李丽娜开题完稿

1、应用全基因组改组(giz)技术选育肠道益生菌的研究 学生(xu sheng)姓名：马颖辉 指导教师：曹龙奎 教授 共十七页 目 录1. 研究(ynji)的目的和意义2. 国内外研究动态(dngti)和趋势 3. 试验研究的主要内容和方法 4. 试验研究实施方案和进度 食品学院2009级研究生开题报告5. 试验研究预期效果共十七页1.枯草芽孢杆菌(gnjn)研究意义食品学院2009级研究生开题(ki t)报告2.全基因组改组研究的意义 一.研究的目的和意义生长快、营养简单，能产生耐热抗逆的芽抱，这也有利于生防菌剂的生产、剂型加工及在环境中的存活、定殖与繁殖，而且批量生产工艺简单，成本也较低，施用

2、方便，储存期长，是一种理想的生防微生物。 全基因组改组是近年来兴起的微生物遗传育种和菌种改良的一项新技术。该项技术通过微生物多个正突变体递进融合进行基因组随机重组，快速筛选所需表型有重大改进的菌株。共十七页二.国内外研究(ynji)动态和趋势1.国内研究(ynji)概况 2.国外研究概况2007年胡雪萍等在比较纳豆芽孢杆菌营养体和芽孢之间的生物学特性时发现,芽孢对温度、酸碱度、盐和模拟胃肠道环境等不利环境的耐受性均明显强于营养体,可在模拟胃肠道环境中生长萌发。日本学者用NTG诱变处理链霉菌U121的孢子,获得突变菌株的基因组库,然后通过三轮的基因组改组,获得的菌株产HCA能力比原始出发菌株产量

3、高5倍以上,三角瓶培养显示细胞生长速度也获得了大幅提高。食品学院2009级研究生开题报告共十七页三试验(shyn)研究的主要内容和方法主要内容食品(shpn)学院2009级研究生开题报告1、枯草芽孢杆菌生长条件的确定。2、菌株产酶活性的测定。3、菌株紫外线诱变，选育高产酶菌株。4、菌株全基因组改组技术的研究。共十七页三试验研究的主要内容(nirng)和方法食品学院2009级研究生开题(ki t)报告 3.1 枯草芽孢杆菌生长条件的研究 种子液制备250mL锥形瓶分装50mL基础LB种子培养基接种后，在37，160rpm的条件下震荡培养12h。以灭菌的基础种子培养基作为空白对照，测定菌液的OD6

4、00，作为培养条件优化的种子液 。 菌种生长培养液配制及测定将种龄为12h的种子培养液按5%接种于装有6mL基础种子培养基的试管中。已接种的试管分别在各单因素条件下振荡培养，每隔两小时取样，测定OD600，达到菌种的最大生长量为止。以时间为横坐标，以OD600为纵坐标，绘制菌种生长曲线，使菌种在短时间内达到较大生长量者为最适生长条件。共十七页Title吸水率温度(wnd)pH摇床转速(zhun s)接种量装液量种龄实验方法食品学院2009级研究生开题报告共十七页食品学院(xuyun)2009级研究生开题报告实验(shyn)方法3.2 菌种产酶活性测定 3.2.1 蛋白酶活性测定 3.2.2 淀

5、粉酶活性测定 3.2.3 纤维素酶活性测定3.2.4 脂肪酶活性测定共十七页食品学院(xuyun)2009级研究生开题报告实验(shyn)方法3.3紫外线诱变出发菌株斜面 洗下孢子 过滤除菌丝 制成孢子悬浮液 紫外线诱变 转无菌管02h 后培养 稀释涂平板 暗培养24h 初筛复筛 高产酶菌株 生化鉴定 遗传稳定性 共十七页食品(shpn)学院2009级研究生开题报告实验(shyn)方法3.3紫外线诱变1.紫外灯照射时间对诱变的影响 时间(s)2030405060708090100110对照菌落个数2.筛选步骤 UV第一轮：一株出发菌株 选出200株单菌落初筛 选出60株复筛选出五株 UV第二轮

6、：五株出发菌株 540株初筛 选出60株复筛选出五株第三、四轮同第一轮直至选出较优菌株共十七页食品学院2009级研究生开题(ki t)报告实验(shyn)方法3.4 全基因组改组技术出发菌株斜面 洗下孢子 过滤处菌丝 制成孢子悬浮液 预处理 酶解 稀释涂平板 初筛 复筛 高产酶菌株 生化鉴定 遗传稳定性3.4.1原生质体制备共十七页24262830323436生成率再生率1%2%3%4%5%6%7%生成率再生率6h6.5h7h7.5h8h8.5h9h生成率再生率食品学院(xuyun)2009级研究生开题报告3.4.1 原生质体制(tzh)备实验方法1.酶解温度对原生质体制备的影响 2.酶浓度对

7、原生质体制备的影响 3.酶解时间对原生质体制备的影响 4.正交实验确定原生质体制备的最佳条件 （A）温度（B）时间h（C）浓度%实验1实验2实验3实验4实验5实验6实验7实验8实验9111222333123231312123312231共十七页食品(shpn)学院2009级研究生开题报告实验(shyn)方法3.4.2 原生质体融合 取两亲株原生质体悬浮液各lml混合，3500r/min离心15分钟。弃去上清液，缓慢加入预热1.8ml 10%PEG6000溶液和0.2ml的新生磷酸钙溶液，融合30min，混合均匀.立即加入SMM终止反应，3500r/min离心10min去除融合液，SMM高渗缓冲

8、液离心洗涤两次后，重悬于SMM液中，用SMM高渗透压缓冲液稀释10倍后，取0.1ml用夹层法培养于再生基本培养块平板上，培养7天观察记数取单亲株及混合后不加PEG的原生质体分别作对照试验。 共十七页3.3.4.1融合子的检出 将PEG处理(chl)好的原生质体作适当稀释，先涂布在再生平板上，使亲株及重组子都生长出菌落，然后用影印法复制到含抗性的培养基上，此后长出的菌落即为融合株。3.3.4.2融合子的鉴定 稳定性鉴定 菌落特征比较 融合子与亲本菌株的拮抗试验 酶活性的测定实验(shyn)方法3.3.4 融合子的检出及鉴定实验方法共十七页四.试验(shyn)研究实施方案和进度1.本课题的特点及创

9、新点2.研究计划及预期(yq)进展食品学院2009级研究生开题报告五.试验研究预期效果1.枯草芽孢杆菌培养条件的确定 2.确定酶活性测定方法 2010年4月2010年9月 相关的资料查找与准备工作。2010年10月2010年12月 菌株诱变，选育高产酶枯草押宝菌株。2011年1月2011年7月 全基因组改组技术的研究。2011年8月2012年3月 对实验数据进行总结，拟写毕业论文。1）从全基因整合构建多益生功能菌株，将具有多种益生性状整合到一个菌株，为开发性能稳定的益生菌产品提供优良菌株，将填补这一方面的空白；可保证在自然条件下产品的活菌数至少较市场上的同类产品提高10-100倍。2）确定不良条件下（冷冻、干燥脱水）对菌体致死、损伤、修复和保护机理共十七页 敬请各位老师同学 提出(t ch)宝贵意见 谢谢！共十七页内容摘要应用全基因组改组技术选育肠道益生菌的研究。目 录。1. 研究的目的和意义。3. 试验研究的主要内容和方法。4. 试验研究实施方案和进度。5. 试验研究预期效果。全基因组改组是近年来兴起的微生物遗传育种和菌种改良的一项新技术。3、菌株紫外线诱变，选育高产酶菌株。250mL锥形瓶分装