单批次液体发酵 1 吨需养菌的发酵工艺设计(共13页)

1、基因工程(jyn gngchng)工艺(gngy)设计设计题目：单批次液体(yt)发酵 1 吨需养菌的发酵工艺设计姓名：陈志强专业：生物工程学号：2012031202联系方式成日期：2015.6.24 大连民族大学生命科学学院生物工程系一、概述(i sh)1.1菌种菌种名称：枯草芽孢(y bo)杆菌拉丁(l dn)学名 ：Bacillus subtilis (Ehrenberg) Cohn1.1.1生理特性 枯草芽孢杆菌是芽孢杆菌属的一种。单个细胞0.70.823微米，着色均匀。无荚膜，周生鞭毛，能运动。革兰氏阳性菌，芽孢0.60.91.01.5微米，椭圆到柱状，位于

2、菌体中央或稍偏，芽孢形成后菌体不膨大。菌落表面粗糙不透明，污白色或微黄色，在液体培养基中生长时，常形成皱醭。需氧菌。可利用蛋白质、多种糖及淀粉，分解色氨酸形成吲哚。有的菌株是-淀粉酶和中性蛋白酶的重要生产菌；有的菌株具有强烈降解核苷酸的酶系，故常作选育核苷生产菌的亲株或制取5-核苷酸酶的菌种。在遗传学研究中应用广泛，对此菌的嘌呤核苷酸的合成途径与其调节机制研究较清楚。广泛分布在土壤及腐败的有机物中，易在枯草浸汁中繁殖，故名枯草芽孢杆菌。1.1.2功能特性 1、能调节动物肠道菌群平衡 ,改善肠道微生态环境 ,促进动物生长和提高抗病力。 2、在不利环境条件下能以孢子形式存在 ,在饲料制粒、 贮存及

3、胃酸环境中仍能保持高活性。 3、能刺激动物免疫器官的生长发育 ,激活淋巴细胞 ,提高免疫球蛋白和抗体水平 ,增强细胞免疫和体液免疫功能 ,提高机体免疫力。 4、能自身合成消化性酶类 ,如蛋白酶、 淀粉酶、 脂肪酶和纤维素酶等 ,与内源消化酶共同发挥作用 ,促进养分的消化吸收。文章以一株枯草芽孢杆菌为研究对象 ,对其摇瓶发酵培养基及发酵条件进行优化 ,为其规模化发酵提供依据。1.1.3作用机理 1、枯草芽孢杆菌菌体生长过程中产生的枯草菌素、多粘菌素、制霉菌素、短杆菌肽等活性物质，这些活性物质对致病菌或内源性感染的条件致病菌有明显的抑制作用； 2、枯草芽孢杆菌迅速消耗环境中的游离氧，造成肠道低氧，

4、促进有益厌氧菌生长，并产生乳酸(r sun)等有机酸类，降低肠道PH值，间接抑制(yzh)其它致病菌生长； 3、刺激(cj)动物免疫器官的生长发育，激活T、B淋巴细胞，提高免疫球蛋白和抗体水平，增强细胞免疫和体液免疫功能，提高群体免疫力； 4、枯草芽孢杆菌菌体自身合成-淀粉酶、蛋白酶、脂肪酶、纤维素酶等酶类，在消化道中与动物体内的消化酶类一同发挥作用； 5、能合成维生素B1、B2、B6、烟酸等多种B族维生素，提高动物体内干扰素和巨噬细胞的活性。1.1.4菌种用途 1、该菌种对特殊菌体进行促芽孢和微胶囊包被处理，在孢子状态下稳定性好，能耐氧化；耐挤压；耐高温，能长期耐60C高温，在120C温度下

