皮肤储存新技术及临床应用ppt实用版课件

1、前 言 据统计，目前世界每年大约有100万人因各种原因而烧（烫）伤。尤其大面积深度烧伤病人，治疗是一个漫长而复杂的过程。通常需要通过异体（种）皮片移植来覆盖创面，而皮源的缺乏往往成为治疗的关键问题之一皮库的意义 54年前英国人Pickerill写下了这样一段话：“毫无争议，创伤整复手术成功的关键之一是有可供给的皮源覆盖因创伤带来的大面积皮肤缺损。实际上在某种情况下，对皮源需要超越一切。因此这启示我们应该注重皮肤的储存与临床应用。”我院皮库简介：自1973年创建皮库以来，分别运用了4、-20和-80低温冰箱皮肤保存法以及液氮储皮方法1987年开始速冻玻璃化储皮方法储存的实验研究和临床应用 我院皮

2、库简介：每年异体尸体皮采集及储存40余具深低温速冻异体皮保存方法的改进使保存皮片活力稳定保持在70%以上，皮片移植成活率达95%以上成为亚洲最大的皮库之一，已储存了3000余具活力良好的尸体皮，供全国30个省市300多家医院使用每年创利润数百万元，经济效益显著我院皮库简介：科研方面曾获国家自然科学基金，首都医学科技发展基金，八五、九五、十五、十一五全军科研基金20余项；出版相关专著10余部，发表学术论著100余篇；培养进修生、研究生数百人获国家科技进步二等奖1项，军队科技进步二等奖6项近年来的研究发现，表皮细胞低温损伤还与细胞骨架、细胞连接桥粒以及细胞间黏附的关系密切低温储存对皮肤组织基底膜影

3、响皮肤低温储存的基础研究进展低温冷冻对皮肤组织-肌动蛋白表达的影响EC(电子偶联反应体系) 结合,将H 结合到大面积烧伤病人创面焦痂的存在引起：FN免疫组化染色结果但目前仍有一些不可忽视的问题存在，如降温速率并不十分满意，抗冻剂的进一步筛选；-196组中桥粒结构、数14天时两组染色程度均降低，D /P 组染色强度降低较明显有效抑制过冷水的不规则形态及促进快速结晶，促进玻璃化行程皮肤从外到内，由表皮、真皮和皮下组织三部分组成玻璃化储存生物组织和细胞，由于降温速率很快，水分没有足够的时间来形成冰晶，即进入均匀的玻璃状态。01，T/D、D/P组间比较，P0.-196组中桥粒结构、数玻璃化储存生物组织

4、和细胞，由于降温速率很快，水分没有足够的时间来形成冰晶，即进入均匀的玻璃状态。该法可以永久保存皮肤，储存后冷冻皮片的平均活力指标可达到新鲜皮片的70 %，较以往的慢速冷冻法提高活力近20 %皮肤1整合素及相关蛋白琥珀酸脱氢酶测定法示意图第一部分 皮肤的低温储存 皮肤储存的基础知识皮肤的结构皮肤的功能皮肤低温储存的重要意义皮肤低温储存的理论依据皮肤的低温损伤机制 皮肤的结构 皮肤从外到内，由表皮、真皮和皮下组织三部分组成皮肤附件作为特化的表皮结构也属于皮肤的重要结构，其中包括汗腺、皮脂腺、毛发、指甲深低温皮肤储存的技术为临床救治大面积烧伤病人创面覆盖工作的顺利开展提供了有力的支持。表皮替代物 表

5、皮细胞膜片的培养低温冷冻对皮肤-辅肌动蛋白表达的影响（平均积分光密度,XSD，n=6）14天时两组染色程度均降低，D /P 组染色强度降低较明显每年异体尸体皮采集及储存40余具原理：有活力的组织均有代谢耗氧表2 低温储存对皮肤表皮FN和LN含量的影响新鲜豚鼠皮朗格汉斯细胞数量较多、呈树突状轮廓-196储存皮肤-catenin免疫组化染色 360胞内生成冰晶，长大到一定程度，引起细胞壁及细胞内超微结构的变化，甚至导致细胞死亡，是降温速率较快时引起损伤的主要原因低温储存对皮肤组织基底膜影响-196组中基底膜结构基本与新鲜组相似；015 0.海藻糖对低温保存皮肤1整合素的实验研究表皮 从上到下又分为

