药物分析-第04章-药物定量分析与分析方法验证课件

1、第四章 药物定量分析与分析方法验证第一节 定量分析样品的前处理方法第二节 定量分析方法的特点第三节 药品分析方法的验证第四节 生物样品分析方法的基本要求第一节 定量分析样品的前处理方法在进行药物定量分析之前，一般需根据分析方法的特点，化学原料药的结构与性质及药物制剂的处方组成采用不同的方法对试样进行前处理，以满足所选用的分析方法对试样的要求。含金属或卤素、氮、硫、磷等元素的药物的分析方法通常可分为：（1）不经有机破坏的分析方法（2）经有机破坏的分析方法一、不经有机破坏的分析方法不对药物分子中的有机结构进行完全破坏;仅选用适当的溶剂溶解样品使待测元素离子电离或经简单回流处理使有机结合的待测元素原

2、子离解而转化为无机盐类后测定。适用于含金属有机药物或结合不牢固的含卤素等药物的分析。根据操作方法不同，主要有：直接测定法、经水解后测定法、经还原分解后测定法。直接测定法凡金属原子不直接与碳原子相连的含金属的有机药物或某些C-M（金属原子直接与碳原子相连）键结合不牢固的有机金属药物，在水溶液中可电离，不需经有机破坏，直接进行测定。配位滴定法：利用二价金属离子可与乙二胺四乙酸二钠形成配位化合物，直接乙二胺四乙酸二钠滴定液滴定。氧化还原滴定法：利用不同价态的金属离子的氧化还原性，选用适当的滴定液直接或间接滴定法测定含量。例1：葡萄糖酸钙的含量测定取本品，加水溶解后，在氢氧化钠碱性条件下，以钙紫红素为

3、指示剂，用乙二胺四乙酸二钠滴定液滴定至溶液自紫色转变为纯蓝色。例2：葡萄糖酸锑钠的含量测定本品所含的五价锑具有氧化性，在酸性溶液中可氧化碘化钾并析出碘，选用间接碘量法，用硫代硫酸钠滴定液滴定。经水解后测定法碱水解后测定法：将含卤素的有机药物溶解于适当的溶剂中，加NaOH溶液回流使其水解，将有机结合的卤素转变为无机形式的卤素离子，然后选用间接银量法。本法适用于含卤素有机药物结构中卤素原子结合不牢固的药物，如卤素和脂肪碳相连者。酸水解后测定法：将含金属的有机药物与适当的矿酸（如盐酸）共热，将不溶性金属盐类水解置换为可溶性盐，然后选用配位滴定或剩余酸碱滴定法测定。例2：三氯叔丁醇的含量测定取本品，溶

4、于乙醇后，加NaOH溶液并加热回流，使有机结合的氯水解生成NaCl，与AgNO3生成AgCl沉淀，过量的AgNO3用NH4SCN溶液滴定(指示剂:Fe3+)。例1：十一烯酸锌的含量测定本品与稀盐酸共沸，水解生成十一烯酸和氯化锌，用乙二胺四乙酸钠滴定液直接滴定锌离子。CCl3-C(CH3)2-OH + 4NaOH 回流(CH3)2-CO + 3NaCl + HCOONa + 2H2ONaCl + AgNO3 AgCl + NaNO3 AgNO3 + NH4SCNAgSCN + NH4NO3（淡棕红色）(Ksp=1.561010 )(Ksp=1.010-12 )Fe3+ + SCN Fe (SCN

5、) 2+ 经还原分解后测定法。含碘有机药物，当碘原子直接与芳环连接时，碘的结合比较牢固，采用碱性溶液回流是难以使C-I键断裂，但可在碱性人溶液中加入还原剂（如锌粉）回流，使其转化为无机碘化物后测定。例：泛影酸的含量测定取本品约0.4g（精密称定），加NaOH试液30ml与锌粉1.0g，加热回流30min，放冷，冷凝管用少量水洗涤，滤过，烧瓶与滤器用水洗涤三次，每次15ml，洗液与滤液合并，加冰醋酸5ml与曙红钠指示液5滴，用AgNO3（0.1mol/L）滴定液滴定。+ 11NaOH + 3Zn + 3NaI + 2CH3COONa + 3Na2ZnO2 + 3H2OCOONaNH2NH2NaI