5、能存活20分钟；耐酸碱，在酸性胃环境中能保持活性，可以耐唾液和胆汁的攻击，是饲料微生物中可100%直达大小肠的活菌。2、枯草芽孢杆菌以孢子状态进入消化道后，迅速由休眠状态复活，在短期内繁殖成高含菌量的优势种群，消耗掉肠道内大量氧气，并能产生过氧化氢、细菌素，建立微生态平衡，促进有益厌氧微生物的繁殖，抑制有害细菌（大肠杆菌、沙门氏杆菌）的生长，从而预防腹泻、下痢等肠胃道疾病。3、在快速繁殖过程中，产生大量多种维生素、有机酸、氨基酸、蛋白酶（特别是碱性蛋白酶）、糖化酶、脂肪酶、淀粉酶，能降解植物性饲料中复杂的有机物，从而促进消化吸收，提高饲料利用率，防止动物消化不良，出现“饲料便”等状况发生。4、

6、该菌种安全高效，无药残，无毒副作用，能减少抗生素药物的使用，增强免疫力。同时缓解动物不进食，生长缓慢等不良应激反应状态，恢复由于用药造成的动物体质下降，提高疫苗抗体水平等综合抗病力。5、除臭驱蝇，减少污染，控制细菌性疾病，能减少粪便中氮、磷、钙的排泄量，减少粪便臭味及有害气体排放，表现为动物粪便臭味逐步减轻，减少饲料蛋白质分解为氨气浪费，从而减少环境污染。6、改善肉蛋奶品质(pnzh)，生产“绿色(l s)肉”、“农家(nn ji)蛋”、“无抗奶”，本品通过增强消化吸收功能，充分吸收利用饲料中营养成份及原料的天然色素，无需添加化学色素苏丹红、加丽素红造成对人体的有害物质及影响畜禽产品天然食用风

7、味，可媲美家养畜禽肉。能天然增加动物产品着色度和食用风味，猪只皮肤红润，毛色发亮；肉鸡肉鸭颜色加深；改善蛋壳的质量和颜色，蛋清厚稠，蛋黄鲜红；水产动物颜色更加健康，无斑点。1.2菌种培养参数的选择 1.2.1最佳生长时间的选择 由下图可知,发酵培养02 h 为枯草芽孢杆菌的生长停滞期 ,细菌数量极少;自 2 h 以后进入对数生长期 ,菌体数量急剧增多;在 12 h 达到生长高峰期 ,812 h为枯草芽孢杆菌生长的稳定期 ,菌体生长缓慢。自12 h后细菌数量开始减少 ,枯草芽孢杆菌进入生长衰亡期。因此 ,采用 812 h 时的菌液作为菌种较合适 ,此时枯草芽孢杆菌为对数生长末期 ,既可保持高的细

8、胞活力 ,又可获得尽可能多的细胞数。1.2.2最佳接种量的选择 分别选取1 %、 3 %、 5 %、 7 %和 9 %5 个接种量 ,在摇瓶发酵培养条件下培养12 h ,用稀释平板计数法测其活菌数。由下图可知 ,枯草芽孢杆菌生长的最适接种量为3% ,在1 %9 %范围内时 ,接种量对枯草芽孢杆菌活菌数的影响差异很小。1.2.3最佳(zu ji)装液系数的选择 选取(xunq)20、 40、 60、 80和100 mL 5个装液量分别测定不同(b tn)装液量对发酵液活菌数的影响 ,在摇瓶发酵培养条件下培养12 h ,用稀释平板计数法测其活菌数。1.2.4培养参数汇总表 菌种理论装液系数理想装液

9、系数接种量发酵时长初始pH温度培养基成分枯草芽孢杆菌8%-20%8%3%12h6.03515 g/ L、 酵母浸出物5 g/ L 和MgSO4 5 g/ L根据优化实验及单因素实验法确定了枯草芽孢杆菌的各发酵培养参数二、设计(shj)依据2.1总体生产(shngchn)规模单批次液体(yt)发酵1吨枯草 HYPERLINK /view/44590.htm t _blank 芽孢杆菌（需养菌）的发酵2.2 基本发酵工艺流程保藏菌种（平板划线培养、 试管斜面培养 ）菌种摇瓶培养 多级种子发酵罐培养 生产发酵 2.2.1 菌种的活化将冷冻保藏管中的菌种在斜面中活化（37 24h），并在平板中进行纯化

