莲属细胞生长后期积累托品类生物碱内酯、倍半萜类组 胡萝卜属快速生长期积累肉桂酸组 长春花属 烟草属与细胞生长平行积累长春花碱(治白血病)烟碱(杀虫剂)组 紫草稳定期积累紫草宁(抗癌药)第四章 植物细胞培养人参工业化生产幼茎、叶柄进行愈伤组织培养（固体培养）扩大培养（液体培养）平板培养（固体培养）扩大培养（液体培养）大量培养人参皂苷提取（定量、定性分析）建立细胞株选择高产细胞株培养基：MS+0.5mg/L 2,4-D温度：25、黑暗条件酶处理叶肉、根尖、髓组织愈伤组织转入增殖培养基液体MS+0.5mg/L 2,4-D转速80-90r/min，28光照在克氏瓶中加入10mL

28、悬浮液20-30黑暗培养初步鉴定液体培养，继代/5周28光照，80-90r/min多次重复鉴定植物次生代谢产物的提取与分离纯化1、细胞破碎2、提取3、沉淀分离4、层析分离5、萃取分离6、结晶7、浓缩与干燥第四章 植物细胞培养第四节 植物细胞的规模培养一、植物细胞规模化培养体系建立种细胞的选择种细胞系的增殖与放大大规模培养体系的建立第四章 植物细胞培养1. 种细胞的选择外植体选择： 植物类型、组织、器官高产细胞的建立：第四章 植物细胞培养2.种细胞系的增殖与放大培养目的：获得大量的活跃生长的细胞群体，为细胞大批量生产准备基础材料。方法：液体振荡培养，从几百毫升到几升逐级放大。第四章 植物细胞培养

29、 3、植物细胞大规模培养第四章 植物细胞培养半连续培养含义：在完成成批培养的一个周期后，只从反应器中取出大部分细胞悬液，保留小部分细胞悬液作为下一培养周期的种细胞，然后加入新鲜培养基进行培养。特点：可以节省种细胞培养成本，同时保留的培养液有利于细胞分裂启动。但细胞同步性不是很好。第四章 植物细胞培养固定化培养细胞固定化培养是指将游离的细胞包埋在多糖或多聚化合物制备成的网状支持物中，培养液呈流动状态进行无菌培养的一门技术。第四章 植物细胞培养 细胞固定化培养技术按照其支持物不同可以分为两大类： 包埋式固定化培养系统：支持物多采用琼脂、琼脂糖、藻酸盐b、聚丙烯酰胺等； 附着式固定化培养系统：支持物

30、采用尼龙网、聚氨酯泡沫、中空纤维等材料。 固定化细胞生物反应器第四章 植物细胞培养固定化细胞生物反应器优点细胞固定在支持物上，培养基不断更换，可以在培养基中提取产物，免除了培养基中因含有过多的次生产物而对细胞代谢产生的反馈机制。可以较容易地控制培养系统的理化环境，从而研究特定的代谢途径，便于调节,有利于次生产物的合成由于细胞固定在一定的介质中，可以不断提取产物，即可以进行连续生产。第四章 植物细胞培养二、植物细胞大规模培养的技术要求： 1.培养的细胞在遗传上应是稳定的，以得到产量恒定的产物； 2.细胞生长及生物合成的速度快，在较短的时间内能得到较高产量的终产物； 3.代谢产物要在细胞中积累而不

31、被迅速分解，最好能将其释放到培养基中。第四章 植物细胞培养两相培养技术两相培养技术：是在培养体系中加入水溶性或脂溶性的有机物或者具有吸附作用的多聚化合物，使培养体系形成上、下两相，细胞在水相中生长，合成的次生代谢产物分泌出来后转移至有机相中。两相培养技术的优点：减少产物的反馈抑制作用，提高产物含量（促进储存在细胞内部的产物分泌）；通过有机相的不断回收及循环使用，实现培养的连续化。第四章 植物细胞培养建立植物细胞的两相培养系统必需满足以下条件添加的有机物或多聚化合物对植物细胞无毒，不会影响细胞的生长和产物的合成。产物能较容易地被有机物吸附或溶解于有机相中。两相之间的分离容易。有机物或多聚化合物不

32、能吸收培养基中的有效成分。两相培养的应用举例紫杉醇细胞两相培养第四章 植物细胞培养实验材料：采用东北红豆杉细胞系，培养基采用某些成分加倍后的B5培养基，附加水解酪蛋白等成分。有机溶剂采用十六烷、油酸等对产物有大的分配系数的物质。生产过程与紫杉醇的含量分析：结果：胞内含量：0.893mg/L;胞外培养液:0.75mg/L;有机相中。第四章 植物细胞培养三、人工种子的概念及意义人工种子（artificial seed）是指通过植物组织培养的方法获得的具有正常发育能力的材料，如胚状体，外面再包有特定物质，通常是一层有机的薄膜包装，这种与天然种子相类似的人工合成种子称作人工种子或无性种子和人造种子。第