6、 + AgNo3 AgI+ NaNO3碘他拉酸、胆影酸、碘番酸等均采用同法测定胆影酸碘他拉酸碘番酸二、经有机破坏的分析方法含金属及含卤素、氮、硫、磷等有机药物结构中的待测原子与碳原子结合牢固者，用水解或氧化还原的方法难以将有机结合的待测原子转变为无机形式；须采用有机破坏的方法将药物分子中有机结构部分完全破坏，使有机结合形式的待测原子转变为可测的无机离子（或氧化物、无氧酸等）后方可分析。有机破坏方法包括：湿法破坏、干法破坏。湿法破坏适用于含氮有机合成药物分析的前处理，在生物制品分析中用于氮（包括蛋白质）、磷、硫柳汞及氯化钠测定法的前处理； 亦可用于生物样品中金属元素测定时生物基质的去除。主要分解

7、剂：硫酸辅助分解剂：硝酸、高氯酸、过氧化氢。湿法破坏可分为：硫酸-硝酸法、硫酸-高氯酸法、硫酸-硫酸盐法、硝酸-高锰酸钾法。以硫酸-硫酸盐法为基础的含氮有机药物定量分析方法凯氏定氮法原理将含氮有机药物与硫酸和硫酸盐在凯氏烧瓶中共热，药物分子中有机结构被氧化分解成二氧化碳和水，有机结合的氮则转变为无机氨，并于过量的硫酸结合为硫酸氢铵及硫酸铵；经NaOH碱化后释放出氨气，并随水蒸汽馏出，用硼酸溶液或定量的酸滴定液吸收后，再用酸或碱滴定液滴定。加入硫酸盐的作用是：提高硫酸的沸点，增强硫酸的氧化破坏能力，且防止硫酸的分解损失。以硫酸-硫酸盐法为基础的含氮有机药物定量分析方法凯氏定氮法原理（续）催化剂（

8、如汞或汞盐、硒粉、铜盐、二氧化锰）：加快氧化分解的速度，以缩短反应时间。硫酸铜因价廉易得，且无挥发、毒性低，常被用作本法的催化剂。对某些难以分解的药物（如含氮杂环结构药物），在氧化分解过程中常需加入辅助氧化剂，使分解完全并缩短分解时间。常用的辅助氧化剂有30%过氧化氢和高氯酸。高氯酸为强氧化剂，用量不宜过大。以硫酸-硫酸盐法为基础的含氮有机药物定量分析方法凯氏定氮法操作（常量法）氧化分解供试品适量置于500ml凯氏烧瓶中依次加入10g K2SO4和0.5g CuSO4粉末沿瓶壁加入20ml H2SO4加热至溶液成澄明的绿色后，继续加热30min放冷，沿瓶壁加250ml水，振摇混合放冷，加75m

9、l 40% NaOH溶液加锌粒数粒（防爆沸）用氮气球将凯氏烧瓶与冷凝管连接吸收与滴定取2%硼酸溶液50ml置500ml锥形瓶中加甲基红-溴甲酚绿混合指示剂10滴将冷凝管下端插入硼酸溶液的液面下轻轻摆动凯氏烧瓶后，加热蒸馏馏出液用硫酸滴定液（0.05mol/L）滴定至溶液由蓝绿色变为灰紫色将滴定的结果用空白实验校正以硫酸-硫酸盐法为基础的含氮有机药物定量分析方法凯氏定氮法应用范围中国药典主要应用本法测定含氨基或酰胺结构的药物含量；对于以偶氮或肼等结构存在的含氮药物，因在消解过程中易于生成氮气而损失，需在消解前加入锌粉还原后再依法处理；杂环中的氮，因不易断键而难以消解，可用氢碘酸或红磷还原为氢化杂

10、环后再行消解；对于含氮量较高（10%）的样品，可在消解液中加入少量多碳化合物，如蔗糖、淀粉等作为还原剂，以利于氮转变为氨。干法破坏本法主要适用于含卤素、硫、磷等有机药物分析的前处理，亦可用于某些药物中硒及砷盐的检查。根据破坏方式可分为高温炽灼法和氧瓶燃烧法。高温炽灼法：原理：将含待测元素的有机药物经高温灼烧灰化，使有机结构分解而到测元素转化为无机元素或可溶性无机盐，以供分析。应用范围：本法主要适用于含卤素药物的鉴别，亦可用于含磷药物的定量测定和药物中砷盐的检查。根据分析对象与目的不同，常加无水Na2CO3、Mg（NO3)2、Ca(OH)2、ZnO等辅助灰化。含碘药物的鉴别：将适量样品置于坩锅中

