甘蓝型油菜茎秆木质素与抗性性状的相关性研究及全基因组关联分析

1、甘蓝型油菜茎秆木质素与抗性性状的相关性研究及全基因组关联分析甘蓝型油菜(Brassica napus L,2n=4x=38,AACC) 是由白菜型油菜(B.rapa,2n=2x=20,AA) 与甘蓝 (B.oleracea,2n=2x=18,CC) 自然杂交后双倍化得到的异源四倍体物种。它富含油脂和蛋白质, 是全世界范围内广泛种植的重要油料作物之一。甘蓝型油菜不仅是重要的食用油 , 调味品和蛋白质饲料来源, 也是加工工业及生物能源的重要原料，而且可以为人类提供必要的维生素C和可溶性纤维。核盘菌引起的油菜茎秆腐烂是油菜生产中的首要病害 , 可以造成油菜产量降低和品质下降 ; 另外 , 油菜的倒伏

2、问题已成为制约油菜机械化收获、 影响产量和品质、 增加菌核病危害的重要因素之一。木质素不仅可以增强植物体的机械强度, 同时由于其疏水的化学特性, 使植物免受病原菌的侵害和扩展, 与植物抗病、 抗倒伏有重要的关系。 因此 , 研究甘蓝型油菜茎秆木质素在抗病和抗倒伏过程中的作用 , 鉴定抗性候选基因 , 可为油菜抗性育种提供理论基础。本研究首先根据甘蓝型油菜茎秆中的酸性洗涤木质素(ADL)和木质素单体(G、S)含量值，建立近红外模型，实现样品中ADL和木质素单体含量的快速测定；利用60K Brassica Illumina SNP 芯片对茎秆菌核病抗性和抗倒伏性状(茎秆直径、折断力和折断强度) 及

3、木质素和木质素单体含量进行全基因组关联分析 , 鉴定与抗性性状相关联的SN暇点及候选基因，并从转录组水平解析木质素合成及甘蓝型油菜抗病机理, 具体研究结果如下:1.ADL 和木质素单体含量近红外模型建立近红外光谱是一种快速、无损准确的测定植物化学成分的新方法, 本研究采用范 式测定法测定了 103份材料的茎秆ADL含量，采用GC-MSS测定了 152份材料的木质素单体含量, 然后采集这些材料的近红外数据, 根据马氏距离选择83 份材料来建立ADL定标模型，选择67份材料建立S型木质素单体和G型木质素单体模型, 其余材料用于外部验证。结果表明：(1)ADL最适模型为MPLS0归分析，无散射和 二

4、阶导数处理;S型和G型木质素单体最适模型为PLS回归分析，标准正常化和散 射处理 (SNV+Detrend) 及二阶导数处理。(2)ADL模型决定系数(1-VR)约为0.90,外部验证相关系数(RSQ价别为0.87;G和S型木质素单体交互验证决定系数(1-VR)为0.97,外部验证预测相关系数(RSQ)为0.86;表明本试验中，ADL、S型和G型木质素单体近红外模型具有较好的预测效果, 可以用于精确定量。 2. 抗性相关性状全基因组关联分析为了从全基因组水平上解析甘蓝型油菜抗病和抗倒伏机理，挖掘与抗性性状相关联的SN暇点 , 本研究以 520 份不同来源甘蓝型油菜为材料, 进行菌核病茎秆抗性鉴

5、定, 并测定茎秆中部直径, 折断力 , 抗折强度 ( 单位面积折断力 ) 及倒伏系数; 根据上述建立的ADL S型和G型木质素单体近红外模型，测定各材料的ADL含量、S型和G型 木质素单体含量，由于H型木质素单体含量很少，本研究后续分析从S型和G型木 质素单体比例(S/G) 入手 , 探讨木质素单体比例与抗性的关系。这 7 个性状都进行两年两次重复鉴定, 同时利用 60K Brassica Illumina SNP芯片分析的基因型, 进行甘蓝型油菜抗性相关性状的全基因组关联分析。结果表明 :(1) 甘蓝型油菜相对感病性与茎秆总木质素含量无关, 但与木质素单体比 S/G达到显著正相关; 茎秆直径

6、与折断力达到显著正相关; 茎秆折断力和抗折强度与ADL质素总含量正相关；茎秆ADL*质素总量与木质素单体比S/G达到极显著正相关 , 倒伏系数与抗折强度和木质素单体比 S/G 达到显著正相关。表明组成油菜茎秆木质素时，S型木质素单体含量较高，但G型木质素单体在 抗病和抗倒伏过程中起着重要作用 , 抗折强度可以作为评价倒伏的重要指标。 (2) 从60KSNPE片中筛选出31468个有多态性和高质量的SN叫析连锁不平衡衰减 距离。当LD的衰减阈值为0.1时,A基因组的衰退距离约为1 Mb,C基因组的衰退 距离约为10 Mb,表明A基因组较C基因组衰减速度快，可能是中国半冬性甘蓝型 油菜在育种中A基