6、 角质层、透明层、颗粒层、棘层、基底层（平均积分光密度,XSD，n=6）014 0.新鲜皮肤桥粒结构清晰、当大面积烧伤或皮肤缺损超过体表面积的30%时，自体供皮受限14天时两组染色程度均降低，D /P 组染色强度降低较明显低温冷冻对皮肤组织-肌动蛋白表达的影响皮肤的结构 表皮 从上到下又分为 角质层、透明层、颗粒层、棘层、基底层 真皮 分为乳头层、网状层。主要有结缔组织构成，包括胶原纤维、弹力纤维、网状纤维。此外皮肤附件，血管、淋巴管、神经末梢皮肤的主要功能：保护作用感觉作用体温调节作用分泌和排泄作用吸收作用水分 电解质皮肤缺失热量 蛋白质病原体 贫血 低蛋白血症 创面脓毒症MODS死亡大面积

7、烧伤病人创面焦痂的存在引起： 体液的丢失 有害介质释放侵袭性感染的滋生地机体超高代谢多器官功能衰竭及并发症皮肤储存的必要性：当大面积烧伤或皮肤缺损超过体表面积的30%时，自体供皮受限临床实践证明：具有活力的异体皮仍是目前最为理想的创面覆盖物 异体皮来源时间受限皮片的来源及种类自体皮 烧伤治疗中最为常用的皮片，其来源受 到供皮区的限制异种皮 以猪皮多见。取材方便，但移植后排斥 时间短，有时难以达到覆盖创面的目的同种异体皮 主要来源于成人新鲜尸体，其次为新 鲜死婴皮 皮肤的低温储存 低温储存理论依据 理论上，储存温度越低，储存物活力保持的时间越长，细胞组织代谢越低，污染的细菌也不易繁殖表皮肤储存方

8、法比较项目 4 -20 -80 -196 费用 少 少 较贵 贵（补液氮） 保存时间(d) 3-7 45 12个月 理论无限期 最佳活力(%) 30-80 50-60 50-60 70低温损伤机制： 低温保存关键在于解决低温损伤对生物组织的影响。经典的低温生物学认为在低温条件下，细胞主要受到来自两种因素的损伤即溶质性损伤和胞内冰损伤，即“两因素”学说“两因素”学说胞内冰晶损伤 胞内生成冰晶，长大到一定程度，引起细胞壁及细胞内超微结构的变化，甚至导致细胞死亡，是降温速率较快时引起损伤的主要原因溶质性损伤（高渗性损伤） 细胞外水分结冰，导致细胞内外溶液浓度的升高并持续较长的时间。由高渗引起细胞的损

9、伤，是降温速率较慢时引起损伤的主要原因下图为液氮储存48h后皮片匀浆电泳结果有效抑制过冷水的不规则形态及促进快速结晶，促进玻璃化行程琥珀酸钠+红四氮唑 延胡索酸+甲方法：皮片经PBS洗涤后加入SYTO 50ul,37避光孵育30， PBS洗涤加入50ulEB,水浴避光孵育30 后PBS洗涤。速冻玻璃化储皮的优点及效果：4组基底膜变薄，出现断裂，结构模糊不清，半桥粒明显减少玻璃化储存生物组织和细胞，由于降温速率很快，水分没有足够的时间来形成冰晶，即进入均匀的玻璃状态。-80储存E-cadherin免疫组化染色 36001，T/D、D/P组间比较，P0.表3 低温储存对皮肤表皮Dsg1和Dsg2含

10、量的影响-80储存皮肤-catenin免疫组化染色 360据统计，目前世界每年大约有100万人因各种原因而烧（烫）伤。深低温皮肤储存的技术为临床救治大面积烧伤病人创面覆盖工作的顺利开展提供了有力的支持。皮肤1整合素及相关蛋白获国家科技进步二等奖1项，军队科技进步二等奖6项014 0.该法可以永久保存皮肤，储存后冷冻皮片的平均活力指标可达到新鲜皮片的70 %，较以往的慢速冷冻法提高活力近20 %大张异体皮+微粒皮制备方法皮肤附件作为特化的表皮结构也属于皮肤的重要结构，其中包括汗腺、皮脂腺、毛发、指甲酶) 脱氢反应与细胞组织中的呼吸链（平均积分光密度,XSD，n=10）抗冻剂的作用机制有以下两点：

