2022时差成像技术在临床应用中的进展（全文）

1、2022时差成像技术在临床应用中的进展(全文)摘要随着对体外胚胎形态学参数、时差动力学参数的认知，时差成像技术 (time-lapse technology , TLT )已经进入了一个快速发展的阶段。TLT 能实时连续记录胚胎从受精、卵裂、囊胚形成的各项细节图像并发现传统 观察胚胎技术不能发现的细节，为胚胎筛选提供依据。此外，TLT还能在 临床应用、实验室质量控制中发挥作用。与此同时，TLT在体外胚胎发育 分析、人工智能开发中也存在问题，本文将对其进行探讨。时差成像技术(time-1叩se technology , TLT )融合了胚胎体外培养及 计算机控制的实时观察系统。TLT培养体系可降

2、低离箱操作所引起的胚胎 应激基因的表达；而TLT系统长波光的照射强度远低于传统培养等。1997年至2010年间，TLT仅作为记录胚胎发育基础数据的培养系统， 2011年后随着体外胚胎形态学参数、时差动力学参数逐渐被认知，TLT 进入了一个快速发展的阶段。与传统体外受精(in vitro fertilization ,IVF ) 技术比较，TLT能实时连续记录胚胎从受精、卵裂、囊胚形成的各项细节 图像并发现传统观察胚胎技术不能发现的细节，为胚胎筛选提供依据。此 外，TLT可为胚胎发育过程、胚胎碎片产生及非整倍体产生等重要问题的 机制研究提供依据1-2 近年来,随着对TLT的持续研究,更多关于 员

3、的培训及管理提出了全新的标准，对信息处理及图像分析提出了全新的 挑战，也改变了日常的实验室操作流程，对管理层、医师及胚胎学家提出 了全新的挑战，也给出了更多的可能性。TLT在胚胎评估中的研究和报道相继出现3-6 1-TLT的应用现状及临床意义TLT实时记录胚胎发育的时间点，包括极体排出、原核形成/消失、第一次 卵裂、后续各期卵裂、桑根胚的细胞融合、囊胚腔形成、囊胚扩张及孵出 等。TLT通过详实的记录，扩展了传统形态学评估的认知：异常卵裂(1-3 分裂)7 、卵裂球不规则分裂8 1囊胚致密化9 等现象的认识离不 开TLT的实时记录，TLT还可用于分析细胞质中无规则的原核运动3 1 原核同步性3

4、1雌原核的异常运动8 1卵裂沟的位置10 等细节现 象。Coticchio等11 提出的时差动力学参数对于TLT系统和IVF都具有重 要的意义，时差动力学参数成为预测临床结局的有力工具。囊胚形成预 测参数：原核的形成与消失12 1第一次卵裂持续时间13 1第一与第 二次有丝分裂的间隔、第二与第三次卵裂间隔。胚胎着床预测参数：第 二极体排出时间(the time of the second polar body emission , tPB2 原核消失的时间(time to pronuclear fading , tPNf 二分裂时间(time of cleavage to a two-cell

5、 embryo , t2 )、四分裂时间(time of cleavage to a four-cell embryo , t4 )、囊胚孵出时间(time to hatching blastocyst, tHN )等14-17 1在几项前期的研究报告中显示，校正超促排卵方案、患者年龄、胚胎移植类型和获卵数等基线后，研究显示2-细胞期卵裂球不均的囊胚以及4-细 胞多核胚胎会阻碍着床18-19在一项回顾性队列研究中，出现2-3分裂的胚胎着床率低于正常卵裂的胚胎(1.2%比20.2% , P0.05 ) 7 L 一项对243位患者的299个胚胎进行不同时长囊胚培养的时差动力学分 析显示：受精后25

6、.9 h内第一次分裂形成2-细胞,37.9 h内第二次分裂 形成4-细胞的胚胎及79.9 h内达到囊胚期的胚胎与未在此时间内完成分 裂的胚胎相比妊娠率较高(74.6%比40.9% , P0.01 )201 Azzarello 等21 比较了活产与未着床胚胎的原核形态和动力学变化，显示活产组 原核消失时间更长(24.90.6 ) h 比(23.30.4 ) h , P=0.022 1此 外,原核消失发生在20.8 h前与活产相关。Amir等22 报道，与平衡 易位染色体的胚胎相比，非平衡易位胚胎时间动力学参数异常，自受精至 4-细胞期及囊胚形成时间延长(38.24.5) h比(39.54.8)

