仪器分析 第13章 色谱分析法导论

1、仪器(yq)分析色谱分析(s p fn x)法导论共五十二页第13章 色谱分析(s p fn x)法导论1、概述2、色谱分离(fnl)原理3、色谱法常用术语4、色谱法基本理论5、分离度6、色谱法的定性和定量分析共五十二页教学要求1、熟悉(shx)色谱法的分离原理2、掌握色谱法的常用术语3、熟悉色谱法的基本理论4、掌握分离度及其计算方法5、掌握色谱的定性和定量方法共五十二页13-1 色谱法概述(i sh)一. 色谱法的起源 俄国植物学家茨维特在1906年使用的分离植物的色谱原型装置，如图。 色谱法是一种分离技术。 固定相：色谱柱中填充的固体的物质； 流动相：携带着试样混合物流过固定相表面的流体（

2、液体或气体）。 试样混合物的分离过程(guchng)，实质是试样中各组分在色谱分离柱中的两相之间不断进行着的分配过程(guchng)。共五十二页二、色谱法分类(fn li)1、按流动相的状态分类 （1）气相色谱：流动相为气体（称为载气）。 按分离柱不同(b tn)可分为：填充柱色谱和毛细管柱色谱； 按固定相的不同又分为：气固色谱和气液色谱共五十二页（2）液相色谱(s p)液相色谱：流动相为液体（也称为淋洗液）。按固定相的不同分为(fn wi)：液固色谱和液液色谱。离子色谱：以离子交换树脂为固定相，不同pH值的水溶液为流动相。亲和色谱法：固定相对蛋白质有特殊亲和力尺寸排阻色谱法：固定相是分子筛凝

3、胶色谱法：固定相是凝胶（3）超临界色谱流动相为超临界流体。共五十二页2.按固定相特点(tdin)分类(1)平面(pngmin)色谱* 薄层色谱* 纸色谱（2）柱色谱* 凝胶色谱法* 高效毛细管电泳（90年代快速发展、特别适合生物试样分析分离的高效分析仪器）共五十二页3、按分离(fnl)机制分类吸附色谱法：固体相是固体，分离作用(zuyng)是吸附性的差异。分配色谱法：固定相是液体，分离作用是溶解性的差异。离子交换色谱法：固定相是离子交换剂，分离作用是离子交换。尺寸排阻色谱法：固定相是多孔性物质，分离作用是孔径对组分的陷阱作用差异。共五十二页三. 色谱法的特点(tdin)（1）分离(fnl)效率

4、高： 复杂混合物，有机同系物、异构体、手性异构体。（2） 灵敏度高： 可以检测出g.g-1(10-6)级甚至ng.g-1(10-9)级的物质量.（3） 分析速度快： 一般在几分钟或几十分钟内可以完成一个试样的分析。（4） 应用范围广： 能分析几乎所有的化学物质。 不足之处：分离易、定量易，定性难。共五十二页共五十二页13-2、色谱法的基本原理 当流动相中携带的混合物流经固定(gdng)相时，其组分与固定(gdng)相发生相互作用。 由于混合物中各组分在性质和结构上的差异，与固定相之间产生的作用力的大小、强弱不同。 随着流动相的移动，混合物在两相之间经过反复多达103106次的分配平衡，使得各组

5、分中作用力大的移动慢、作用力小的移动快，被固定相保留的时间不同，从而按一定次序由固定相中流出，结合适当的柱后检测方法，实现混合物中各组分的分离与分析。色谱法基础：两相；组分在两相间相对运动。共五十二页色谱(s p)分离原理示意图(1)流动(lidng)相+试样(2)流动相(3)流动相(4)流动相(5)流动相A+BA+B 色谱柱 B AA+BB ABAB检测器记录仪共五十二页一、分配(fnpi)系数 K 组分在固定相和流动相间发生的吸附、脱附，或溶解、挥发的过程叫做分配过程。在一定温度下，组分在两相间分配达到平衡时的浓度(nngd)（单位：g / mL）比，称为分配系数，用K 表示，即：共五十二