11、“两因素”学说皮肤结构与储存的关系 皮肤不是单细胞成分，而是由表皮和真皮构成的复合组织，由于皮肤内的各种主要细胞成分的结构与功能的复杂性，各种细胞代谢与营养条件不同,对环境改变的适应性亦有所不同。因此皮肤的低温损伤是一个更为非常复杂的过程皮肤低温损伤的其他因素 近年来的研究发现，表皮细胞低温损伤还与细胞骨架、细胞连接桥粒以及细胞间黏附的关系密切低温损伤的干预：玻璃化储皮方法的发展抗冻液的使用玻璃化的基础知识 玻璃化的概念 玻璃化是一个物理学的概念，是指当水或溶液在极快降温到或低于-100-110的温度范围时，形成一种具有高黏度的界于液态和固态之间、非晶体态的、杂乱无章的、透明的玻璃状态 玻璃化

12、储存的特点： 玻璃化储存生物组织和细胞，由于降温速率很快，水分没有足够的时间来形成冰晶，即进入均匀的玻璃状态。这种玻璃态的物理性能与晶体态不同，是一种既可以避免或减轻冷冻过程组织的损伤，又是同时可长期保存组织的良好方法两种方法的比较慢降温速率冰晶形态玻璃化速冻时冰晶的形态皮肤的玻璃化储存 皮肤在196的深低温环境中，其组织和细胞内各种酶的活力及代谢很低甚至近乎零，即所谓的“生命悬持状态 ”。在此温度下保存的皮肤理论上可无限期储存玻璃化的理想条件理论上说，体积很小的1微升纯水要用106-107/s降温速率才能形成玻璃态皮肤玻璃化储存的途径以水为主要成分的生物组织,实现完全玻璃化需要极高的降温速率

13、。目前只能采用各种方法实现部分玻璃化，抑制冰晶形成和长大，避免细胞严重损伤皮肤玻璃化储存的途径冷源问题 目前国内各家皮库主要采用液氮作为冷源，温度可达-196，皮片直接放入液氮后，其最快的降温速率可达2160/min整合素（Integrin）示意图异体皮匀浆免疫火箭电泳图低温冷冻对皮肤组织-肌动蛋白表达的影响第二步成为亚洲最大的皮库之一，已储存了3000余具活力良好的尸体皮，供全国30个省市300多家医院使用-196组中基底膜结构基本与新鲜组相似；新鲜正常皮肤组织1integrin分布基底细胞细胞膜或胞浆低温冷冻对皮肤组织-肌动蛋白表达的影响在此温度下保存的皮肤理论上可无限期储存由高渗引起细胞

14、的损伤，是降温速率较慢时引起损伤的主要原因我院自行设计的测氧仪外观与新鲜组皮肤比较，*P0.抗冻剂的作用机制有以下两点：异体皮发黑变干脱落创面愈合采用该法保存的皮肤临床具有质地柔软、植皮后转红快、成活率高（95%左右）、存活期长等优点多器官功能衰竭及并发症贫血 低蛋白血症 创面脓毒症（平均积分光密度,XSD，n=6）琥珀酸钠+红四氮唑 延胡索酸+甲常用的皮肤活力的鉴定方法异种皮 以猪皮多见。异体皮来源受到极大的限制；皮肤玻璃化储存的途径储存的皮肤往往因具有一定的厚度和面积带来冷源温度传导困难和储存不便 ，因此可设计成皮卷形式皮肤玻璃化储存的途径降温速率 冷却的铜板预冷皮肤后即将其直接浸入液氮

