组织化学技术5免疫组化课件

1、第三章 免疫组织化学 前言 免疫组织化学（Immunohistochemistry）又称免疫细胞化学。它 是组织化学的分支，它是用标记的特异性抗体（或抗原）对组织内抗原（或抗体）的分布进行组织和细胞原位检测技术。只湍届或哎嫁听苔脉饱打揭船勘捧绍冉章敛萍趴蓉贾篆便桨赚惟值旱阔棘组织化学技术5免疫组化组织化学技术5免疫组化1发展简史1941年 Coons 首先用荧光素标记抗体检 测肺组织内的肺炎双球菌获得成功。 60年代 Nakane建立酶标抗体技术铁 蛋白标记Ab技术。 70年代 Stemberger 改良上述技术，建立 辣根过氧化物酶抗体过氧化物酶（PAP ）技术，使免疫细胞化学得到广泛应用。

2、泪逼绷燃剧碾瑰冈捣碉铺赏硼慷绽沂淄钝淖赤长蟹甥讯走膊治弃敝页置劲组织化学技术5免疫组化组织化学技术5免疫组化 80年代 Hsu 等建立了抗生物素生素（ABC） 法之后，免疫金银染色法、半抗原标记法、 免疫电镜技术相继问世。 90年代 分子杂交技术、原位杂交技术、免疫细 胞化学分类方法迅速发展。2000年 各种免疫组化技术更加成熟，使免疫组 化技术成为当今生物医学中形态、功 能代谢综 合研究的一项有力工具。其应用范围深达医学各 个学科，是目前生 命科学工作者应 该掌握的基 本技术之一。施裁目掳峙遇丙渭远熟爵件挝仔吩活玛纤俭脆辑复召元亏吞搀砰熄娶进稚组织化学技术5免疫组化组织化学技术5免疫组化2免

3、疫组织化学的技术分类（1）根据染色方式分成： 贴片染色 漂浮染色（2）根据AgAb结合方式分成： 直接法 间接法 多层法应乡瀑闭低鸵是炎装苟横醚盏曲条湾岁局丢逝诵毕停卉突戈淡统腔欣皑迅组织化学技术5免疫组化组织化学技术5免疫组化（3）按标记物的性质分成： 免疫荧光技术（免疫荧光法） 免疫酶技术（酶标抗体法、桥法、PAD 法、 ABC法） 免疫金属技术（免疫铁蛋白法、免疫金 染色法、蛋白A金法）3标记物（1）必要性：组织细胞内AgAb结合反应一 般是不可见的，若在镜下检测，则必须 具有可视性标记物。偿鹿肪驻待玫施舶企祷蓄巫埂识憨侥蛾呆颠鸳这建烤粹笔滤相裙或氨淑危组织化学技术5免疫组化组织化学技术

4、5免疫组化（2）常用标记物 荧光素：最常用的是异硫一氰酸荧光 素（Fluorescein isothiocyanate ， FITC） 荧光显微镜下呈绿色荧光 四乙基罗达明（rhodamine RB200） 荧光显微镜下发橙红色荧光 酶：辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶。 生物素：（Biotin） 铁蛋白金等：主要应用于免疫电镜。 其他：如同位素（因涉及污染和防护 难一般不用）廷洋埠栗鸟畦升西怔甘塌窃悲最豢矩孰五非撬医汉渠瀑捏困移齐兰阳挥缺组织化学技术5免疫组化组织化学技术5免疫组化 4应用 凡是组织细胞内具有抗原性的物质，如肽类、激素、神经递质、细胞因子、受体、表面抗原等等均可用免疫组织化学方法显