11、。直火炽灼，或与无水Na2CO3混匀后，炽灼至紫色的碘蒸汽产生。含氟、氯、溴等元素药物的鉴别：将适量样品置于坩锅中，与无水Na2CO3（或Na2CO3-K2CO3混合物）混合，炽灼至完全灰化，加水溶解后鉴别。含磷药物（如甘油磷酸钠注射液）的定量测定：精密称取样品1ml，置于瓷坩锅中，加氧化锌1g，加热碳化后在600炽灼1h，放冷，加水与盐酸个5ml，加热煮沸使溶解后，用钼蓝比色法测定。砷盐的检查：有机结合的砷经与无水Na2CO3或Ca(OH)2、Mg(NO3)2共热（700）转化为无机砷酸盐后，依法检查。本法主要用于高分子化合物（如：右旋糖酐铁）或植物提取物（如：大豆油）中砷盐的检查，亦应用与

12、少数有机药物（如吡罗昔康、布美他尼等）.氧瓶燃烧法：原理：将含待测元素的有机药物置于充满氧气的密闭燃烧瓶中充分燃烧，使有机结构部分彻底分解为CO2和H2O，而待测元素根据电负性的不同转化为不同的氧化物（或无氧酸），被吸收于适当的吸收液中（多以酸根离子形式存在）以供分析。本法适用于含卤素或硫、磷等元素的有机药物的鉴别、限度检查或含量测定，亦可用于药物中杂质硒的检查。仪器装置：燃烧瓶为500ml、1000ml或2000ml的磨口、硬质锥形瓶，瓶塞应严密，底部熔封铂丝一根（直径：1mm），铂丝下端做成网状或螺旋状，长度约为瓶身长度的2/3。通常取样量为1020mg，使用500ml燃烧瓶；加大样品取样

13、量（200mg）时可选用1000ml或2000ml的燃烧瓶AF氧瓶燃烧装置与样品包装操作图吸收液的选择：根据待测元素的种类与所选用的分析方法选择适当的吸收液，可使样品经燃烧分解所生成的不同价态的待测元素定量地被吸收并转变为单一价态，以满足分析方法的要求。含氟药物一般选用茜素氟蓝比色法检查氟含量，其燃烧产物为单一的氟化氢，可选用水作为吸收液。吸收液的选择 采用银量法测定含氯药物时，燃烧产物亦为单一的氯化氢，但氯化氢在水中溶解度较低，需用H2O-NaOH溶液作为吸收液。采用银量法测定含溴药物时，分解产生的溴化氢可被氧气氧化成单质溴，故其燃烧产物为单质溴和溴化氢的混合物，可在H2O-NaOH吸收液中

14、加入还原剂SO2饱和溶液，将单质溴还原为溴负离子。吸收液的选择 测定含碘药物时，分解产生的碘化氢可被氧气进一步氧化，其燃烧产物主要为单质碘，并含有少量的五价碘（HIO3）与一价碘（HI）。当使用AgNO3滴定法测定含量时，用H2O-NaOH溶液-SO2饱和溶液作为吸收液，上述不同价态的碘均转变为负一价的碘（NaI）；若使用间接碘量法测定时，用H2O-NaOH溶液为吸收液，此时吸收液中的待测物转变为碘酸钠（NaIO3）与碘化钠，可用溴-醋酸溶液将其氧化为同一价态，即HIO3后，再加KI使之定量生成单质碘，再用硫代硫酸钠滴定生成的碘。吸收液的选择 含硫药物的燃烧产物主要为SO3，可用浓H2O2与水

15、的混合液作为吸收液，燃烧产物经吸收转变为H2SO4，加入盐酸溶液并煮沸除去剩余的过氧化氢后，加入BaCl2，使硫酸生成BaSO4，以重量法测定含量。含磷药物（有机膦酸类）的燃烧产物为P2O5，以水为吸收液，加入少量硝酸溶液并经煮沸使焦磷酸（H4P2O7）和偏磷酸(HPO3)n转化为磷酸后，采用钼蓝比色法测定含量。硒化合物在有机燃烧分解的同时转化为SeO2（含有少量的SeO3），经硝酸溶液（130）吸收后转变为硒酸（H2SeO4），再用二氨基奈比色法测定。吸收液的选择 操作法：燃烧瓶内加入规定的吸收液瓶口用水湿润小心急速通入氧气后盖上表面皿点燃包有供试品的滤纸，迅速放入燃烧瓶中按紧瓶塞，用少量水