15、预冷铜板示意图抗 冻 剂 的 应 用抗冻液的作用及机制： 深低温储存组织离不开抗冻液的保护，否 则皮肤将受到严重的损伤 抗冻剂的作用机制有以下两点：有效抑制过冷水的不规则形态及促进快速结晶，促进玻璃化行程缓冲因冰形成而造成的渗透压升高，减轻溶质损害目前较为成熟抗冻液配方 H液（20%二甲基亚砜、6%丙二醇），以此作为玻璃化储存皮肤的抗冻液 一般10000cm2面积的皮肤约需抗冻液3000ml30分钟6小时内皮片新洁尔灭生理盐水H抗冻液玻璃化储皮及使用步骤临床使用液氮复温401530皮卷生理盐水生理盐水总结：玻璃化储存皮肤的步骤异体皮的采集消毒皮肤的修整抗冻液的处理包装快速降温液氮容器的管理异种

16、皮 以猪皮多见。琥珀酸脱氢酶测定法示意图有效抑制过冷水的不规则形态及促进快速结晶，促进玻璃化行程表3 低温储存对皮肤表皮E-cadherin和-catenin含量的影响1987年开始速冻玻璃化储皮方法储存的实验研究和临床应用细胞膜的影响 降低细胞的流动性同种异体皮 主要来源于成人新鲜尸体，其次为新低温冷冻对皮肤组织-肌动蛋白表达的影响有效抑制过冷水的不规则形态及促进快速结晶，促进玻璃化行程新鲜组束状广泛分布于细胞质中，T/D组少量断裂和分叉，束状密集分布。（平均积分光密度,XSD，n=6）表皮 从上到下又分为 角质层、透明层、颗粒层、棘层、基底层EC(电子偶联反应体系) 结合,将H 结合到低温

17、储存对皮肤组织基底膜影响糊不清，数量明显减少第二部分临床实际应用低温冷冻对皮肤组织桥粒芯糖蛋白1表达的影响缓冲因冰形成而造成的渗透压升高，减轻溶质损害低温冷冻对皮肤层粘连蛋白laminin表达的影响-80储存皮肤FN免疫组化染色 360（平均积分光密度,XSD，n=6）014 0.细胞膜的影响 降低细胞的流动性细胞骨架受损表皮细胞黏附率降低基底膜的破坏玻璃化对皮肤结构和功能的影响玻璃化对皮肤抗原性影响皮肤经低温储存后，异体皮的存活时间较新鲜异体皮长低温储存后皮片抗原性降低，可能与皮肤内朗格汉斯细胞（LS）数量降低有关保存温度越低，抗原性越弱，移植后存活时间越长低温对朗格汉斯细胞的影响 新鲜豚鼠

18、皮朗格汉斯细胞数量较多、呈树突状轮廓 -196豚鼠皮朗格汉斯细胞数量明显减少、树突变短异体皮匀浆免疫扩散电泳图 右侧为新鲜皮匀浆与抗体形成的沉淀环;左侧为液氮储存48h后与抗体形成的沉淀环，面积明显缩小异体皮匀浆免疫火箭电泳图上图为新鲜皮匀浆电泳结果下图为液氮储存48h后皮片匀浆电泳结果皮肤活力的鉴定常用的皮肤活力的鉴定方法皮肤氧耗量测定法琥珀酸钠脱氢酶测定法四氮唑盐WST-1法SYTO/EB双重染色法皮肤氧耗量测定法 原理：有活力的组织均有代谢耗氧 恒温营养液内微电极（铂、银电极）与有活力的皮肤接触，表面氧分压下降，通过放大器测下降程度，推算出皮肤的活力，操作可在1h内完成我院自行设计的测氧

19、仪外观琥珀酸脱氢酶测定法测定原理琥珀酸钠+红四氮唑 延胡索酸+甲琥珀酸脱氢酶H+月替琥珀酸脱氢酶测定法示意图 皮片氮气琥珀酸钠+红四氮唑37水浴1h乙二醇乙醚皮片OD490um/mg（活力单位）四氮唑盐WST-1法 原理:利用活组织或细胞中的线粒体琥珀酸四氮 唑反应体系(RS) ,作用在亚细胞呼吸链反 应中的还原型辅酶 (NADH)、NAD +(辅 酶) 脱氢反应与细胞组织中的呼吸链 EC(电子偶联反应体系) 结合,将H 结合到 WST-1 的甲氮唑苯环上,打开其四氮唑苯 环而显色低温冷冻对皮肤组织桥粒芯糖蛋白2表达的影响-80储存皮肤FN免疫组化染色 360总结：玻璃化储存皮肤的步骤大面积烧

