药学分子生物学：第八章 药物转录组学

1、第八章 药物转录组学1第一节 转录组学概述一、转录组广义概念：是指在某一生理条件下，一种细胞、组织、器官或生物体所能转录出来的所有RNA的总和，包括mRNA和非编码RNA。狭义概念：是指一个活细胞所能转录出来的所有mRNA，即从基因组DNA转录的基因总和，也称为表达谱。编码和非编码RNA细胞的RNA含量可以分为两类编码RNA非编码RNA编码RNAmRNA4%寿命短细菌的mRNA半衰期几分钟，真核细胞大部分mRNA的半衰期也只有几小时转录组的成分不是固定的，可以通过快速的改变mRNA的合成来改变非编码RNArRNAtRNA真核生物特有的RNA小核RNA（Small nuclear RNA） (s

2、nRNA; 也叫 U-RNA ）参与前体mRNA的剪接小核仁RNA(Small nucleolar RNA) (snoRNA),参与rRNA前体的加工以及 核糖体亚基的装配。小胞质RNA(scRNA), 包括几种，有些功能已知，有些功能还未知小核RNA（ snRNA,核内小RNA）存在于真核细胞的细胞核内，为小分子核糖核酸，长度为106-189个核苷酸。作用：参与hnRNA 的剪接和转运。hnRNA：核内不均一RNA，是成熟mRNA的前体。二、转录组与基因组的关系基因组是相对稳定的转录组是高度动态的时间特异性空间特异性：5%的基因在特定组织中特异表达2022/7/249三、转录组学（一）转录组

3、学概念是一门在整体水平上研究细胞中基因转录的情况及转录调控规律的学科。转录组学研究内容无参考基因组的大规模功能基因的发掘非编码区域功能研究：Non-coding RNA研究、microRNA前体研究等转录本结构研究：UTR鉴定、Intron边界鉴定、可变剪切研究、融合基因鉴定等基因转录水平研究全新转录区域研究基于杂交：基因芯片技术（寡核苷酸芯片、cDNA芯片基于测序：基因表达系列分析（SAGE）、大规模平行信号测序（MPSS）、RNA测序技术。（二）转录组学研究方法mRNA检测技术核酸杂交技术原位杂交逆转录PCR (RT-PCR)RACE（cDNA末端快速克隆技术）Real-time PCR全

4、长cDNA文库核酸杂交原理northern blot探针制备放射性同位素标记物-32P-dCTP灵敏度达0.01pg非放射性标记物地高辛灵敏度达0.1pgDIG-dUTP-通过酶促反应掺入到DNA/RNA中去制成探针-杂交-加抗地高辛-酶的复合物加底物显色探测不同条件下的基因表达变化B. WITEK-ZAWADA,200328S rRNA18S rRNA原位杂交FISH：Fluorescence In Situ Hybridization原位杂交2022/7/2419原位杂交Moroz LL, 2006逆转录(Reverse transcription)逆转录酶：依赖于RNA的DNA聚合酶。这

5、种酶是 1970 年美国科学家特明 (H. M. Temin) 和巴尔的摩 (D. Baltimore) 分别于动物致癌 RNA 病毒中发现，他们并因此获得 1975 年度诺贝尔生理学或医学奖。M-MLVAMVRT-PCRRT-PCR是将RNA的反转录（RT）和cDNA的聚合酶链式扩增（PCR）相结合的技术。首先经反转录酶的作用从RNA合成 cDNA，再以cDNA为模板，扩增合成目的片段。RACE（cDNA末端快速克隆技术）RACE(rapid-amplification of cDNA ends)是通过PCR进行cDNA末端快速克隆的技术。RACE是基于PCR技术基础上由已知的一段cDNA片