33、四章 植物细胞培养 具有繁殖速度快、结构完整等特点体细胞胚可以固定F1代杂种优势。为一些不能采用种子繁殖的园艺作物开辟了良种繁育的新途径。（一）、人工种子意义第四章 植物细胞培养（二）、人工种子的制作程序 体细胞胚的诱导及同步化控制 人造胚乳及人造种皮研制及包埋 人工种子的贮存及萌发第四章 植物细胞培养人工种子的制作程序 高质量体细胞胚发生系统的建立 体细胞胚胎发生的同步化控制化学抑制法、低温抑制法、机械过筛选择法、渗透压选择法、应用植物胚性细胞分级仪第四章 植物细胞培养（三）、人造种皮及人造胚乳研制及包埋 人造种皮的研制 对人造种皮总的要求是：能保持胚状体的活力，利于萌发和贮藏。 因此，所选

34、的材料要有韧性，耐压，对胚状体无毒害作用，含有胚状体发芽生长所需的营养成分或植物激素，还应含有杀菌剂以防止播种后土壤微生物的侵染。张桂芳中草药 2011第四章 植物细胞培养人造种皮及人造胚乳研制及包埋 人造胚乳的研制人造胚乳的主要成分为无机盐、碳水化合物及蛋白质等营养物质。 人造种子的包埋技术的研制最佳的包埋材料是藻酸盐包埋方法有滴注法和装模法四、人工种子研究历史 *1978年Murashige提出人工种子概念 *1986年Redenbaugh等成功地利用藻酸钠包埋单个体细胞胚，生产人工种子。 *胡萝卜、棉花、玉米、甘蓝、莴苣、苜蓿等人工种子制作获得成功。 *在我国人工种子的研究已列入国家高新

35、技术研究与发展计划（863 计划），并已取得一些重要的研究成果。 五、人工种子各部分功能 1 体细胞胚 2人工胚乳 可向人工胚乳内自由添加有利于胚状体正常萌发所需的各种营养成分、防病虫物质、植物激素等，也是人工种子优越于天然种子之处。 3、人工种皮 六、人工种子种类 根据包裹体细胞胚材料的不同，可以将人工种子分为以下4种类型（Redenbaush等，1991）。 （1）裸露的或休眠的繁殖体，可以直接播种，如休眠微型薯等。 （2）人工种皮包裹的繁殖体。 （3）水凝胶包埋的胚状体、不定芽以及休眠的小鳞茎等繁殖体，水凝胶中可含多种养分和激素，促进繁殖体的生长。 （4）液胶包埋的繁殖体。 （海藻酸钙凝

36、胶）（云杉）七、人工种子与天然种子比较有其自身的特点： （1）可对一些自然条件下不结实的或种子很昂贵的植物进行繁殖。 （2）固定杂种优势，使Fl杂交种可多代利用，使优良的单株能快速繁殖成无性系品种，从而大大缩短育种年限。 （3）在人工种子的包裹材料里加入各种生长调节物质、菌肥、农药等，可人为地影响控制作物生长发育和抗性。 (4)可以保存及快速繁殖脱病毒苗，克服某些植物由于长期营养繁殖所积累的病毒病等。 (5)与试管苗相比成本低，运输方便(体积小)，可直接播种和机械化操作。 *人工种子制备包括胚状体的诱导与同步化、人工种子的包埋、人工胚乳的制作、人工种皮的制作、人工种子贮藏等步骤内容。 1、高质

37、量和高产量的体细胞胚诱导与同步化控制 体细胞胚的诱导与同步化控制方法： 八 人工种子的研制体细胞胚诱导与同步化控制 苜蓿体细胞胚的生产与植株的获得www.plant.uoguelph.ca/research/embryo/embryo.htm 2、人工种子包埋 进行包埋时应做到以下几点： （1）包埋材料必须对体细胞胚无损害和无毒性，并能保护胚和胚发芽的能力，成本低廉； （2）同时在制造、贮藏、运输和种植过程中必须具有耐久性，一定的硬度； （3）胶囊必须含有养分和植物激素以及植物生长和发育所需的成分和水分，以保证体细胞胚的正常萌发；（4）人工种子适合于农业机械化播种。 a 成熟的体细胞胚；b 用无菌吸管吸取与包埋剂混合的体细胞胚 c 带体细胞胚的液滴滴入2CaCl2溶液后形成的白色半透明的包埋丸； d 人工种皮包埋制成的人工种子 人工种子的制备3 包埋方法： 经研究认为藻酸盐所形成的胶囊是目前最好的凝胶包埋材料，所采用的主要方法是滴注和装膜两种。 （1）滴注法 制备人工种子是将选择好的体细胞胚悬浮于含2%3%的藻酸钠溶液中，然后用一个塑料吸管吸注含体细胞胚的藻酸钠悬滴加入到2溶液中，这时离子间发生交换而形成胶囊，胶囊的直径依赖于吸管的内径和吸注的速度，胶囊的大小，视体细胞胚的大小和发芽能力而定，一般采用吸管口径为34 mm