急性髓系白血病82例患者VEGF与MMP2、MMP9的相关性研究

1、急性髓系白血病82例患者VEGF与MMP-2、MMP-9的相干性研究杨琳，董作仁，温树鹏，潘崚，张学军，罗建民，徐世荣【摘要】为了探究急性髓系白血病AL患者中血管内皮生长因子VEGF与基质金属卵白酶P-2、P-9的彼此干系及二者在AL中的意义，接纳半定量RT-PR技能检测AL患者与正凡人骨髓单个核细胞(N)P-2RNA、P-9RNA、VEGFRNA的表达，用明胶酶谱的要领测定原代N和HL-60细胞排泄的P-2、P-9的活性，应用ELISA要领检测AL患者血清中VEGF卵白的程度，阐发VEGF和P-2、P-9RNA之间的干系。效果表现：AL患者P-2RNA、P-9RNA与VEGFRNA的表达和V

2、EGF卵白程度呈正相干，缓解期患者和正常比拟无相干性；VEGF阳性组产生髓外浸润率显着高于阴性组；VEGF上调HL-60细胞中bl-2的表达。结论：AL患者中P-2，P-9的表达和VEGF具有正相干性，VEGF可以上调部门AL患者中P-2，P-9的表达，VEGF大概与P-2，P-9配合到场了白血病髓外浸润的产生。【关键词】急性髓系白血病RelatinshipbeteenVEGFandP-2，P-9in82PatientsithAuteyelidLeukeiaKeyrdsaute；yelid；leukeia；VEGF；P-2；P-9；regulatin有关VEGF与P干系的研究始于血管内皮细胞与

3、血管新生方面，VEGF能促进血管内皮细胞的增殖与迁徙，还可以诱导其产生P-2等落解细胞外基质的酶，为血管新生翻开通道，它险些到场了全部有血管新生的病理生理历程1，而抗VEGFR2的抗体可以淘汰内皮细胞中P-9的产生。比年来创造，P-2，P-9与VEGF在某些范例的白血病中也有雷同干系2，它们大概协同到场了白血病髓外浸润。我们通过检测AL患者骨髓单个核细胞的P-2，P-9与VEGF的表达环境，探究AL患者VEGF与P-2，P-9的彼此干系，阐发其与临床病理的意义。质料和要领病例86例急性髓系白血病患者(包罗50例初治患者、15例复发患者和21例缓解患者)，15名康健正凡人。患者均为我院血液内科2

4、001年10月-2022年1月期间住院和门诊随访的病人，均切合FAB诊断尺度3，此中11例、216例、327例、422例、519例、61例。男47例，女39例，中位年事为3214-64岁。15例正凡人中男9例，女6例，中位年事3518-55岁。白血病细胞系白血病细胞系HL-60由天津血液病研究所引进。重要试剂TRIzL、-LV逆转录酶、TaqDNA聚合酶及P-2，P-9，VEGF121，GAPDH引物由上海生工生物公司提供。RPI1640造就液购自Hylne公司，重组人VEGF121购自美国公司，定量人VEGF.ELISA试剂盒购自上海森雄公司。分组方案将研究工具分为AL组包罗初治和复发AL患

5、者、缓解组R患者、正常比拟组。不雅察各组中P-2，P-9与VEGF的表达环境，阐发其相干性。根据VEGFRNA表达与否将AL组分为VEGF阳性组和VEGF阴性组，不雅察此中P-2，P-9的表达有无差异。从AL组中随机拔取18例患者包罗复发患者2例做骨髓原代细胞造就，检测其上清中P-2，P-9的活性与各自RNA程度之间有无相干性。在造就体系中参加重组人VEGF121，不雅察其对细胞和P-2，P-9活性的影响。逆转录-聚合酶链反响RT-PR从恒量的细胞中用TrizL提取细胞总RNA。用随机六聚引物合成DNA：2g总RNA在15l反响体积，42条件下逆转录90分钟。P-2、VEGF、P-9和GAPD

6、H引物方案与扩增参照文献1。VEGF上游引物：5-TGGGTGAAAATGA-3；卑劣引物：5-TGGAGAGAGATTGGTT-3，扩增片断长度是474bp。P-2上游引物：5-GGTGTATTGAGAT-3；卑劣引物：5-GGATAGGTTATGGGGA-3，扩增片断长度是516bp。P-9上游引物：5-AAATATATTGGAT-3；卑劣引物：5-GGGTGTAGAGTTTGT-3GAPDH，扩增片断长度是649bp。GAPDH上游引物：5-GGAGTAAGGATTTGGTGATA-3；卑劣引物：5-AGTTTATGGTTGGTGAAA-3，扩增片断长度是374bp。15g/L琼脂糖凝胶