6、段，通过往两端延伸扩增从而获得完整的3端和5端的方法2022/7/24233 RACE以mRNA的polyA为锚定5 RACE原理上比3RACE要稍微复杂要点: 逆转录酶MMLV合成cDNA具有加尾特性，即在合成的cDNA链3加上3-4个dCTP，而且当存在帽子结构时该酶的加尾活性最高然后以这段polyC为锚定Real-time PCR 基本原理Ct：threshold cycleSYBR-Green荧光染料标定dsDNATaqMan探针法2022/7/2428理论上N1/N2 = 2Ct实际上PCR扩增的效率并非100%CtN1N2cDNA文库(cDNAlibrary)cDNA：以RNA为模

7、板，在反转录酶的作用下合成的DNA。cDNA文库：从一定生长阶段或条件的某种细胞分离到的全部mRNA经反转录成 cDNA后再重组和增殖形成的基因文库。cDNA文库的特点 1. 细胞特异性 来自结构基因，仅代表正在表达的基因的遗传信息： 1-5% mRNA，80-85% rRNA，10-15% tRNA 2. 组织、器官特异性 不同器官或组织的功能不一样4. 可了解基因的表达丰度 在同一个cDNA文库中，不同类型的cDNA分子的数目是大不相同的，尽管它们都是由单拷贝基因转录而来的。这与基因组文库中的单拷贝基因均具有相同的克隆数相较，这是两种文库的另一差别。3. 代谢或发育特异性 处于不同代谢阶段

8、（或发育阶段）的结构基因表达亦不相同 cDNA文库的优点cDNA不存在间隔序列cDNA文库的缺点要测序所有的cDNA克隆，费时费力每一个cDNA克隆都只含有一种mRNA序列cDNA基因文库 是分离基因的重要手段 基于杂交：基因芯片技术（寡核苷酸芯片、cDNA芯片基于测序：基因表达系列分析（SAGE）、大规模平行信号测序（MPSS）、RNA测序技术。（二）转录组学研究方法371、基因芯片技术基因芯片又称DNA芯片(DNA chip)或DNA微阵列(DNA microarray)。将大量的DNA片段(寡核苷酸、cDNA或基因组DNA片段)有序地、高密度地固定排列在载体(玻璃片、硅片或纤维膜等)上制

9、成点阵，称之为基因芯片。 38基因芯片的原理基因芯片技术是建立在基因探针和杂交测序技术上的一种 高效、快速的 核酸序列分析手段。 39基因芯片发展历史Southern & Northern BlotDot BlotMacroarrayMicroarray40图1 生物芯片分析步骤芯片设计芯片制作PCR扩增靶基因标记原位合成点样方法实际应用样品处理芯片杂交数据分析信号检测放射显影光化学电化学酶促反应41芯片微阵列制备基因芯片的核心技术是如何在一个有限的固相载体表面固定大量的探针阵列。42载体 玻片 固体片状 硅片 瓷片 硝酸纤维素膜 膜性材料 尼龙膜 聚丙烯膜 43载体材料表面不具备活性基团，需

10、经活化后才能用于在载体上合成探针和固定已经合成的寡核苷酸探针。载体表面的活化主要是涂布多聚赖氨酸或者包被氨基硅烷偶联试剂，使载体表面带有羟基或者氨基等活性基团。44探针在载体表面的固定 光去保护并行合成法原位合成 分子印章原位合成法 喷印合成法（压电打印法） 合成点样：通过特定的高速点样机器人直接将探针点在芯片上的技术。 45A、原位合成基因芯片的原位合成法是基于组合化学的合成原理。它通过一组定位模板来决定基片表面上不同化学单体的偶联位点和次序，如要合成AGCT四种碱基所有序列组合的四聚体(256种)，其基本构成可以见下图。 基因芯片原位合成原理示意图 图2 原位合成原理图分子诊断学（第2版）