6、页分配(fnpi)系数 K的讨论 一定温度下，组分的分配系数K越大，出峰越慢；试样一定时，K主要取决于固定相性质；每个组份在各种固定相上的分配系数K不同；选择适宜的固定相可改善(gishn)分离效果；试样中的各组分具有不同的K值是分离的基础；某组分的K = 0时，即不被固定相保留，最先流出。共五十二页二、容量因子k与分配(fnpi)系数K 分配系数K：组分(zfn)在两相间的浓度比；容量因子k：平衡时，组分在各相中总的质量比； k =MS / MmMS为组分在固定相中的质量，Mm为组分在流动相中的质量。容量因子k与分配系数K的关系为： 式中为相比。 填充柱相比：635；毛细管柱的相比：5015

7、00容量因子越大，保留时间越长。可由保留时间计算出容量因子，两者有以下关系：共五十二页13-3、气相色谱图及有关(yugun)术语（一）色谱图中的基本参数一差二K三高三宽四保共五十二页（二）气相色谱常用(chn yn)术语 1流出曲线和色谱峰 由检测器输出的电信号强度对时间作图，所得曲线称为色谱流出曲线。曲线上突起部分就是色谱峰。 如果进样量很小，浓度很低，在吸附等温线（气固吸附色谱）或分配等温线（气液分配色谱）的线性范围内，则色谱峰是对称的。 鬼峰(怪峰)：没有进样的情况下突然出峰。共五十二页2. 基线 在实验操作条件下，色谱柱后没有样品组分流出时的流出曲线称为基线，稳定的基线应该是一条水平

8、直线 噪音：基线上下微小波动。 基线漂移：基线持续向上，或持续向下偏移。3. 峰高h 色谱峰顶点与基线之间的垂直距离4. 保留值 (1) 死时间 t0 或TM 不被固定相吸附或溶解的物质(如空气、甲烷(ji wn)进入色谱柱时，从进样到出现色谱峰极大值所需的时间称为死时间，它正比于色谱柱的空隙体积。共五十二页 因为这种物质不被固定相吸附或溶解，故其流动速度将与流动相流动速度相近。测定流动相平均线速时，可用柱长L与t0的比值计算，即 = L/tW (2). 保留时间tR 试样从进样到柱后出现峰极大点时所经过的时间，称为保留时间。 tR包含组分的过柱时间和组分被固定相作用而滞留的时间 (3). 调

9、整保留时间tR 某组分的保留时间扣除死时间后，称为该组分的调整保留时间，即 tR= tR tW * 保留时间是色谱法定性(dng xng)的基本依据。共五十二页(4) 死体积V0 死时间内所需消耗流动相的体积。 指色谱柱在填充后，柱管内固定相颗粒(kl)间所剩留的空间、色谱仪中管路和连接头间的空间以及检测器的空间的总和。当后两相很小可忽略不计时，死体积可由死时间与色谱柱出口的载气流速Fco（cm3min-1）计算。V0 = t0Fco式中 Fco为扣除饱和水蒸气压并经温度校正的流速。仅适用于气相色谱，不适用于液相色谱。共五十二页(5). 保留体积Vr 指从进样开始到被测组分在柱后出现浓度极大点

10、时所通过的流动相的体积。保留(boli)时间与保留(boli)体积关系： Vr= tr Fo(6). 调整保留体积Vr 某组分的保留体积扣除死体积后，称为该组分的调整保留体积。 Vr = Vr V0 = tr Fo 共五十二页(7). 相对保留值r2,1 或 某组分2的调整(tiozhng)保留值与组分1的调整保留值之比，称为相对保留值。 r2,1= tr2 / tr1= Vr2 / Vr1 由于相对保留值只与柱温及固定相性质有关，而与柱径、柱长、填充情况及流动相流速无关，被广泛用作定性的依据。 在定性分析中，通常固定一个色谱峰作为标准（s），然后再求其它峰（i）对这个峰的相对保留值，此时可用