7、h ;( 100.1 7.3 ) h比(103.79.3 ) h，均P0.05 )。此夕卜，非平衡易位胚胎在 原核消退时表现出显著延迟(24.13.3 ) h比(23.43.6 ) hF=0.011 1 近年来 多项研究报道了不规则分裂，囊胚开始时间(start of blastulation , tSB 1 囊胚扩张时间(time to expanded blastocyst, tEB )、间隔时间(tEB-tSB )以及整倍体和非整倍体状态与着床率之间相关性23-24 , 利用TLT,存在非侵入性选择染色体正常胚胎的可能性。另有纳入5个随机对照试验randomized controlled

8、 trial ,RCT洪1637 名研究对象的meta分析表明,与传统培养和评估相比，TLT能够提高妊 娠率(51.0%比 39.9% 0.001 )、活产率(44.2%比 31.3% ?=0.009 ), 降低流产率(15.3%比21.3% , P=0.019 )251但最近一项包含9个 RCT共2955名研究对象的分析显示，TLT培养与传统培养胚胎结局在活 产率、流产率或临床妊娠率上的差异是否具有统计学意义尚无定论26 1 同样，其他meta分析也无法证实TLT对胚胎结局的影响10,27-28 L 由于研究证据的质量差异，TLT培养和评估体系在活产率、持续妊娠率、 流产和死产率或临床妊娠率

9、方面与传统培养是否存在差异还有待继续研 究。-TLT在实验室质量控制中的应用以传统的实验室质量控制指标(key performance index , KPI)进行日 常管理(包括培养箱数量/类型、培养液组成、氧浓度、培养皿、人员操作 等)易导致信息延滞的困扰，如以临床妊娠或胚胎着床考察人员或培养体 系需追溯28 d左右，对临床工作及患者造成质量控制的滞后性。之前的 实验表明，在培养液中加入过氧化异丙苯，胚胎呈现出与正常培养基不同 的时差动力学参数29 1并且在不同培养液、不同空气质量的培养环境 中30 ,时差动力学参数比形态学、囊胚形成率在不同培养液中反应更 敏感。这些研究表明，不同的培养体

10、系可能造成时差动力学参数的不同。 将时差动力学参数引入质控，在胚胎培养23 d就可以判断操作培养体系 存在的问题。时差动力学参数可以精细量化时间，其敏感性优于囊胚形成 率且可以缩短质控周期，基于上述原理，TLT及时差动力学参数可能优化 传统的实验室质控流程。= TLT应用中需要注意的问题.安全性：胚胎暴露于一定强度、某些波长的光源中可能影响胚胎发育。 有证据表明，光照对胚胎发育有负面影响，蓝光(400-500 nm )相比红 光、橙光等更可能导致氧化应激31 ;损伤作用不仅与光谱组成相关， 与光照的强度和曝光时间亦呈相关性。TLT标量辐照度、光暴露低于传统 形态学评估，在将胚胎培养至57 d的

11、TLT系统观察期，TLT曝光时间总 量明显低于传统形态学评估18 1与常规胚胎培养相比，TLT可保持关 键环境参数的稳定性(如温度、二氧化碳浓度、氧含量等)32 ,减少将 胚胎取出培养箱导致培养环境变化对胚胎的影响。多项研究报告称，TLT 为胚胎的观察、研究和临床应用提供了目前认为安全的环境，与传统标准 培养箱相比，在TLT体系中进行胚胎培养有助于胚胎发育及胚胎评估，但 仍缺乏相关的RCT作为依据33-34 L.与患者的交互性：借助于TLT的记录系统，实验室工作人员可为患者提 供胚胎发育的图像，而不再是枯燥的数字及符号。但考虑到专业与复杂性, 与患者沟通胚胎形态动力学相关专业信息时，患者可能无

12、法理解其含义, 医生需要耐心向患者进行解释。需要说明的是：TLT并不能精准识别胚胎 着床发育潜能，仅能根据已有的TLT分析数据对胚胎移植顺序进行分类； TLT能否改善临床结局目前仍然缺乏足够的证据35-37 I.信息化大数据与人工智能(artificial intelligence , AI):近年来，随着 学习算法的进步，电子医疗数据的增加和计算处理能力的提高，AI以一种 用于多参数分析的无偏倚方法参与到数据分析中。在使用TLT的前提下, 尝试使用更强大的计算机处理能力分析大量的图像数据集，以确定可能与 胚胎发育能力相关的参数。AI不只是依赖于胚胎学家的训练来分析胚胎特 征，而是对胚胎的整个

13、图像进行评估，允许对所有可用数据进行量化，从 而识别胚胎学家人眼无法识别的形态学特征。先前的研究运用形态动力学分析方法36 , 38 ,基于研究胚胎发育中已知事件（如早期卵裂等）对这些已知事件进行评分。目前，通过利用经典机器学习方法，如支持向量机（support vector machines , SVM ）和 随机森林以及深度学习方法，如卷积神经网络（convolutional neuralnetworks , CNN ） 39-40 来进行结果预测或等级分类，基于从数据中 的层次学习，通过多层的相互连接的神经元处理信息41 L AI可以直接分析整个原始延时视频，利用从TLT采集的每个数据点