10、（37 24h）。2.2.2 种子液制备取一环纯化后的的菌种，接入装量为20mL种子培养基的250mL三角瓶中，置于180r/min中摇床中培养 (37 18h)。 分别取1mL的种子液 ,接入五个盛有20mL发酵培养基的250 mL 三角瓶中。置于150 r/ min摇床中 培养（30 12 h） 。2.2.3 一级发酵罐发酵将80mL的种子液接入装有1.35L发酵液的2L发酵罐中，37, 180r/min培养12h。2.2.4 二级发酵罐发酵将1.35L的种子液接入装有45L发酵液的70L发酵罐中，37, 180r/min培养12h。2.2.5三级发酵罐发酵将45L的二级种子液接入装有15

11、00L发酵液的2.5t发酵罐中，180r/min培养12h。2.2.6 四级发酵罐发酵将1500L的三级种子液分别接入装有20t发酵液的30t发酵罐和30t发酵液的50t发酵罐中，180r/min培养12h。2.3 工艺流程简图2.4发酵工艺设计理论参数与及工艺环节参数的选择(xunz)原则 发酵工艺中影响因素主要包括生长时间(shjin)、温度、PH、接种(jizhng)量、装液量等。生长时间：理论上：发酵培养，02 h 为枯草芽孢杆菌的生长停滞期 ,细菌数量极少;2 h 以后进入对数生长期 ,菌体数量急剧增多; 12 h 达到生长高峰期，812 h为枯草芽孢杆菌生长的稳定期 ,菌体生长缓慢

12、。12 h后细菌数量开始减少 ,枯草芽孢杆菌进入生长衰亡期。因此 ,我们在这里采用 812 h 时的菌液作为菌种较合适 ,此时枯草芽孢杆菌为对数生长末期 ,既可保持高的细胞活力 ,又可获得尽可能多的细胞数。温度：理论上枯草芽孢杆菌在2540均可良好生长，其生长的最适温度为35。在这里采用理论最适温度。PH：采用初始PH 6.0接种量：在1 %9 %范围内时 ,接种量对枯草芽孢杆菌活菌数的影响差异很小且在摇瓶发酵培养条件下培养12 h时，枯草芽孢杆菌生长的最适接种量为3% 。因此采用接种量为3%，在种子液接种到一级发酵罐中，可采用较大的接种量5%。理想的装液系数为8%40%。这里我们采用8%。

13、根据上述结果汇总发酵培养参数发酵工艺设计理论参数 发酵培养类型理论接种比例理想接种比例理论装液系数理想装液系数三角瓶1-10%1-3%8-20%8%发酵罐1-10%1-3%60-85%60-70%发酵级别理论接种比例理想接种比例发酵液总量实际接种比例备注生产发酵1%-10%3%20t30t3%将生产发酵分为两个罐生产四级种子1%-10%3%1500L3%三级种子1%-10%3%45L3%二级种子1%-10%3%1.35L3%一级种子1%-10%3%80mL5%三、发酵工艺流程(n y li chn)与设备流程设计主发酵罐的选定(xun dn)我所设计(shj)的是单批次1t，故根据1吨的生产产

14、量，以及发酵罐的理论装液系数的范围在60%-70%进行生产发酵罐容积的计算，因为考虑到产品供应的市场的边际收益和成本问题，将50t可以分成0.2t和0.3t进行生产。计算如下0.2t1000L/t=200L 200L60%=333.33L200L70%=285.71L生产发酵罐0.2t的选择范围在333.33L-285.71L根据发酵罐的规格，所以选择300L的发酵罐进行生产200L300L=66.7%此时(c sh)实际装液率为66.7%0.3t1000L/t=300L300L60%=500L300L70%=428.57L生产(shngchn)发酵罐30t的选择(xunz)范围在500L-4