11、符号表示，即 = tr (i) / tr (s) 式中tr (i)为后出峰的调整保留时间，所以总是大于1的。相对保留值往往可作为衡量固定相选择性的指标，又称选择因子。共五十二页5.色谱(s p)峰区域宽度 色谱峰的区域宽度是色谱流出曲线的重要参数，用于衡量柱效率及反映色谱操作条件的动力学因素。 表示色谱峰区域宽度通常有三种方法。(1).标准偏差 即0.607倍峰高处色谱峰宽的一半。(2).半峰宽W1/2 即峰高一半处对应的峰宽。它与标准偏差的关系为： W1/2=2.354(3).峰底宽度W 即色谱峰两侧拐点上的切线在基线上截距间的距离。它与标准偏差的关系是： W = 4 共五十二页 色谱曲线的

12、含义： (i) 根据色谱峰的个数，可以判断样品中所含组分的 最 少个数； (ii) 根据色谱峰的保留值，可以进行定性分析； (iii) 根据色谱峰的面积或峰高，可以进行定量分析； (iv)色谱峰的保留值及其区域(qy)宽度，是评价色谱柱分离效能的依据； (v) 色谱峰两峰间的距离，是评价固定相（或流动相）选择是否合适的依据。共五十二页 色谱分析之目的：将样品中各组分完全分离。 完全分离之前提：两峰间距足够远。 什么因素决定两峰间距？组分在两相间的分配(fnpi)系数差异，即色谱过程的热力学性质。 两峰有一定间距就能分开吗？窄峰可能，宽峰或不能。 什么因素影响峰的宽窄？组分在色谱柱中传质过程和扩

13、散现象，即色谱过程的动力学性质。 色谱理论即从热力学和动力学两方面来研究色谱行为。13-4 色谱法理论(lln)基础共五十二页1、塔板理论要点：(1) 将色谱分离过程比拟为蒸馏塔(2) 将色谱柱划分为许多小段，每段相当于一块塔板(3) 流动相脉冲式推进，每一次通过一块塔板(4) 组分在塔板内的两相之间相瞬间达成(dchng)分配平衡(5) 样品组分除随流动相运动之外，不会扩散一、色谱(s p)的热力学原理-塔板理论共五十二页2、柱效指标(zhbio)：塔板数n、塔板高度H 单位柱长的塔板数越多，表明(biomng)柱效越高。 用不同物质计算可得到不同的理论塔板数。 组分在tM时间内不参与柱内分

14、配。需引入有效塔板数和有效塔板高度：共五十二页3、塔板理论的特点(tdin)和不足： (1)当柱长一定时，塔板数n越大，塔板高度H 就越小，被测组分在柱内被分配的次数越多，柱效能则越高，所得色谱峰越窄。 (2)不同物质在同一色谱柱上的分配系数不同，用有效塔板数和有效塔板高度作为衡量柱效能的指标时，应指明测定物质。 (3)柱效不能表示被分离组分的实际分离效果，当两组分的分配系数 K 相同时，无论该色谱柱的塔板数多大，都无法分离。 (4)塔板理论无法解释同一色谱柱在不同的载气流速下柱效不同的实验结果，也无法指出影响(yngxing)柱效的因素及提高柱效的途径。共五十二页二、色谱的动力学原理-速率理

15、论影响(yngxing)柱效的因素 1、速率方程（也称范.弟姆特方程式）:H = A + B/u + Cu H-理论塔板高度（H越小，塔板数n越多） u-载气的线速度(cm/s) 减小A、B、C三项可提高(t go)柱效； 存在着最佳流速u； A、B、C 三项，各与哪些因素有关？共五十二页1.涡流扩散项A（也称多径项，固定(gdng)相的影响） A = 2dp dp：固定相的平均(pngjn)颗粒直径：固定相的填充不均匀因子 固定相颗粒越小dp，填充的越均匀，A，H，柱效n。当涡流扩散现象减轻时，色谱峰较窄。固定相的缝隙越大，涡流扩散越严重，延长滞留时间，峰变宽。共五十二页2.分子(fnz)扩