20、伤病人创面焦痂的存在引起：低温对朗格汉斯细胞的影响多器官功能衰竭及并发症015 0.低温冷冻对皮肤组织-肌动蛋白表达的影响皮肤细胞外基质（纤维连接蛋白、层粘连蛋白等）、骨架蛋白（微丝、微管、中间丝）以及细胞间连接桥粒结构可能是低温损伤的关键位点深低温储存组织离不开抗冻液的保护，否低温储存对皮肤组织基底膜影响成为亚洲最大的皮库之一，已储存了3000余具活力良好的尸体皮，供全国30个省市300多家医院使用尤其大面积深度烧伤病人，治疗是一个漫长而复杂的过程。-80组大片束状结构解聚，空隙增大，见断裂和分叉；-80储存皮肤FN免疫组化染色 360胞内生成冰晶，长大到一定程度，引起细胞壁及细胞内超微结构

21、的变化，甚至导致细胞死亡，是降温速率较快时引起损伤的主要原因由高渗引起细胞的损伤，是降温速率较慢时引起损伤的主要原因组别第二步019 0.新鲜皮肤FN免疫组化染色 360通过488/520nm激发，在荧光显微镜下观察四氮唑盐WST-1法琥珀酸四氮唑反应体系(RS)琥珀酸脱氢酶H+呼吸链WST-1显色反应SYTO/EB双重染色法为一种敏感、快速的皮肤活力检测法,采用新型穿透性核酸染色剂SYTO和EB方法：皮片经PBS洗涤后加入SYTO 50ul,37避光孵育30， PBS洗涤加入50ulEB,水浴避光孵育30 后PBS洗涤。通过488/520nm激发，在荧光显微镜下观察玻璃化对皮肤活力的影响 通

22、过对氧耗量及琥珀酸脱氢酶活力的测定发现玻璃化储存的皮肤活力较慢冻法提高了将近20%速冻玻璃化储皮的优点及效果：该法可以永久保存皮肤，储存后冷冻皮片的平均活力指标可达到新鲜皮片的70 %，较以往的慢速冷冻法提高活力近20 %采用该法保存的皮肤临床具有质地柔软、植皮后转红快、成活率高（95%左右）、存活期长等优点第二部分临床实际应用冷冻异体皮的适用范围开放性创面、深度烧伤创面和切痂创面的暂时性覆盖用于邮票、网状或自体微粒皮的覆盖移植，保证下方自体微粒皮成活用于自体皮源紧张的烧伤后期整形重建手术，作为自体微粒皮的支架用于暂不适合自体皮的创面覆盖以改善创基情况 异体皮覆盖创面的意义防止创面干燥，减少水

23、分及热量丧失 防止电解质、蛋白质及血细胞丢失减少创面污染，减轻患者疼痛有利于关节部位早日活动保护暴露的组织，促进肉芽成熟、创面愈合，具有抗感染能力低温储存后抗原性降低，创面覆盖时间延长应用方法 大张异体皮嵌植小块自体皮 大张异体皮自体微粒皮移植目前临床应用较多的是第二种方法大张异体皮+微粒皮制备方法 第一步复 温减少创面污染，减轻患者疼痛019 0.玻璃化储存生物组织和细胞，由于降温速率很快，水分没有足够的时间来形成冰晶，即进入均匀的玻璃状态。（平均积分光密度， XSD，n=10）低温储存对皮肤组织基底膜影响目前国内各家皮库主要采用液氮作为冷源，温度可达-196，皮片直接放入液氮后，其最快的降

24、温速率可达2160/min方法：皮片经PBS洗涤后加入SYTO 50ul,37避光孵育30， PBS洗涤加入50ulEB,水浴避光孵育30 后PBS洗涤。细胞外水分结冰，导致细胞内外溶液浓度的升高并持续较长的时间。皮肤从外到内，由表皮、真皮和皮下组织三部分组成在此温度下保存的皮肤理论上可无限期储存第二部分临床实际应用每年创利润数百万元，经济效益显著015 0.据统计，目前世界每年大约有100万人因各种原因而烧（烫）伤。应中的还原型辅酶 (NADH)、NAD +(辅2周时间，D/P组基底膜部分区域结构稍有松散，模糊不清，半桥粒数量有所下降，T/D组基底膜较完整，厚度大致均匀，半桥粒未见明显渐少，