16、封闭瓶口俟燃烧完毕后充分振摇，使生成的烟雾完全吸收用少量水冲洗瓶塞和铂丝，合并洗液和吸收液用同法另作空白实验依法进行鉴别、检查或含量测定例：碘苯酯的含量测定本品主要为10-对碘苯基十一酸乙酯与邻、间位的碘苯基十一酸乙酯的混合物。碘苯酯I精密称定本品约20mg照氧瓶燃烧法进行有机破坏吸收液：2ml氢氧化钠试液+10ml水吸收完全后，加10ml溴-醋酸溶液密塞，振摇，放置数分钟，加甲酸约1ml用水洗涤瓶口，通空气35分钟除去剩余Br蒸汽加碘化钾2g，密塞，摇匀用Na2S2O3（0.02mol/L）滴定，指示剂：淀粉；结果用空白实验校正测定方法IO2/燃烧I2(HIO3、HIO、HI)I2 + 2N

17、aOHNaIO + NaI + H2O3NaIONaIO3 + 2NaI3Br2 + I- + 3H2OIO3- + 6HBrBr2 （过量的）+ HCOOH2HBr + CO2IO3- + 5I- + 6H+3I2+ 3H2OOH-I2 + 2Na2S2O32NaI + Na2S4O6氧瓶燃烧法中的装置和材料有（）A. 磨口硬质玻璃锥形瓶B. 磨口软质玻璃锥形瓶C. 铂丝D. 铁丝E. 无灰滤纸F. 铝丝自测题 氧瓶燃烧法可用于A. 含卤素有机药物的含量测定B. 醚类药物的含量测定C. 检查甾体激素类药物中的氟D. 检查甾体激素类药物中的硒E. 芳酸类药物的含量测定氧瓶燃烧法测定含氯有机药物

18、时所用的吸收液多数为（）A. H2O2溶液B. H2O2-NaOH溶液C. NaOH溶液D硫酸肼饱和液E. NaOH-硫酸肼饱和液第二节 定量分析法的特点一、容量分析法容量分析法（也称滴定法），是将已知浓度的标准物质溶液（滴定液）滴定被测药物溶液，直至滴定液与被测药物反应完全（通过适当方法指示），根据滴定液的浓度和消耗的体积，按化学计量关系计算出被测药物的含量。容量分析法的特点在容量分析法中，常需借助指示剂的颜色改变来判断滴定终点的到达。但滴定终点与反应的化学计量点不一定恰好符合，二者之差称为滴定误差，是容量分析误差的来源之一，为了减少滴定误差，需要选择合适的指示剂。容量分析法所用仪器价廉易得

19、，操作简便、快捷，方法耐用性高，测定结果准确（通常相对误差100）；100：浓度换算因素，将g/100ml换算成g/ml。显色法:当供试品在紫外-可见光区没有强吸收，或虽有吸收，但为了避免干扰或提高灵敏度，加入适当的显色剂显色后进行测定。荧光分析法利用荧光强度与溶液中发射荧光的物质的浓度成正比关系进行定量分析。特点灵敏度高（10-1010-12g/ml）适用与低浓度溶液（浓度太高可致“自熄灭”）对易被光分解的样品，需使用基准溶液代替对照品溶液校正仪器的灵敏度。能产生荧光的物质较少，常需使用荧光衍生试剂得到强荧光，以提高灵敏度和选择性。干扰因素的排除溶剂：溶剂不纯会带来较大误差，蒸馏后再使用。溶