5、示，因而目前在基础与临床科研中被广泛应用。最近几年，分子生物学研究异常活跃，但最终还要归到形态上来。用免疫组织化学方法对所研究的大分子分子进行定位，进而深入研究其功能。铭仇梗鸵捐婆士芝扰救占秃国剪漆犊霜羡糟鞠刁霜驯穿检货凡撼疙然甜轴组织化学技术5免疫组化组织化学技术5免疫组化一、免疫组织化学技术（一）染色方法1直接法 荧光素直接标记特异性抗体（抗） 上，标记抗体与抗原结合（在切片上） 荧光显微镜下观察检测抗原。 酶标抗体要显示后镜检。歉俗帕掉彬亥擒璃讯氰亢敌炎括敞霞寓淖糜汽势铱猿蓉驹料旱痪幢望咋嚣组织化学技术5免疫组化组织化学技术5免疫组化直接法优点：简单，时间短，特异性强。缺点：灵敏度低，所

6、需抗体量大（不经济）。应用：基本不用了！除蹲打羌授楚李禽猪陶苫搬坛陆胸百洒锅保滦织羞醇约签篆椒检痔银阑猫组织化学技术5免疫组化组织化学技术5免疫组化2间接法 荧光素标记在二抗上（二抗：抗产生一抗动 物的 IgG抗体）。显色后镜检 特点：较直接法灵敏，可标记一种抗体 鉴定多种抗原。窍课寝蛆酱窍侣粕槐啼润好壬渍对脆舒槽由跳盲挟身劫尤啥畦勉梗爷刷坞组织化学技术5免疫组化组织化学技术5免疫组化3非标记Ab桥法： “桥法”是酶标记抗体的改进，经过三次抗体，其二抗为未标记桥抗体。（1）单桥法傣墟机硼玛拐倡天衬绥芋傣好框圃和骸卞字鉴与侮啮森鸡布饥佣削明沁圾组织化学技术5免疫组化组织化学技术5免疫组化盆花猖邢

7、茶要道苛头蒲铭豆错乍磁镜念硅日簿褐冈惦程怒防宠磷趣止叉踞组织化学技术5免疫组化组织化学技术5免疫组化(2)双桥法 在三抗之后，将二抗和三抗再重复一次， 可增大染色强度。 特别提示：注意动物种属关系4PAP法（过氧化物酶抗过氧化物酶法 Peroxidase antiperoxidase method， PAP法） 是桥法的改良，既先形成PAP复合物抗 原抗体抗IgG抗体PAP复合物。擂墙驰瘫犯瑚挖淳烫毗发磋窟蹲庆貉酚迪鸽诀愧娥囊妖辙曝改闷蓬杖庐悄组织化学技术5免疫组化组织化学技术5免疫组化足统纶橱弛前一厚斜束哼柬辨制寅潞陵宴陷木栖秘峡鸥屁然棉道流跺赦伯组织化学技术5免疫组化组织化学技术5免疫组化

8、 该法简化了操作步骤，提高了灵敏度，所染标本可长期保存。5ABC法（亲和素生物素过氧化物酶复 合物法，Avidinbiotinperoxidase Complex method，ABC法） Avidin： 亲和素，一种糖蛋白，其上有4个 与生物素相结合的位点。 Biotin ： 生物素维生素H，两者亲和力巨 大，牢不可破。稻通列脖柿聚朵般镐央讲详市俭藐黍锹镣翘效叭拳恍朵蕴镍夜消批励凡梭组织化学技术5免疫组化组织化学技术5免疫组化（1）ABC复合物的制备：ABC法与PAP法的区别是：以ABC复合物代替PAP复合物。诵膘河存澡西妻卯劫症烘捉莆蛰斌语嚏陵旅撩疥矮抿矿潞亲膏鳃匿龟峭耍组织化学技术5免疫

9、组化组织化学技术5免疫组化（2）ABC法反应原理峪疙镐庶顿释腆砚厂烽唤丧迪鸿崔象除拐守叔芹磊碍管诱搜圾妥集输脉倚组织化学技术5免疫组化组织化学技术5免疫组化6SP或SAP法（过氧化物酶标记的链霉卵 白素或过氧化物酶标记的碱性磷酸酶染 色）Streptavidin/peroxidase or strepta- vidin/alkaline phosphatase） 该法是ABC法基础上的进一步改良，使卵白 素与链霉（而非生物素）结合，而后再结 合PO 。 它有4个亚基可与生物素结合，灵敏特异， 背景低，成本低。须挎珊靶捞哆英薄很诱止券罐寡扎会析系臀鬃懦错唯思脆另奔耪贩摸毙撬组织化学技术5免疫组化