7、电泳含溴化乙啶5g/l，效果在读胶仪EagleEye上扫描定量，以P/GAPDH和VEGF/GAPDH代表P和VEGF的相对表达量。含底物的不一连SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳细胞孵育无菌条件下所取原代细胞预先无血清造就留宿，以去除血清的作用以5106/L的接种密度接种于RPI1640造就液无血清中，每位患者造就2瓶，此中1瓶参加重组人VEGF121，终浓度为50ng/l，另1瓶作为比拟。将上述细胞造就24小时后，网络上清用于检测VEGF和P的程度，细胞用于提取总RNA。取HL-60细胞株及随机抽取的3例AL原代细胞，以1105/l的密度别离接种于含有RPI1640造就液的24孔板中，加或不加新生牛

8、血清终浓度为5，V/V、VEGF121终浓度为50ng/l，每种环境重复3孔，做长时间造就以不雅察VEGF对细胞的作用。明胶酶活性阐发取上清液经不一连SDS聚丙烯酰胺凝胶(分散胶浓度为8，此中含0.02g/L明胶，浓缩胶浓度为5)电泳分散。电泳后的凝胶于2.5TritnX-100溶液中在摇床上低速动摇以洗脱SDS，使酶卵白复性。2小时后将凝胶置于孵育液含50l/LTris/HlpH8.0，50l/LNal，10l/Lal2中，37孵育12小时。考马斯亮蓝染色4小时，脱色2小时，有P的位置将在蓝色配景下出现白色清楚条带。用adbephtshp软件阐发：根据“酶的相对活性条带面积像素均匀灰度值配景

9、灰度值/255的公式盘算P-2，P-9的相对活性。ELISA要领测定血清或造就上清中的VEGF程度全部操纵均根据ELISA试剂盒的操纵说明举行。治疗方案初治AL3除外患者接纳DA方案阿糖胞苷、柔红霉素化疗诱导缓解。复发AL患者别离接纳AE阿糖胞苷、米托蒽醌、足叶乙甙、IA阿糖胞苷、去甲氧柔红霉素等方案。3患者接纳全反式维甲酸ATRA或以ATRA为主，团结应用小剂量DA、HA阿糖胞苷、高三尖杉酯碱方案诱导分化或ATRA加As23三氧化二砷治疗，复发3应用As23治疗或尺度化疗。髓外浸润尺度出现以下环境之一时定为髓外浸润组：经病理学证明为髓外浸润；临床上有肝、脾、淋逢迎肿大、皮肤结节、牙龈增生等髓

10、外浸润体征，颠末抗白血病治疗后缓解或显着好转；胸片、B超等客不雅查抄创造髓外浸润、可以去除别的病因且颠末抗白血病治疗后缓解或显着好转；根据我国诊断尺度3诊断为中枢神经体系白血玻统计学处置惩罚接纳SPSS10.0统计软件阐发处置惩罚。效果P-2、P-9在AL中的表达及其与VEGF的相干性阐发AL组中P-2RNA表达率64.6%宁静均表达程度0.531均高于正常比拟组，而P-9RNA表达率44.6%宁静均表达程度0.337与正常比拟无明显性差异。AL组中P-2RNA、P-9RNA与VEGFRNA和VEGF卵白程度显着正相干。缓解组和正常比拟组P-9RNA、P-2RNA与VEGFRNA和VEGF卵白

11、水均匀无相干性表1，表2。Table1.rrelatinbeteentheexpressinsfVEGFandP-2，P-9RNAinALpatients略Table2.rrelatinbeteentheexpressinsfVEGFandP-2，P-9RNAinnralntrl略P-2，P-9在VEGF阳性组与阴性组中表达的差异P-2在VEGF阳性组中表达率为74.2%，均匀表达程度0.664，阴性组中表达率55.9，均匀表达程度0.522，其表达率在两组之间无明显差异(P0.100，而在VEGF阳性组的均匀表达程度高于VEGF阴性组(P0.041)。P-9在VEGF阳性组中表达率(58.1

12、)宁静均表达程度(0.522)均高于VEGF阴性组表达率(32.4)(P0.033宁静均表达程度(0.168)(P0.004。VEGF121对AL细胞和HL-60细胞株P-2，P-9表达的作用未加VEGF121的原代细胞中的P-2的RNA的阳性率为55.610/18，均匀程度为0.435，酶活性的阳性率为55.610/18，均匀程度为65.7。P-9的RNA阳性率为509/18，均匀程度为0.420，酶活性的阳性率为509/18，均匀程度为191.97。二者的酶活性和RNA程度具有显着的相干干系。VEGF121VEGF121对AL细胞和HL-60具有抗凋亡作用为了进一步探究VEGF121对白血