20、液：悬浮物对光有散射作用，过滤或离心除去；溶解氧有降低荧光的作用，通入惰性气体除氧。玻璃仪器：玻璃仪器和测定池应高度洁净。温度：温度对荧光强度有较大影响，需控制温度。测定法CX：供试品溶液的浓度Cr：对照品溶液的浓度RX：供试品溶液的荧光强度Rr：对照品溶液的荧光强度RXb：供试品溶液试剂空白的荧光强度Rrb：对照品溶液试剂空白的荧光强度色谱分析法利用混合物中各组分在吸附剂上的吸附能力的不同或在两相中的分配系数的不同，先行分离后再在线对各组分逐一进行分析。高效液相色谱法：灵敏度高（10-1210-15g/ml）高选择性高效能高速度应用广泛对仪器的一般要求色谱柱填充剂：十八烷基硅烷键合硅胶、辛基

21、（或氨基、氰基）硅烷键和硅胶、离子交换剂（离子交换色谱）、凝胶或高分子多孔微球（分子排阻色谱）；十八烷基硅烷键合硅胶（C18）固定相：甲醇-水、乙腈、缓冲液、反离子物质等可为流动相。但流动相中有机溶剂不应99.5)或对照品考察方法的精密度，相对标准差：0.2；回收率：99.7100.3。 UV法用适当浓度的精制品进行测定，RSD1；制剂的测定，回收率：98102；吸光度A：0.20.7；浓度点：n5。用浓度c 对A 作线性回归处理，得一直线方程，r0.999(n5)，方程截距应近零。各种含量测定方法对效能指标的要求HPLC法RSD0.999，截距应趋于零;专属性：要考查辅料、有关物质或降解产物

22、对主药的色谱峰是否有干扰，如有干扰应设法排除.各种含量测定方法对效能指标的要求（续）精密度是指（）测得的测量值与真值接近的程度测得的一组测量值彼此符合的程度表示该法测量的正确性在各种正常试验条件下，对同一样品分析所得结果的准确程度对供试物准确而专属的测定能力自测题药物杂质检查所要求的效能指标为（） A. 准确度 B. 精密度 C选择性 D. 检测限 E. 耐用性 精密度的一般表示方法有( )A. 相对标准差B. 相对平均偏差C. 相对误差D. 绝对误差E. 标准差 检测限的表示方法有（）A. 百分数 B. ppm C. ppbD. g E. ng用信噪比法表示检测限时，信噪比一般应为（）A.

23、11 B. 31C. 41 D. 51用碘量法测定维生素C原料药时，要求碘量法应具备（）A. 选择性 B. 定量限C. 精密度 D. 检测限E. 线性测定药物片剂的溶出度或释放度时，对所用测定方法应要求( )A. 精密度 B. 定量限C. 耐用性 D. 回收率E. 检测限 药物鉴别试验所要求的效能指标（）A. 准确度B. 精密度C. 选择性D. 检测限E. 耐用性第四节 生物样品分析方法的基本要求一、常用样品的种类、采集和贮藏生物样品包括各种体液和组织。在体内药物分析中常用的是血液、尿液和唾液。血样包括血浆、血清和全血。其中血浆（plasma）和血清（serum）为常用生物样品。测定血中的药物

24、浓度通常是指测定血浆或血清中的药物浓度，而非全血中的药物浓度。供测定用血样的采集：动物实验时，可从动脉或心脏取血；对与患者或志愿者，采取静脉血（或用毛细管采血）。血浆的制备：将采取全血置于含有抗凝剂（如肝素、草酸盐、EDTA等）的试管中，混匀后，以25003000r/min离心5min使血浆与血细胞分离，上清液为血浆。血清的制备：将采取全血在室温下放置0.51小时，待血液凝固后，用细玻棒剥离血饼，以20003000r/min离心510min，上清液为血清。药物与纤维蛋白几乎不结合，血浆与血清中的药物浓度测定值通常是相同的。但血浆比血清分离快，且制取的量多，所以血浆较血清更常用。血样采取后，应及

25、时分离血浆或血清，并立即进行分析。如不能立即测定，应置于具塞硬质玻璃管或聚乙烯塑料离心管中密塞保存。短期保存时，可置于冰箱冷藏（4C）；长期保存需在-20C或-80C下冷冻贮藏。唾液由腮腺、额下腺、舌下腺和口腔粘膜内腺体分泌液混合组成的。口腔粘膜受化学刺激，各唾液腺的分泌会受到影响，造成唾液组成发生较大变化。唾液的采集：在安静状态下进行，漱口后15分钟收集；采集后立即除去泡沫，并以3000r/min离心10分钟，取上清液分析。若分泌量少，可转动舌尖促进唾液分泌，也可采用物理的（如嚼石蜡）或化学的（如酒石酸）方法刺激。但经刺激后唾液中的药物浓度会受影响。唾液采集后，应在4C以下保存。尿液其主要成