16、散项B（也称纵向扩散项，组分在两相间扩散） B = 2 Dg : 弯曲因子，固定相的阻碍。填充柱1；毛细柱1 Dg: 试样组分分子在气相中的扩散系数（cm2s-1）。由于(yuy)分子在柱内扩散，产生纵向浓度差：a. 分子扩散导致色谱峰变宽，H(n)，分离变差。b. 分子扩散项与流速有关，流速，滞留时间，扩散c. 扩散系数Dg与分子量的平方根成反比；M载气，B值影响因素有：填充物、分子量、温度、流速共五十二页3.传质阻力项 C（组分在两相间(xingjin)分配阻力） 组分在气相和液相两相间进行反复分配时，遇到阻力(zl)。 传质阻力包括气相传质阻力Cg和液相传质阻力CL ，液相传质阻力大于气

17、相传质阻力。 C =（Cg + CL） 影响因素有：流动相粘度、固定液厚度、流速共五十二页4. 载气流速(li s)与柱效-最佳流速 载气流速(li s)高时： 传质阻力项是影响柱效的主要因素，流速，柱效,右图曲线的右边。 载气流速低时： H - u曲线与最佳流速： 由于流速对这两项完全相反的作用，流速对柱效的总影响使得存在着一个最佳流速值，即速率方程式中塔板高度对流速的一阶导数有一极小值。 以塔板高度H对应载气流速u作图，曲线最低点的流速即为最佳流速。 分子扩散项成为影响柱效的主要因素，流速 ，柱效 ，右图曲线的坐边。共五十二页5. 速率(sl)理论的要点 (1)组分分子在柱内运行的多路径与

18、涡流扩散、浓度梯度所造成的分子扩散及传质阻力使气液两相间的分配(fnpi)平衡不能瞬间达到等因素是造成色谱峰扩展柱效下降的主要原因。 (2)通过选择适当的固定相粒度、载气种类、液膜厚度及载气流速可提高柱效。 (3)速率理论为色谱分离和操作条件选择提供了理论指导。阐明了流速和柱温对柱效及分离的影响。 (4) 各种因素相互制约，如载气流速增大，分子扩散项的影响减小，使柱效提高，但同时传质阻力项的影响增大，又使柱效下降；柱温升高，有利于传质，但又加剧了分子扩散的影响，选择最佳条件，才能使柱效达到最高。共五十二页13-5 分离(fnl)度（R 或 Rs） 塔板理论和速率理论都难以描述难分离物质对的实际

19、分离程度。即柱效为多大时，相邻两组分能够被完全分离。 难分离物质对的分离度大小受色谱过程(guchng)中两种因素的综合影响：保留值之差色谱过程(guchng)的热力学因素； 峰的宽度色谱过程的动力学因素。 色谱分离中的四种基本情况如图所示： K分配系数差值大，柱效较高，完全分离; K小，柱效较高，峰较窄，基本上分离； K较大，但柱效较低，分离效果不佳； K小，柱效也低，分离效果更差。共五十二页分离(fnl)度的表达式：R =0.8：两峰的分离程度可达89%；R =1.0：分离程度98%；R =1.5：达99.7%（相邻(xin ln)两峰完全分离的标准）。共五十二页分离(fnl)度与塔板数的

20、关系共五十二页例题(lt)1： 在一定条件下，两个组分的调整保留时间分别为85秒和100秒，要达到完全分离，即R=1.5。计算需要(xyo)多少块有效塔板。若填充柱的塔板高度为0.1 cm，柱长是多少？解： r21= 100 / 85 = 1.18 n有效 = 16R2 r21 / (r21 -1) 2 = 161.52 (1.18 / 0.18 ) 2 = 1547（块）L有效 = n有效H有效 = 15470.1 = 155 cm即柱长为1.55米时，两组分可以得到完全分离。共五十二页例题(lt)2： 在一定条件下，两个组分的保留时间分别为12.2s和12.8s，如果理论塔板数为3600，