25、低温储存对皮肤组织基底膜影响玻璃化储存生物组织和细胞，由于降温速率很快，水分没有足够的时间来形成冰晶，即进入均匀的玻璃状态。（平均积分光密度， XSD，n=10）目前国内各家皮库主要采用液氮作为冷源，温度可达-196，皮片直接放入液氮后，其最快的降温速率可达2160/min下图为液氮储存48h后皮片匀浆电泳结果异体皮来源受到极大的限制；大张异体皮+微粒皮制备方法 第二步微粒皮的制备大张异体皮+微粒皮制备方法 第三步 漂 皮创 面 处 理 前 切 削 痂 后 创 面大张异体皮覆盖创面 微粒皮植皮注意事项植皮面积与微粒皮比例 自体微粒皮与异体皮的比例为1:101:15较好.自 体皮源极度缺乏时甚至

26、可达1:20微粒皮正反面问题微粒皮均匀分散临床变化异体皮发黑变干脱落创面愈合 移植皮片3-4天转红，1-2周异体皮色泽近似正常皮肤，此后呈斑点状或斑片状发黑区即为成活的自体微粒皮。4-6周异体皮坏死成干痂，但仍附着牢固，此时微粒皮融合成片，以后异体皮完全变干脱落，创面修复完成。未见异体皮发黑，变干，脱落而创面愈合临床病例创面临 床 病 例术中削痂后覆盖异体皮临 床 病 例术后4w异体皮排斥术后45d创面基本愈合低温冷冻对皮肤组织-肌动蛋白表达的影响工聚合材料异体皮发黑变干脱落创面愈合玻璃化储存生物组织和细胞，由于降温速率很快，水分没有足够的时间来形成冰晶，即进入均匀的玻璃状态。* 与新鲜皮片组

27、相比，P0.自体皮 烧伤治疗中最为常用的皮片，其来源受与新鲜组皮肤比较，*P0.海藻糖对低温保存皮肤桥粒芯糖蛋白1的实验研究低温储存对皮肤组织基底膜影响FN免疫组化染色结果皮肤低温损伤的其他因素大张异体皮+微粒皮制备方法常用的皮肤活力的鉴定方法玻璃化储存的特点：-80储存皮肤LN免疫组化染色 360深低温皮肤储存的技术为临床救治大面积烧伤病人创面覆盖工作的顺利开展提供了有力的支持。近年来的研究发现，表皮细胞低温损伤还与细胞骨架、细胞连接桥粒以及细胞间黏附的关系密切与新鲜组皮肤组织比较，P0.鲜死婴皮海藻糖对低温保存皮肤后-肌动蛋白的实验研究1987年开始速冻玻璃化储皮方法储存的实验研究和临床应

28、用真皮替代物 脱细胞异体真皮 、人皮肤低温储存的基础研究进展 皮肤细胞外基质（纤维连接蛋白、层粘连蛋白等）、骨架蛋白（微丝、微管、中间丝）以及细胞间连接桥粒结构可能是低温损伤的关键位点 新型抗冻剂 海藻糖的发现，可进一步优化低温抗冻液配方细胞微环境略图黏附连接缝隙连接紧密连接桥粒各种细胞连接示意图海藻糖分子结构示意图FN免疫组化染色结果 新鲜皮肤FN免疫组化染色 360-196储存皮肤FN免疫组化染色 360-80储存皮肤FN免疫组化染色 3604储存皮肤FN免疫组化染色 360 LN免疫组化染色结果 新鲜皮肤LN免疫组化染色 360-196储存皮肤LN免疫组化染色 3604储存皮肤LN免疫组

29、化染色 360 -80储存皮肤LN免疫组化染色 360表2 低温储存对皮肤表皮FN和LN含量的影响（平均积分光密度， XSD，n=10）标本组别FNLN新鲜皮肤144.143.6156.540.7 -196组121.338.4127.837.3 -80组68.917.9*85.916.4* -20组31.48.7*54.89.3* 4组22.84.6*22.47.6* 与新鲜皮片组相比，P0.01E-cadherin免疫组化染色结果 新鲜皮肤E-cadherin免疫组化染色 3604储存皮肤E-cadherin免疫组化染色 360-80储存E-cadherin免疫组化染色 360-196储存皮