26、分：水、含氮化合物（大部分为尿素）及盐类。体内药物（原型或代谢物及其缀合物）的清除主要通过尿液排出。尿液中药物浓度高，采集方便、且采集量大。但尿液浓度变化较大。尿液中药物浓度的改变不能直接反应血药中的浓度。尿液测定主要用于药物剂量回收，尿清除率、生物利用度、以及药物代谢及其代谢途径、类型、速率等的研究。采集的尿液是自然排尿。测定尿中药物的总量时，应收集用药后的一定时间内（如8h、12h或24h）排泄的全部尿液，记录体积后，量取一部分用于药物浓度的测定，在乘以尿量求得排泄总量。肾功能不良者不宜采集尿样。尿液采集后应立即测定，否则应加入防腐剂后置于冰箱中保存。常用防腐剂：甲苯、二甲苯、三氯甲烷，以

27、及醋酸、盐酸等。二、生物样品分析前处理技术生物样品的前处理应主要考虑生物样品的种类、被测药物的性质和所采用的测定方法。依据生物样品类型：血浆或血清需除蛋白，使药物从蛋白结合物中释出。唾液样品应采用离心去除粘蛋白。尿液样品常采用酸或酶水解药物使从缀和物中释出。 依据被测药物的结构及性质，以及存在形式：药物的酸碱性与溶解性涉及药物的萃取手段。是否具有挥发性涉及能否采用气相色谱法测定。光谱特性及官能团性质涉及是否需要制成衍生物。浓度大的样品对前处理要求低，浓度越低的样品对前处理要求越高， 依据所采用的测定方法：纯化程度与所采用的测定方法的专属性、检测系统对不纯样品污染的程度密切相关。放射免疫测定法具

28、有较高的灵敏度和专属性，生物样品只需经初步处理除去主要干扰物即可测定。高效液相色谱法要求除去生物样品中的蛋白质，以防止蛋白质等物质在色谱柱上沉积。蛋白质的去除原因：除去蛋白质可使蛋白质结合型的药物释放出来。避免溶剂萃取过程中的乳化现象。保护仪器性能（如保护HPLC柱不被玷污），延长使用寿命。方法：加入与水混融的有机溶剂有机溶剂使蛋白质凝聚，释放与之结合的药物。常用有机溶剂：乙腈、甲醇、丙酮、四氢呋喃。含药物的血浆与有机溶剂的体积为1:(13)时，可除去90%以上的蛋白质。加入中性盐中性盐使溶液离子强度发生变化，将与蛋白质结合的水置换出来，使蛋白质脱水而沉淀。常用中性盐：饱和硫酸铵、硫酸钠、镁盐

29、、磷酸盐及枸橼酸盐加入强酸当溶液的pH低于蛋白质的等电点时，以阳离子形式存在的蛋白质可与酸根离子形成不溶性盐而沉淀析出。含药物血清与强酸比例为1:0.6混合，可除去90%以上蛋白质。常用强酸：10%三氯醋酸、65%高氯酸、5%偏磷酸。过量的三氯醋酸经加热分解为三氯甲烷和二氧化碳而除去。过量的高氯酸可用碳酸钾、醋酸钾、氢氧化钠等中和后，加乙醇使之生成高氯酸钾（或钠）沉淀除去。偏磷酸可用同法去除。加入含锌盐及铜盐的沉淀剂当pH高于蛋白质的等电点时，蛋白质分子中带负电荷的羧基与金属阳离子形成不溶性盐而沉淀。含药物血清与沉淀剂比例为1:2混合。常用沉淀剂：CuSO4-Na2WO4、ZnSO4-NaOH

30、。酶解法测定某些与蛋白质结合牢固、且对酸不稳定的药物时，需用酶解法使蛋白质分解而释放出药物。常用酶：枯草菌溶素（适用pH：7.011.0，温度：5060C ）。缀合物的水解原因：含羟基、羧基、氨基和巯基的药物可与内源性物质葡萄糖醛酸或硫酸形成葡萄糖酸酐或硫酸酯缀合物。缀合物较原型药物具有较大的极性，不易被有机溶剂萃取。尿中药物多数呈缀合物状态，测定之前，需将缀合物中的药物释放出来。方法：酸水解：加入适量的盐酸溶液进行水解。酶水解遇酸及受热不稳定的药物，可用酶水解；酶水解具有较高的选择性、很少使被测药物发生降解，常被优先采用；常用葡萄酸酐酶或硫酸酯酶或二者混合物；但酶水解时间长、酶制剂带入的粘液