11、 47B、合成点样 由具有多个微细加样孔的阵列复制器或阵列器及由电脑控制的机器人来完成。机器人准确、快速地将不同探针样品定量(0.251.0l)点样于预处理好的基板相应位置上，在基板上产生直径为100150m斑点，再由紫外线交联固定后即得到DNA微阵列或芯片。 48样品的制备及标记样品的制备：提取、纯化，也可对样品进行适当程度的扩增，以提高阅读灵敏度。 待测样品的标记：大多采用Cy3、Cy5进行单色或双色荧光标记，对于阵列密度较小的基因芯片可以用同位素（如33P）标记。49样品与基因芯片的杂交 cDNA基因芯片与靶基因的杂交过程与常规的分子杂交过程基本相同，相当于一种反相斑点杂交。用于检测基因

12、表达，需要在低温、高盐浓度下进行较长时间的反应 。用于突变检测，需要在高温、低盐浓度下进行较短时间的反应 。 50杂交结果的检测及分析 检测方法很多，如荧光显影法、质谱法、化学发光和光导纤维等，使用最广泛的是荧光显影法。 荧光检测器主要有激光共聚焦显微扫描系统和高性能的电荷偶联照相机(CCD) 。51芯片激光光源电子束分裂器聚焦小孔检测器滤光镜聚光镜物镜图5 荧光显影法5253基因芯片的数据分析基因芯片的数据分析，就是把原始数据按一定标准精简、归类，然后从归类数据中寻找有实际生物学意义的过程。合理选择数据分析方法，是充分发挥基因芯片功能的必要条件。54芯片数据分析的步骤 标准化，也称归一化，用

13、来消除不同芯片、不同标记物之间的差异；数据精简，在大量的芯片数据中去掉那些不能提供一个显要意义的信息数据；统计学分析，利用聚类法或分类法等对所得到的芯片数据进行分析归类，对分类结果进行进一步的统计学检验，以保证其准确性；生物学意义分析，在统计学分析结果的基础上，对其所代表的生物学意义进行研究，以得到相应的结论。55基因芯片的应用 定量分析（主要指测序和突变检测）定性分析（主要指对基因表达的研究） 基因芯片的应用根据应用领域的不同可将基因芯片分为表达谱芯片、测序芯片和诊断芯片三大类。表达谱基因芯片：基因的功能分析、疾病发生机理探讨、发育模式调控机理探讨、药物研究和筛选等众多方面；测序芯片：主要用

14、于测定DNA序列；诊断芯片：检测基因变异和诊断疾病。57图6 基因芯片的用途分析基因的表达与功能例1：拟南芥Schena等采用拟南芥基因组内共45个基因的cDNA微阵列（其中14个为完全序列，31个为EST）。检测该植物的根、叶组织内这些基因的表达水平，用不同颜色的荧光素标记逆转录产物后分别与该微阵列杂交。根和叶组织中存在26个基因的表达差异，而参与叶绿素合成的CAB1基因在叶组织较根组织表达高500倍。检测基因变异与诊断疾病 正常人的基因组中分离出DNA与DNA芯片杂交就可以得出标准图谱。从病人的基因组中分离出DNA与DNA芯片杂交就可以得出病变图谱。通过比较、分析这两种图谱，就可以得出病变

15、的DNA信息 。Affymetrix公司，把P53基因全长序列和已知突变的探针集成在芯片上，制成P53基因芯片，将在癌症早期诊断中发挥作用Heller等构建了96个基因的cDNA微阵，用于检测分析风湿性关节炎（RA）相关的基因现在，肝炎病毒检测诊断芯片、结核杆菌耐药性检测芯片、多种恶性肿瘤相关病毒基因芯片等一系列诊断芯片逐步开始进入市场。 筛选药物 即可以利用基因芯片分析用药前后机体的不同组织、器官基因表达的差异 。基因芯片的优点和缺点优点：大规模、高通量、高效率、并行性、自动化。缺点：无法同时大量地分析组织或细胞内基因组表达的状况，而且由于芯片技术需要准备基因探针，所以可能漏掉那些未知的、表