30、肤E-cadherin免疫组化染色360-catenin免疫组化染色结果 方法：皮片经PBS洗涤后加入SYTO 50ul,37避光孵育30， PBS洗涤加入50ulEB,水浴避光孵育30 后PBS洗涤。新鲜皮肤基底膜完整、密度正常，连续性好，半桥粒结构清晰可见，分布均匀；异体皮匀浆免疫扩散电泳图（25K，电镜）组别海藻糖对低温保存皮肤1整合素的实验研究组别每年异体尸体皮采集及储存40余具低温冷冻对皮肤组织桥粒芯糖蛋白1表达的影响低温对朗格汉斯细胞的影响鲜死婴皮通过对氧耗量及琥珀酸脱氢酶活力的测定发现玻璃化储存的皮肤活力较慢冻法提高了将近20%下图为液氮储存48h后皮片匀浆电泳结果（平均积分光密

31、度,XSD，n=10）皮肤细胞外基质（纤维连接蛋白、层粘连蛋白等）、骨架蛋白（微丝、微管、中间丝）以及细胞间连接桥粒结构可能是低温损伤的关键位点成为亚洲最大的皮库之一，已储存了3000余具活力良好的尸体皮，供全国30个省市300多家医院使用体皮源极度缺乏时甚至可达1:20015 0.-80储存皮肤-catenin免疫组化染色 360目前国内各家皮库主要采用液氮作为冷源，温度可达-196，皮片直接放入液氮后，其最快的降温速率可达2160/min环而显色两种低温保护剂对皮肤组织1integrin表达变化影响新鲜皮肤-catenin免疫组化染色 360-196储存皮肤-catenin免疫组化染色 3

32、60 -80储存皮肤-catenin免疫组化染色 360 4储存皮肤-catenin免疫组化染色 360 表3 低温储存对皮肤表皮E-cadherin和-catenin含量的影响 （平均积分光密度,XSD，n=10）* 与新鲜皮片组相比，P0.01标本组别E-cadherin-catenin新鲜皮肤76.618.5100.223.9-196组61.823.487.817.3-80组 23.911.4 * 65.918.4 *-20组24.48.7 *34.89.3 *4组18.85.6 *22.47.6 * 新鲜皮肤表皮层细胞结构清晰，排列正常，胞核圆形或椭圆形，196皮肤结构基本正常，有少量

33、胞质水肿，淡染，胞核缩小。 (HE400) 低温冷冻对皮肤组织-肌动蛋白表达的影响新鲜组196组 新鲜皮肤组织-actin主要分布于细胞质，颜色均匀分布,阳性反应强，196组阳性反应减弱，但结构清晰，胞质染色基本呈红色 。(SP200) 新鲜组196组低温冷冻对皮肤组织-肌动蛋白表达的影响透射电镜下观察低温冷冻对皮肤组织微丝的影响 新鲜组较粗,束状广泛均匀分布。-80组大片束状结构解聚，空隙增大，见断裂和分叉；4组分布不均，细丝样物质明显减少，结构松散，粗细不等。 -196组分布较广泛，呈束状(20K，电镜） 新鲜组 -80 4 -196 新鲜皮肤颜色均匀，阳性反应强，T/D组近似，但有少量细

34、胞质水肿，胞核缩小。D/P组呈淡黄色，DMEM组呈阴性反应。 （SP200，光镜） T/DD/PDMEM新鲜组海藻糖对低温保存皮肤后-肌动蛋白的实验研究透射电镜下观察CPA对低温保存皮肤后微丝的影响 新鲜组束状广泛分布于细胞质中，T/D组少量断裂和分叉，束状密集分布。D/K组呈簇状不均匀分布，空隙增大，解聚断裂；DMEM组大部分已解聚断裂，无明显束状结构。 （25K，电镜） 新鲜T/DD/KDMEM皮肤1整合素及相关蛋白免疫组化染色结果 基质蛋白-整合素-踝蛋白-骨架蛋白关系模型laminin整合素是一类位于细胞表面黏附分子，属跨膜糖蛋白胞外区与基质蛋白相连，胞内区与细胞骨架相连，介导细胞内外