14、来进行胚胎评估。到目前为止，已有几种AI方法被用于评估囊胚。图像分割和先进的图像 分析技术，使用具有纹理描述符的神经网络、水平集、相位一致性和拟合 椭圆方法已经在小鼠42 牛39 和人43 的囊胚中被证实。有研 究利用CNN的深度学习算法与胚胎学家分别对97例患者的胚胎进行双 盲评估，研究显示CNN的深度学习算法选择高质量胚胎的准确率高于胚 胎学家（单胚胎移植周期：63.9%比52.8% , P0.05 ;双胚胎移植周期: 79.4%比72.4% , P0.05 ）,利用AI在鉴定具有高发育潜力的胚胎方面超 过胚胎学家的能力44 L在胚胎存活率评估中,Rocha等45 报道, AI能在选择第5

15、日具有高植入潜力的胚胎以及在预测胚泡发育方面表现 出高度的准确性。Segal等46 利用随机森林，利用2744个胚胎进行 形态学评估来预测胚胎发育情况，准确率达76.4% ,敏感度为55.0% ,特 异度为87.8%0此外Iwata等47 利用基于CNN的深度学习方法结合 TLT,对118个人类胚胎进行监测，以确定质量良好的胚胎。通过验证不 同的细胞阶段预测胚胎质量，数据集精确度达到70%90%。此外，AI 对体外胚胎发育时的形态动力学数据分析预测了捐卵周期的活产情况，准 确率超过90.0% ,预测被选择胚胎自然流产的准确率达77.0% 48L研 究证实整倍体胚胎和非整倍体胚胎有不同的动力学行

16、为49 logistic 回归分析在校正超促排卵方案、患者年龄、不孕年限、激素水平(抗苗勒 管激素、卵泡刺激素、雌二醇)、胚胎移植类型和获卵数等基线后，分析 胚胎出现2-细胞到5-细胞(t5-t2 3-细胞到5-细胞(cc3 )分裂情况时， 与胚胎非整倍体的相关性。以是否为整倍体胚胎为自变量，胚胎出现2- 细胞到 5-细胞(OR=2.85 , 95% CI=1.764.62 )、3-细胞到 5-细胞 (OR=2.10,95% Q=1.363.24 )分裂情况时，预示着胚胎为非整倍体 的可能性增大。利用TLT发现这些差异，结合AI可提高非侵入性选择正 常胚胎的概率。但AI预测染色体整倍性也受置于

17、胚胎植入前非整倍性检测(preimplantation genetic testing for aneuploidy , PGT-A )的诊断精度。嵌合体是PGT检测里的一项热点问题,活检位置决定着能否获取 真实的结果如活检位置可能在:正常滋养外胚层细胞(tropheetoderm ,TE 异常TE及复合TE细胞的位置,而现在的AI研究对标的结果就是PGT-A的诊断结果，因此AI研究面临着遭遇与PGT-A假阴性结果的可能性。目前所做的AI还处于早期胚胎的研究，而胚胎在桑意胚及囊胚期存 在修复机制，是否会修复早期的非整倍体胚胎也需要相关的研究证实。未来的AI和TLT必将结合机器学习以促进对大型数

18、据集的复杂分析,进 而显示目前尚未识别的视觉标记组合。AI与TLT结合需借助于海量人工标 注、分辨胚胎构成如胚胎不同发育阶段及相应的细节现象，对技术人员专 业度及工作效率也是严峻考验。现有部分研究已对AI及TLT联合运用有 初步成果，如利用通过卷积网络运算，识别原核数、原核位置、原核大小、 卵裂模式等7 0部分结果已经显示出人工智能评分等与胚胎质量的相关 性50 1但胚胎学家们尚无法根据图像信息判断胚胎是否异常，同样AI也存在无 法精确识别胚胎质量的问题。且由于AI系统的暗箱算法无法鉴别参数意 义，因此标记可能出现误判或出现假阳性结果，临床AI应用仍需要进行 大量验证，以评估AI利用效能。.人员配置与硬件优化:目前TLT图像分析由胚胎实验室人员一对一完成, 借助动力学参数评价胚胎发育存在耗时长、主观性强等问题，应建立一个 新的技术岗位，经过专业培训后负责TLT信息采集工作。现阶段已知TLT 能够提供时差动力学参数及记录胚胎发育细节，但仍缺少一个标准系统和 软件综合分析TLT记录的各项时差动力学参数，无法自动告知胚胎学家体 外培养胚胎的情况以选择可