16、达丰度不高的、可能是很重要的调节基因。2、基因表达序列分析技术 Serial analysis of gene expression (SAGE）是指以测序为基础，分析特定组织或细胞类型中基因群体表达状态的技术。表达的基因和表达的丰度SAGE技术的主要理论依据 一个短的寡核苷酸序列含有鉴定一个转录物特异性的足够信息，可以作为区别转录物的标签。这些标签串联在一起，形成大量的多联体，对每个多联体进行测序并应用SAGE软件分析，可确定表达的基因的种类和丰度。用生物素酰化的oligo（dT）引导合成cDNA第一链，再合成双链cDNA，用专门识别4bp碱基的锚定酶，如NlaIII(识别位点为CATG)消

17、化合成的双链cDNA,释放5序列，而生物素酰化的3端仍被吸附在链霉亲和素蛋白磁珠上。分离与磁珠结合的具3端poly（A）尾巴的cDNA片断，与含有IIS类限制酶位点的接头连接，酶切位点一般位于识别位点后20bp处，再用标签酶，如BsmFI等IIS类限制酶处理样品，释放带有接头的SAGE标签。带有接头的SAGE标签经DNA聚合酶补平后，由连接酶产生带有两个接头的双标签，对双标签PCR扩增后，再用锚定酶消化,得到尾尾相连的SAGE双标签，双标签的两端分布着锚定酶的酶切位点。去除接头的SAGE双标签彼此连接形成长短不一的多联体，克隆到高拷贝的质粒载体，由此形成SAGE库。随机挑选SAGE库中的克隆测

18、序，用专门设计的SAGE软件分析得到的标签序列，通过与GenBank、dbEST或SAGEmap等数据库进行比较，获取所需的资料。2022/7/2466SAGE的应用确定不同组织或细胞的表达谱，并能确定基因的表达丰度1995年Velculescu等首次从人类胰腺中得到了1000个标签，其中351个（41.6）只出现一次，77个标签出现多次，10个丰度最高的标签中有9个至少与GenBank序列匹配一致。这个结果与cDNA文库结果一致。鉴定新的基因利用13bp寡核苷酸（9bp标签加上4bp锚定酶位点）做为探针，筛选胰腺cDNA文库分离了4个未确定标签所对应的克隆，结果有3个标签对应的克隆代表了两个

19、已知的基因，其中一个可能代表新的基因。3、大规模平行信号测序(massively parallel signature sequencing, MPSS)2002年诺贝尔生理学或医学奖获得者Sydney Brenner发明 是微阵列的替代方法：可以在一个样本中计数所有的mRNA是设计用来捕获完整的转录组 对低丰度转录子高度敏感一般可以分析100万个转录子数字资料容易构建大的相关数据库可以被应用于任何生物大规模平行测序技术( massively parallel signature sequencing , MPSS) 是Brenner 等于2000 年建立, 由美国Lynex 公司将其商品化的

20、一种基因克隆新技术。是基于序列分析技术的高通量、高特异性和高敏感性的基因分析技术。MASS 与 Microarray比较MPSS确实能在一个样品中检测到所有的mRNAs ， microarrays对检测的基因成分有限制（因为需要已知基因的序列做探针）。 MPSS 即使是一般的检测都对低丰度基因具有很高的敏感性，而microarray的敏感性受许多因素的影响而且很难进行严格的控制 。MPSS的结果是以数字资料的形式输出，使得这些结果很容易整合进复杂的相关数据库，而 microarray的输出的数据时根据荧光的强度算出的比率很难准确反应表达水平。MPSS可以用于基因表达的定量分析，可以用于任何生物