21、计算(j sun)其分离度。要达到完全分离，即R=1.5，所需要的柱长。解：分离度：塔板数增加一倍，分离度增加多少？共五十二页共五十二页13-6 色谱的定性分析(dngxngfnx)、定量分析一、定性分析定性分析：判定组分的化学成分是什么物质。定性的原理：利用物理常数的一致性来佐证。 保留时间 tR 相对保留值 r2,1 标准物与样品(yngpn)对照法 化学方法 其它可定性的仪器 共五十二页一、定性分析(dngxngfnx)1.利用(lyng)纯物质定性的方法 (1)利用保留值定性：通过对比试样中具有与纯物质相同保留值的色谱峰，来确定试样中是否含有该物质及在色谱图中位置。不适用于不同仪器上获

22、得的数据之间的对比。 (2)利用加入法定性：将纯物质加入到试样中，观察各组分色谱峰的相对变化。 2.利用文献保留值定性 相对保留值r21：相对保留值r21仅与柱温和固定液性质有关。在色谱手册中都列有各种物质在不同固定液上的保留数据，可以用来进行定性鉴定。共五十二页一、定性分析3.保留(boli)指数 又称Kovats指数（），是一种重现性较好的定性参数。测定方法： 将正构烷烃作为标准，规定其保留指数为分子中碳原子个数乘以100（如正己烷的保留指数为600）。 其它物质的保留指数（IX）是通过选定两个相邻(xin ln)的正构烷烃，其分别具有Z和Z1个碳原子。被测物质X的调整保留时间应在相邻两个

23、正构烷烃的调整保留值之间如图所示：共五十二页保留(boli)指数的计算方法共五十二页3.与其他(qt)分析仪器联用的定性方法色谱(s p)-质谱联用仪（GC-MS；LC-MS）色谱-红外光谱联用仪；组分的结构鉴定SampleSample 58901.0 DEG/MINHEWLETTPACKARDHEWLETTPACKARD5972AMass Selective DetectorDCBA ABCDGas Chromatograph (GC)Mass Spectrometer (MS)SeparationIdentificationBACD共五十二页二、 色谱定量分析(dnglingfnx)方法1

24、. 峰面积的测量 （1）峰高（h）乘半峰宽（Y 1/2）法：近似(jn s)将色谱峰当作等腰三角形。此法算出的面积是实际峰面积的0.94倍： A = 1.064 hY1/2 （2）峰高乘平均峰宽法：当峰形不对称时，可在峰高0.15和0.85处分别测定峰宽，由下式计算峰面积： A = h（Y 0.15 + Y 0.85 ）/ 2 （3）峰高乘保留时间法：在一定操作条件下，同系物的半峰宽与保留时间成正比，对于难于测量半峰宽的窄峰、重叠峰（未完全重叠），可用此法测定峰面积： A = hbtR （4）自动积分和微机处理法共五十二页2. 定量(dngling)校正因子 试样中各组分质量与其色谱峰面积成正比，即： m i = fi Ai 绝对校正因子：比例系数f i ，单位面积对应的物质量： f i =m i / Ai 定量校正因子与检测器响应值成倒数关系(gun x)： f i = 1 / Si 相对校正因子f i ：即组分的绝对校正因子与标准物质的绝对校正因子之比。 当mi、mS以摩尔为单位时，所得相对校正因子称为相对摩尔校正因子（f M）,用表示；当mi、mS用质量单位时, 以（ W）,表示。 f i 既可测量计算，也可查色谱手册共五十二页3. 常用(chn yn)的几种定量方法 （1）归一化法： 特点及要求：