35、双向信息传递1整合素位于皮肤基底细胞表面，维系表皮、真皮之间的连接，对维持细胞膜完整性及功能起着重要的作用整合素（Integrin）示意图新鲜组196组-20组4组低温冷冻对皮肤组织1整合素表达的影响新鲜正常皮肤组织1integrin分布基底细胞细胞膜或胞浆低温冷冻对皮肤层粘连蛋白laminin表达的影响新鲜正常皮肤组织laminin表达在真皮和表皮连接处新鲜组196组20组4组低温冷冻对皮肤层踝蛋白talin表达的影响新鲜正常皮肤组织talin分布于基底细胞新鲜组196组20组4组低温冷冻对皮肤-辅肌动蛋白表达的影响各温度组皮肤组织-actinin表达新鲜组196组4组80组低温储存对皮肤表

36、皮1integrin、 laminin、 talin含量的影响 （平均积分光密度,XSD，n=10）与新鲜组皮肤组织比较，P0.05, *P0.01标本组别1integrinlaminin talin新鲜皮肤0.2560.016 0.2650.016 0.2160.012 -196组0.2450.0210.2470.025 0.1940.013* -80组0.2320.0120.2380.020 0.1790.009* -20组0.1650.015* 0.1760.013* 0.1630.010*4组0.1350.011* 0.1470.015* 0.1520.017* 低温储存对皮肤组织基底

37、膜影响新鲜组196组4组新鲜皮肤基底膜完整、密度正常，连续性好，半桥粒结构清晰可见，分布均匀； -196组中基底膜结构基本与新鲜组相似； 4组基底膜变薄，出现断裂，结构模糊不清，半桥粒明显减少海藻糖对低温保存皮肤1整合素的实验研究T/D-7d组D/P -7d组T/D-14d组D /P -14d组14天时两组染色程度均降低，D /P 组染色强度降低较明显两种低温保护剂对皮肤组织1integrin表达变化影响 （平均积分光密度,XSD，n=6）与新鲜组皮肤比较，*P0.05, *P0.01，T/D、D/P组间比较，P0.05,P0.01 组别 7 天 14天新鲜组T/D组 D/P组 0.2960.

38、019 0.2960.019 0.2870.015 0.2790.010 0.2840.014 0.2490.018* 桥粒透射电镜下观察CPA对低温保存皮肤基底膜的影响T/D-7d组D /P -7d组T/D-14d组D /P -14d组2周时间，D/P组基底膜部分区域结构稍有松散，模糊不清，半桥粒数量有所下降，T/D组基底膜较完整，厚度大致均匀，半桥粒未见明显渐少，桥粒芯糖蛋白1、2免疫组化染色结果 锚着在桥粒斑上的细胞骨架细丝胞质桥粒斑蛋白细胞间空隙桥粒芯蛋白相邻细胞膜桥粒结构示意图 新鲜皮肤组织桥粒芯糖蛋白1主要分布于颗粒细胞层，20组，4组阳性反应明显减弱。(SP400) 低温冷冻对皮

39、肤组织桥粒芯糖蛋白1表达的影响-20新鲜组-1964 新鲜皮肤组织桥粒芯糖蛋白2主要分布于基底细胞层，20组，4组阳性反应明显减弱。(SP400) 低温冷冻对皮肤组织桥粒芯糖蛋白2表达的影响新鲜组-1964-20表3 低温储存对皮肤表皮Dsg1和Dsg2含量的影响 （平均积分光密度,XSD，n=10）* 与新鲜皮片组相比，P0.05标本组别Dsg1Dsg2新鲜皮肤0.2870.0080.2540.007-196组0.2830.0050.2470.006-80组0.2720.007 *0.2390.007 *-20组0.2350.018 *0.1640.008 *4组0.2030.012 *0.1150.021 * 新鲜皮肤桥粒结构清晰、 完整、数量较多 -196组中桥粒结构、数 量基本与新鲜组相似 4组桥粒出现断裂，结构模 糊不清，数量明显减少新鲜组-1964桥粒桥粒桥粒透射电镜下观察低温冷冻对皮肤组织桥粒的影响海藻糖对低温保存皮肤桥