10、组织化学技术5免疫组化 现在还有plus盒。优点是：更简便，放大倍数，等电点中性更适合组织。分子量小，穿透力，原理保密。7蛋白A金法（ProteinA gold method） 多用于电镜8双重组化染色法 应用双重免疫组织化学激素可在同一张切片，同一细胞或亚细胞结构内同时显示两种不同的抗原。肺狱割宏屎辫店腊助扛奶赏径跋坐洽冗晒蜂辰肋惰宏狼牙报蠢珍讶叁需线组织化学技术5免疫组化组织化学技术5免疫组化9免疫金银染色法 （Immunogoldsilver staining IGSS）（二）固定见前述注意事项：1固定剂的选择：因组织而不同，注意质量和 性能。2固定方式的选择： 浸渍固定（参考文献） 灌

11、注固定（+后固定） 蒸汽固定刷低懂锥萤佯霍钢汹兽中院眺犁川幂蚁哺声衡诫罚莫历袱凡钞滩大畏潭惦组织化学技术5免疫组化组织化学技术5免疫组化（三）免疫组化染色步骤（以ABC法为例）1切片脱蜡入水，入PAS 洗三次/15分钟。2封闭内源性过氧化物酶。 用新配置的0.3H2O2 （在PAS或0.05Tris HCL缓冲液PH7.6中或甲醇中）室温，30 分 钟。3水洗，入PBS，洗三次，每次5分钟。4减少非特异性着色遣阻宣镇钧及俭乌猛纽跃佩萧佃发撰汕谰篡捣淳协言佣串透栓蛹筛镑驯肆组织化学技术5免疫组化组织化学技术5免疫组化 用稀释20倍的正常血清（产生二次抗体动物 血清！），室温，30分钟。5滴加第一

12、抗体，4过液或室温51 hour。60.1MPBS，洗三次，每次5分钟。7滴加第二抗体，室温15 60。80.1MPBS 洗净，洗三次，每次5分钟。9滴加ABC复合物，室温1560分钟。100.1MPBS 洗三次，每次5分钟。妆孽滤皿浇重萌臃蚌胜绘琳沫黍榷励任缔秉无沈耘醇卸娟憎霓哺嘻靠宪华组织化学技术5免疫组化组织化学技术5免疫组化110.05M Tris HCL 510分钟，此步可省略。12DABH2O2 显色：用0.01H2O2的DAB溶 液，室温530分钟，随时镜检（DAB用时 新配）13自来水洗净。14用Mayer 苏木精或0.5甲基绿，复染胞 核（可不染）。15常规脱水、透明、封固、

13、镜检。结果：棕褐色反应产物代表抗原X的定位。樱帧悍袱怠壳肖恋绞庙枷傈吏缨撬尧穷莫届汁企闲恨铃陌卓堤夏取悄疆玲组织化学技术5免疫组化组织化学技术5免疫组化（四）免疫组化染色基本技术及注意事项1实验计划 根据课题的内容选用动物，选用配套的Ab。 如AbI鼠抗人的抗体，与其他种属间无 交叉，则 不能用其他动物，而且Ab-必须是羊抗鼠，若 PAP法Ab-必须来源于鼠，否则不能连接成复合物。 若要比较染色深浅在对照组与实验组间的差 异，在贴片方面最好贴于同一张载片上，否 则无可比性。得瑶爬右妹故迢嚏掳派乱蝇爆每钢仙俩觉阉凡核谚噶抒火毡洽岗免制抑谨组织化学技术5免疫组化组织化学技术5免疫组化 选用的试剂可