31、蛋白可能导致乳化及污染色谱柱。有机破坏生物样品中的金属离子常与蛋白结合且难以用溶剂萃取，同时金属离子可耐受高温。测定生物样品中金属离子时，多采用有机破坏方法进行前处理。常用HNO3-HClO4作为消解剂，其破坏能力强，适用与各种生物样品。所得金属离子一般为高价态。仪器常用硅玻璃和磞玻璃制成的凯氏烧瓶。分离、纯化与浓集生物样品中的药物浓度较低或分析方法的特异性或灵敏度不够高时，生物样品需进行分离、纯化与浓集处理。液-液萃取法多数药物是亲酯性的，而血样或尿样中的多数内源性干扰物是强极性的水溶性物质。有机溶剂萃取可去除大部分干扰物。有机溶剂的要求：对被测药物的溶解度大、沸点低、易于挥发浓集、与水不相

32、混溶、无毒、不易乳化。常用有机溶剂：乙醚和三氯甲烷有机溶剂相与水相的容积比为1:1或2:1。多数药物是亲酯性的碱性物质，而生物样品中的内源性物质多数是酸性的，生物样品中的药物一般在碱性下萃取。对碱性pH不稳定的药物，可在近中性pH处用三氯甲烷和异丙醇萃取。中性药物则在pH=7附近萃取。液-固萃取法将具有吸附、分配及离子交换性质的、表面积大的担体作为萃取剂填入小柱，以溶剂淋洗后，将生物样品通过，使其药物或内源性干扰物保留在担体上，用适当的溶剂洗去干扰物后，再用适当的溶剂将药物洗脱下来。 优点：较少引入杂质、消除了乳化现象、萃取效率高、处理样品速度快，在室温下操作、适于处理挥发性及对热不稳定的药物

33、。担体：亲水性的硅藻土、疏水性的活性炭、聚苯乙烯或C18化学键合硅胶。浓集末次少量溶剂萃取法在末次萃取时加入的萃取液尽量少，使被测组分萃取到小体积溶剂中，然后直接吸取适量供测定。挥发萃取溶剂法。避免直接加热，防止被测组分破坏或挥发损失。挥发萃取溶剂的常用方法是直接通入氮气流吹干。对与易随气流挥发或遇热不稳定的药物，可用减压法挥发溶剂。溶剂蒸发所用试管，底部应为尖锥形，便于最终量取。化学衍生化药物中含有活泼H者（如 -COOH、-OH、-NH2、-NH-、-SH）均可被化学衍生化。生物样品经化学衍生化在进行分离的目的：使样品中的药物转变成具可被分离的性质提高检测的灵敏度增强药物的稳定性提高对光学

34、异构体分离的能力GC中化学衍生化衍生化可使药物分子中的极性基团，如羟基、氨基、羧基等变成无极性的、易于挥发的药物，从而降低GC温度。主要衍生化反应：烷基化、酰化、硅烷化。常用烷基化试剂：碘庚烷、叠氮甲烷、氢氧化三甲基苯胺（TMAH）等。常用酰化试剂：已酸酐、丙酸酐等。常用硅烷化试剂：三甲基氯硅烷（TMCS）、双-三甲基硅烷乙酰胺（BSA）、双-三甲基硅烷三氟乙酰胺（BSTFA）、三甲基硅烷咪唑（TMTS）。HPLC中化学衍生化衍生化目的：使在没有紫外可见吸收或吸收系数较小的药物生成有强吸收的衍生物，从而提高药物的检测灵敏度。HPLC常用衍生化试剂：邻苯二醛、丹酰氯、荧胺等。采用不对称试剂使光学异构体生成非对映异构体衍生物，然后用HPLC测定。常用不对称试剂(S）-N-三氟乙酰脯氨酰氯、 (S）-N-五氟乙酰脯氨酰氯等。三、定量分析方法的验证生物样品取样量少、药物浓度低、内源性物质干扰