13、病细胞的作用，我们不雅察了HL-60细胞和3例原代AL细胞在有或无血清、有或无VEGF121的环境下的生长状态。造就48小时后，全部无血清孔包罗VEGF121阳性和阴性中的存活细胞数均开始敏捷落落，到第7天的时间，细胞数已经所剩无几，提示VEGF121不克不及对抗血清剥夺所造成的细胞凋亡。在含有5新生牛血清的造就孔中，颠末7天的造就，HL-60细胞和1例AL原代细胞在有或无VEGF121的造就孔中，出现出差异的生长状态图2。VEGF121上调HL-60细胞株中bl-2的表达为了探究出现上述环境的缘故原由，我们又用HL-60细胞在造就瓶中重复了上述实行，并用RT-PR的要领检测了VEGF121对

14、HL-60细胞中bl-2的影响。效果表现：VEGF121促进了HL-60细胞中bl-2的表达。P-2、P-9及VEGF与髓外浸润的干系髓外浸润组中P-2RNA表达率为91.7，均匀表达程度0.941；P-9RNA表达率为75，均匀表达程度0.931。无髓外浸润组中，P-2RNA表达率58.5，均匀表达程度0.439；P-9RNA表达率37.7，均匀表达程度0.202。两组比拟，P-2，P-9表达率、表达水均匀有明显性差异(P0.05)表5。VEGF与髓外浸润的干系见表6。Table5.RelatinbeteenVEGFRNAandextra-edullaryleukeiinfiltratini

15、nALpatients略Table6.RelatinbeteenVEGFRNAandextraedullaryinfiltratininALpatients略讨论本研究效果表现，AL患者中P-2，P-9与VEGF的RNA和卵白程度呈正相干，VEGF阳性组的P-2和P-9的RNA程度高于阴性组，这与Hayashibara等2在成人T细胞白血病ATL中的研究效果相近；在缓解期患者和正常比拟中没有相干性，但这不克不及否认VEGF与P-2，P-9的干系，由于P-2，P-9在体内有着普及泉源，如中性粒细胞、巨噬细胞，P-9还可以泉源于较成熟的造血细胞，这也可以说明为安在缓解组和正常比拟中P-9也有较高程

16、度的表达。进一步阐发实行效果创造，在AL组中P-9与VEGF的相干性r0.449比P-2r0.387好，提示P-2，P-9在AL中的表达有大概被VEGF上调。VEGF和P-2，P-9都到场了血管新生，二者之间存在调控干系。VEGF一方面可以促进内皮细胞增殖，另一方面还可以促进内皮细胞表达P-2或P-9落解细胞外基质，而内皮细胞的增生和细胞外基质的落解被以为是血管新生的两个根本环节。外洋有研究报道它们在恶性血液病中也存在调控干系，Janska-iezrek等4创造，VEGF可以促进L细胞表达P-9；Dias等5创造，在AL细胞中参加重组人VEGF165后，这些细胞中P-9的酶活性增高。为验证这些

17、不雅点，探究VEGF对P-2，P-9有无作用及其作用机制，我们举行了原代细胞和HL-60细胞的造就实行。效果创造参加VEGF121作用24小时后，HL-60细胞中P-2，P-9的表达均升高，参加VEGF121的原代细胞中P-2的均匀活性较比拟组增高P0.045，而P-2、P-9的RNA和P-9活性程度固然也有所增长，但均无统计学差异。这与前面P-9与VEGF的相干性比P-2好的效果有所抵牾，但并不克不及否认VEGF对P-2，P-9的影响。阐发其缘故原由大概有：病例数较少；P-9的阳性率比P-2低，且P-9的活性在差异患者之间差异较大而造成了统计学缺点。进一步阐发效果创造，VEGF121仅能促进

18、部门AL细胞表达P-2或P-9，而另一部门对其没有反响图3，大概与以下因素有关：，VEGF的作用是通过VEGF受体介导的，细胞对VEGF的反响起首取决于细胞是否表达VEGF受体；，P的表达存在着异质性。这大概也是造成两组间没有统计学差异的一个缘故原由。这与Dias等5的研究效果符合，他以为VEGF的两个重要受体VEGFR1和VEGFR2都到场了这一历程，但他未直接证明这一点。在内皮细胞中的研究效果表现，VEGFR2重要介导促增殖和抗凋亡作用，而VEGFR1可以介导细胞的活动，促进尿激酶、纤溶酶激活物的按捺物和P-9等的产生6。因此，VEGF对AL细胞中P-2，P-9的详细调控机制另有待于进一步研究。我们对65例AL患者的临床资料举行阐发创造，有髓外浸润的患者高表达P-2、P-9和VEGF，提示它们大概配合到场AL患者髓外浸润的产生。已有研究创造，AL细胞既可表达有成效的VEGF受体，也能产生VEGF。假设在一个白血病细胞中形成如许一个自排泄形式，进而促进P-2或P-9的表达，那么很大概会在临床上形成高侵袭性表示。除促进P-2，P-9的表达之外，本研究还提示VEGF在白血病中大概具有抗凋亡或促增殖作用，在含有5新生牛血清的造就体系中参加50ng/l的VEGF121可以显着增长HL-60细胞和部门原代细