21、，即使对那些基因组未被测序或进行过详细研究的生物。MPSS和SAGE比较SAGE 的特征序列是14个核苷酸，而MPSS是17个基因组作图时会少了歧义很容易把MPSS的标签与已知的基因对应起来典型的SAGE的数据集是20,000-60,000个标签，而MPSS有约百万个特征序列 MSPP很容易实现高通量，因为其克隆和测序用的是不同的技术SAGE是利用传统的克隆和测序技术，昂贵、耗时、劳动强度大 更大的MPSS数据集可以增强分析的深度MPSS是对SAGE的改进，它能在短时间内检测细胞或组织内全部基因的表达情况，是功能基因组研究的有效工具。因其需要配套的软硬件较为昂贵，目前国内外的相关应用报道不多。

22、MPSS技术对于致病基因的识别、揭示基因在疾病中的作用、分析药物的药效等都非常有价值，该技术的发展将在基因组功能方面及其相关领域研究中发挥巨大的作用。 MPSS的特点不必事先知道基因的序列, 适用于任何生物体及任何性状;基因组覆盖面高, 能测量出样品中几乎所有表达了的基因;基因表达水平的测量是通过直接计算样品中cDNA 的拷贝数目, 属于非连续变量, 所以只要有病理和正常个体(或组织) 两个样品即可以进行严格的统计检验, 能有效地检测差异性中等或较小的基因; 实验效率高, 只要两个星期即可获得几十万个克隆的16 至20 个碱基序列。4、高通量测序技术-深度测序-deep sequencing

23、高通量测序技术是对传统测序一次革命性的改变，一次对几十万到几百万条DNA分子进行序列测定，使得对一个物种的转录组和基因组进行细致全貌的分析成为可能，所以又被称为深度测序(deep sequencing)。 Roche（罗氏公司）推出了454FLX焦磷酸测序平台（454FLXpyrosequencingplatform）2006年美国Illumina公司推出的Solexa基因组分析平台（GenomeAnalyzer platform）2007年ABI公司推出了SOLiD 测序仪。 这三个测序平台即为目前高通量测序平台的代表。 深度测序技术的原理建立文库产生DNA簇测序图1. 454测序技术流程图

24、2. Solexa测序技术流程图3. SOLiD测序技术流程高通量测序的应用 可以帮助研究者跨过文库构建这一实验步骤，可以非常轻松完成基因组重测序(re-sequence)。但是也应该看到，由于高通量测序读取长度的限制，使其在对未知基因组进行从头测序(novo sequencing)的应用受到限制，这部分工作仍然需要传统测序(读取长度达到850 碱基)的协助。但是这并不影响高通量测序技术在全基因组mRNA表达谱，microRNA表达谱，ChIP-chip以及DNA甲基化等方面的应用。 2008年Mortazavi等人对小鼠的大脑、肝脏和骨骼肌进行了RNA 深度测序，这项工作展示了深度测序在转录

25、组研究上的两大进展，表达计数和序列分析。高通量测序另一个被广泛应用的领域是小分子RNA或非编码RNA(ncRNA)研究。测序方法能轻易的解决芯片技术在检测小分子时遇到的技术难题(短序列，高度同源)，而且小分子RNA的短序列正好配合了高通量测序的长度，使得数据“不浪费”，同时测序方法还能在实验中发现新的小分子RNA。在DNA蛋白质相互作用的研究上，染色质免疫沉淀深度测序(ChIP-seq)实验也展示了其非常大的潜力。染色质免疫沉淀以后的DNA 直接进行测序，对比ref seq可以直接获得蛋白与DNA结合的位点信息，相比ChIP-chip，ChIP-seq可以检测更小的结合区段、未知的结合位点、结合位点内的突变情况和蛋白亲合力较低的区段。 高通量测序的应用 （三）转录组学的意义蛋白质是行使细胞功能的主要承担者，蛋白质组是细胞功能和状态的最直接描述，而由于目前蛋白质实验技术的限制，转录组成为研究基因表达的主要手段。转录组是连接基因组遗传信息与生物功能的蛋白质组的必然纽带，转录水平的调控是目前研究最多的，也是生物体最重要的调控方式。第二节 转录组学在药学中的应用一、药靶候选基因的鉴定药物靶标是指体内具有