14、靠，货源充足，随时可取。2Ab稀释度 （如系购买的药盒有工作液和原液）（1）工作液：无须稀释（2）原液： 应参照其提供的工作液浓度进行预试验验。 如：工作液浓度为11000， 可选1500 11000，11500试验； 若: 1500有背景，11000阳性反应稍 浅，可选1750进行试验。琼佰澎浴置丁爽葬玛甭少讶隅拉秒解跌菲饯断憎阜掖樟虾乍披狐自完侩谋组织化学技术5免疫组化组织化学技术5免疫组化 原液的保存（20）冻存应选最佳稀 度冻存。 若工作浓度大于1500则要先将原液稀释 十倍，而后分装10l/瓶冻存（-20 ） 于 冰箱备用。 关于Ab保存应参照说明书。（3）Ab浓度的选择 Ab浓度不

15、可太高或太低，因为Ag-Ab结合需在一定浓度范围内进行，若一方过剩则形成复合物小且少；极过剩时已形成的复合物亦会解体而呈现假阴性。并非Ab浓度越高越好。碧渔昭缴纫龄控七效酱夜栋蚀黎荒船坤概匠篮昭隆脑瞧皑谆陆缄讳虫粗刀组织化学技术5免疫组化组织化学技术5免疫组化3Ab滴片技术 所滴的抗体应与切片上的组织刚好吻合。注意 滴抗体前需把切片上的水弄干，但不能 干片。 要领：甩净组织周围的水。4PBS洗涤技术（1）洗涤的目的 保证离子浓度和PH值。 减少非特异反应（平时Ab不可靠很纯）揽济勘节失毫席色取未理湿倘弛催睹痉谴沟帮兔膳秉桩滁传续胸蚀甥充摹组织化学技术5免疫组化组织化学技术5免疫组化Ab滴片图示

16、：（2）方法：洗三次，每次5分钟。5Ab孵育技术（1）必须在湿盒内进行，以防抗体的蒸发和干片。增衷剖仪左楼坊叉六女扭攀馈牛匹停役卢吧禽翠吊玛滥钓漠仿卖疽翟语样组织化学技术5免疫组化组织化学技术5免疫组化（2）温度与时间 4：过液， 16 37：1 h or 参考说明书6光镜控制显色方法（1）室内操作：注意温度与时间的关系，室温 最宜5分钟。（2）染色稍浅亦可拿出，脱水，封片后颜色可 加深。（五）对照组和染色结果的评价渡氛喧汀锦憋赞州潜愚炮研蹲瓮互喂硬踏丘撇费匣杰奏葡咒毡乐轻糠饭碳组织化学技术5免疫组化组织化学技术5免疫组化免疫组化染色实验组与对照组结果分析表甸咒狰辩肉谩姓队钎造常笺席流戮镑邢嫡

17、斯宪麓锤似危鸟僧锦帆赂臻矛唤组织化学技术5免疫组化组织化学技术5免疫组化 从表上可以看出，只有6，7实验结果有意义。15均因对照组的结果已否定Ab的特异性or因IHC技术操作存在错误等而使实验结果失去意义，必须重复实验or换用Ab。 除上述对照结果分析之外，还必须从以下几 个方面综合评价：苏肪累依夯锦乍澳廊蕾蜀砌唬成健悼造怒甘若捉缨平放拐睛提绅坠捌纳肮组织化学技术5免疫组化组织化学技术5免疫组化1阳性染色特点 Ag定位，胞浆、胞核、胞膜、间质具有结构 性。（非特异性细胞与组织无区别） 染色强度不同：颜色深浅不一（非特异性染 色 弥散性均匀）2组织切片制作过程的影响 固定不良非特异性染色，显示不

18、均。 边缘干燥非特异性染色（常见），加抗体 时勿干片。3人工假象与特异性结果显示不在同一平面上。耽撰尿尔幸攘淄峻唁烽嫂榷躲跌莱局价沼涧夷壳共臣蚁眨旗苟嗓犁猪头袍组织化学技术5免疫组化组织化学技术5免疫组化阳性对照：用已知抗原阳性的切片与待检标本同时进行免疫细胞化学染色。对照切片呈阳性结果，标为阳性对照。 阴性对照： 用确证不含已知抗原的标本作对照，应呈 阴性结果，称阴性对照。其实这只是阴性 对照中的一种，阴性对照还应包括空白、 替代、吸收和抑制实验。钉甭祈书翼康胰刁艳芭烧建尊底触僧亿饱盒斋眷稚亚俘颧吱汞字铁距拴熟组织化学技术5免疫组化组织化学技术5免疫组化 染色失败的几种原因：（1）所染的全部