15、28.57L根据发酵罐的规格，所以选择450L的发酵罐进行生产300L450L=66.7%此时实际装液率为66.7%种子罐的选定 1四级种子罐根据枯草芽孢杆菌的接种量的理论范围1-10%，我们选择3%做为实际接种量500L3%=15L15L60%=25L15L70%=21.43L二级发酵罐的选择范围在21.43L-25L根据种子罐的规格，所我选择25L的二级种子罐进行生产15L25L=60%此时实际装液率为60%2三级种子罐根据枯草芽孢杆菌的接种量的理论范围1-10%，以及对理想接种量3%的考虑,同时考虑二级种子罐的规格大小15L3%=0.45L0.45L60%=0.75L0.45L70%=0

16、.64L以及发酵罐的选择范围是0.64L-0.75L根据种子罐的规格，选择0.7L的一级种子罐进行生产0.45L0.7L=64.3%此时实际装液率为64.3%3二级种子罐根据枯草芽孢杆菌的接种(jizhng)量的理论范围1-10%，以及(yj)对理想接种量3%的考虑(kol),同时考虑二级种子罐的规格大小0.45L3%=0.0135L0.0135L60%=0.0225L0.0135L70%=0.0193L以及发酵罐的选择范围是0.0192L-0.0225L根据种子罐的规格，选择0.022L的一级种子罐进行生产0.0135L0.022L=67.5%此时实际装液率为67.5%4一级种子摇瓶数量型号

17、的选择根据枯草芽孢杆菌的接种量的理论范围1-10%，以及对理想接种量3%的考虑,同时考虑三角瓶的装液系数是8%-20%，理想装液系数是8%我们选择5%做为实际接种量，选择8%为实际装液率1.35L5%=0.675L=67.5mL67.5mL8%=843.75mL这样我们可以选择5个250mL的三角瓶进行培养根据实际操作情况为了避免染杂菌，我们5+1=6个三角瓶进行培养5空气压缩机的选择根据发酵罐每分钟需氧量来确定空气压缩机的型号。根据转子流量计1:1的比值，按照最大的装液系数70%计算主发酵罐0.4t每分钟需空气为300L70%=210L主发酵罐0.6t每分钟需空气为500L70%=350L种

18、子罐每分钟需空气的量为（25L+0.7L+0.02L）70%=18L总共需要空气的量为210L+350L+18L=578L 578L1000L/t=0.578t所以所选择的空气压缩机应能够供应0.578t/min的空气量同时考虑空气压缩机本身的使用情况，不能全动力投入使用，需要留一定的额度，而保证其寿命及生产。空压机的体积(tj)流量为0.58m3/min，所以(suy)我们选择0.60m3/min的空压机.又因回转式空压机结构简单易损件少，容易(rngy)维护，操作，并且有安装灵活的特点。其气量要求在0.85 m3/min-85 m3/min。故可以采用0.60 m3/min的空压机。6锅炉

19、的选择锅炉的种类有燃煤锅炉，燃油锅炉，燃气锅炉，根据地方管理的要求，及环境保护的原则和效益最大化我们选择燃气锅炉。7实际确定的发酵设备选型推算结果参数汇总发酵级别发酵液总量理论装液系数实际装液率需要设备容量选用设备规格及数量设备型号及厂家一级种子67.5mL8%-20%8%250mL三角瓶6250ml三角瓶上海鼎国生物技术有限公司二级种子1.35L60%-70%67.5%2L发酵罐12L发酵罐上海联环生物工程设备有限公司三级种子45L60%-70%64.3%70L发酵罐170L发酵罐上海联环生物工程设备有限公司四级种子1500L60%-70%60%2500L发酵罐12500L发酵罐上海联环生物工程设备有限公司生产发酵1t60%-70%66.7%80t发酵罐1SDL系列不锈钢多联发酵系统上海联环生物工程设备有限公司附属设备设备名称容积流量/蒸发量型号厂家备注空气压缩机60m3/minSA-75A/W12.3/0.8上海复生 喷油螺杆回转式空压机卧式1/2吨燃油/气锅炉/蒸汽锅炉5000kg/hWNS1.0-WNS2.0-1 HYPERLINK /china/2/manufacturers/905142/main/.html 上海华征特种锅炉制造有限公司使用煤气，天然气SDL系列机械搅拌多联发酵系统特点及主要参数可控参数 公称容积：5L100000L装料系数：70%8