7、因组发生较大重组，打破了连锁不平衡。(3)根据SNPft染色体 上位置 , 检测各染色体单体型分布情况。A和C基因组平均单体型块大小分别为 133.3 kb和177.5 kb(F=8.5,P=0.019);A 基因组每 100 kb 内单体型块数目平均为 0.18,C 基因组为 0.04(F=102.5,P0.01)。A基因组单体型块数目多，长度短,C基因组单体型块数目少，长度长，表明A基因组较C基因组发生较大重组，打破之前的连锁状态， 被分割为多个长度小的单体型块。(4) 通过群体遗传结构,Neighbor-join 进化树及主成分分析划分自然群体类群。 520份材料划分为 3个类群 , 亚

8、群 1(Group 1)包含 53份材料 , 亚群 2(Group2) 包含 348 份材料 , 剩余的 119 份材料聚入混合亚群 (Mixed), 其分类与甘蓝型油菜 生态型一致。亚群 1 主要是由分布在中国甘肃和青海地区及欧洲的春油菜构成, 亚群 2 主要是由分布在长江流域地区的半冬性油菜构成, 包括重庆、四川、湖南、湖北及江苏地区选育的品种。 (5) 对 7 个抗性相关性状表型和60K Brassica IlluminaSNPE片分析的基因型进行全基因组关联分析，共检测到109个显著关联的SNP位点。茎秆菌核病抗性利用K+P模型，鉴定出17个与抗性显著关联的SN暇点,分别位于A8染色体

9、上的15.1 Mb和C6的31.3 Mb位置,A8上与菌核病抗性显著关 联的SNP位点位于长度为409 kb的单型体内，C6染色体上的SNPe点，与已经报 道的菌核病QTL位点有重叠；茎秆中部直径利用K+Q模型，共检测到3个SNFW记 与直径显著关联，分别位于A2(6 Mb)和A7(18.5 Mb)染色体上；茎秆折断力利用 K+P和K+Q模型共检测到关联的11个SNP位于A2染色体上约24.1 Mb,A7染色 体上约20.9 Mb,A9染色体上约2.5 Mb和2.9 Mb,及C3染色体上约48.4 Mb;对 抗折强度，检测到7个与抗折强度相关联的SN暇点位于A1染色体18 Mb,A5染 色体

10、20.3 Mb,A7 染色体 20.9 Mb; 对倒伏系数, 检测到 5个与倒伏系数关联SNP位点；对ADL,找到8个与木质素含量关联的SNF点；对木质素单体比S/G,几乎 在所有染色体都找到与其关联的 SN暇点，共找到58个显著关联SNP位点 (P1.37 X10-5),当利用较为严格的阈值时(P1.58 X10-6),共找到6个 关联SNP位点，位于A3染色体6.9 Mb和14.7-18.4 Mb,A6 染色体17.9 Mb,A7 染色体11.1 Mb。另外AD*：质素与木质素单体比S/G都在A1染色体约1.0Mb 处找到显著关联的SNP&点，并在附近找到与CAD5W源基因(Bna A01

11、g02890D)。倒伏系数LC与木质素单体比S/G,相对感病性与木质素单体比S/G都找到共 同的显著关联SNP位点,表明木质素单体在抗性过程中起着重要作用。(6)对7 个抗性性状进行全基因组选择 ,7 个性状随着参考材料数目的增加预测能力升高 但是标准差也随着升高 , 结合预测能力和标准差 , 选用60%的参考材料时最为合适。利用所有标记进行全基因组选择时, 这些性状的预测效率为 0.23( 直径)-0.42(折断力)，预测效率很低；利用全基因组关联分析显著 SN暇点(P1,FDR2,FDR&1t;0.01,R和S材料中接种前后共发现6821个差异基因，R中有5384个差异表达基因 , 包括

12、2356个上调基因(43.8%)和 3028个下调基因 (56.2%); 感病性材料(S)中共5386个，包括2229个上调基因(41.4%),3157个下调基因(58.6%)。其中共有的上调基因1784个,572个基因在R材料中特异上调，445个基因在S材料中特异上调;R和S材料共同下调的基因则有2166个,R材料特异下调基因862个,S材料特异下调基因991个。另外，对所有差异基因进行分层聚类发现，R和 S 材料中差异基因表达模式一致, 基因表达水平的差异主要表现为上调或下调倍数的差异;(2)对共同表达差异基因进行了 GO*能富集，从细胞组分，分子功能和参与的生物过程三个方面来分析。共同表

13、达的上调基因主要在细胞部分(ce11), 其分子功能是催化和结合功能编码转运蛋白 , 参与的生物过程为代谢过程, 细胞过程 , 生物调节和对刺激的反应。而下调的基因除了在细胞上, 细胞器上的比例也很高, 主要是与光合作用相关的叶绿体及类囊体;(3)对抗病和感病中共同表达的差异基因KEGG代谢途彳分析，结果表明 , 上调基因主要富集在谷胱甘肽代谢和次级代谢生物合成(硫代谢 , 硫苷生物合成和氧带羧酸代谢中 ), 下调基因主要富集在光合作用 , 乙醛酸和二羧酸代 谢途径 , 固碳作用 , 叶绿素代谢过程和碳代谢过程中 ;(4) 对抗病和感病材料差异表达基因进行分析, 找到一些特异的与抗性相关的途径及基因 , 包括茉莉酸途径,木质素途径, 信号传导途径, 防御反应及转录因子基因。木质素途径中，R材料CCo AOM基因全部上调，