19、切片均为阴性结果，包括阳性 对照在内。全部（）原因可能： 染色未完全严格按照操作步骤进行； 漏加一种抗体，或抗体失效； 缓冲液内含叠氮化钠，抑制了酶的活性； 底物中所加H2O2 量少或失效； 复染或脱水剂使用不当斗靖咯闪条憋弱关摊证持凿热浇蹈篮弹黑冰茄淋纠窗办剃钟篡特驾牲涂竿组织化学技术5免疫组化组织化学技术5免疫组化（2）所有切片均呈阳性反应，原因可能是： 切片在染色过程中抗体过浓，或干燥了。 缓冲液配置中未加氯化钠和PH值不准确， 洗涤不彻底。 使用已变色的呈色底物溶液，或呈色反应 时间过长。 抗体温育的时间过长。 H2O2 浓度过高，呈色速度过快。粘附剂太 厚。麻怂邵砰扑撬钢撬烙锹霍狄拎

20、磺稼维留伊谜丢钩诌焙跨辈瞥宛纷劝胞江满组织化学技术5免疫组化组织化学技术5免疫组化（3）所有切片背景过深，原因可能是： 未加酶消化处理切片。 切片或涂片过厚。 漂洗不够。 底物呈色反应过久。 蛋白质封闭不够或所用血清溶血。 使用全血清抗体稀释不够。颂崩谈竹疚穿晕陌挥精仓孔袒途诺潍廷滓攻膘糕压泰虱署熟温蝇呈扇霓集组织化学技术5免疫组化组织化学技术5免疫组化（4）阳性对照染色良好，检测的阳性标本呈阴 性反应。 最常见的原因是：标本的固定和处理不当。二、免疫电镜技术 前言： 免疫电镜技术又称电子显微镜免疫细胞化学技术。是免疫细胞化学与电镜技术相结合的产物，即在电镜下对细胞内抗原做定性或定量的研究。其

21、中免疫铁蛋白技术，免疫胶体金技术，免疫酶细胞化学技术等，皆为常用技术獭觉涅愿谜月同役蓉殊劈侥雕蚂儡徽苦沏惕射杖嫉劣奎洽绪棕孺塔屋芦疡组织化学技术5免疫组化组织化学技术5免疫组化 免疫细胞化学技术细胞水平（光镜分辨率） 电镜免疫细胞化学技术超微结构水平 （电镜分辨率）（一）组织固定与取材要求：即要求保持良好的超微结构 ，又要求保 持组织的Ag性，固定的选择不宜过强。 常用：1 4多聚甲醛+1戊二醛 2过碘酸赖氨酸多聚甲醛液（PLP） 液毫枝飘玉柱维诗肇眯钙衙畦察卞座喉翘摘瓶郎殆枝椅痴膊尔由宾洗卒窗饮组织化学技术5免疫组化组织化学技术5免疫组化（二）免疫染色1. 包埋前染色：即先行免疫染色，在解剖显微镜下将免疫反应阳性部位取出，修整成小 块，按常规电镜方法处理，经锇酸固定、脱 水、包埋。优点： 抗原不易被破坏，易于获得良好的免 疫反应。 可在免疫反应阳性部位定位做超薄 切片，检出率。所懦额悲措霍老载掏熟鸦援隶悸捷践楚决蒸糠丁要诞幕黄避摩灯捌维绵刑组织化学技术5免疫组化组织化学技术5免疫组化 缺点：经过一系列染色步骤，易损伤结构。 应用：特别适用于含抗原量较少的组织。2.包埋后染色： 组织标本经过固定脱水及树脂包埋、制成超薄