临床基因扩增检验培训班PCR污染与预防课件

1、临床基因扩增检验培训班PCR污染与预防临床基因扩增检查验收中存在的问题5份标本(2份标本小于最低检测限)检测结果:(1) 与预期靶值完全符合(2) 阴性对照出现阳性， 小于最低检测限的标本为阳性(3) 阳性标本高于预期值2个数量级.(4)所有阳性标本均低于预期靶值1个及以上数量级.聚合酶链式反应成功的关键因素保证标本质量与模板质量PCR反应体系与反应条件的优化PCR相关仪器的校准灵敏度、特异性批内与批间检测的可重复性预防污染的发生(假阳性)Stephen AB et al.Real-time reverse transcription PCR (qRT-PCR)and its potentia

2、l use in clinical diagnosis. Clinical Science (2005) 109, 365379标本质量与模板质量Real time PCR，2006 认真分析标准曲线观察PCR反应体系与反应条件是否正确1.相关系数（r2）：越接近1越好2.斜率（slope）：-3.13.6（100%的扩增效率）3.截距（intercept）：33.336.5（100%的扩增效率） Ct=A+BlgCCt3733123斜率=-3.5斜率=-2.0标准曲线的要求扩增效率：通常要求达到90%100%，如小于90%，必须重新优化。对应的斜率10（-1/斜率）-1为-3.1-3.6。截

3、距（灵敏度）：33.336.5（100%效率）相关系数：检测标准品稀释的准确性与加样的准确性（0.99）Real time PCR，2006斜率增加：（1）标准品为非线性的质粒。（2）反应体系与反应条件未优化好。（3）存在Taq酶的抑制剂或Taq酶的活性下降。（4）加样不准确斜率降低：污染或加样不准确。截距增加：（1）标准品的浓度不正确。（2）标准品降解（反复冻融或未加载体DNA的低浓度标准品）截距降低：（1）标准品的浓度不正确。（2）污染。PCR相关仪器的校准批内与批间检测的可重复性TBDNA（+）污染Why？方法本身？实验人员？实验场地？实验试剂？聚合酶链式反应与诺贝尔化学奖美国科学家Ka

4、ry B.Mullis Kary B.Mullis与 聚合酶链式反应“我感激诺贝尔评奖委员会，在我还能够尽情享受生活的年龄及时地把诺贝尔奖授予给我”PCR的污染源交叉污染。来自试验材料 。“遗留”(carryover)污染。PCR去污染（decontamination）的措施停止试验，寻找污染源。抛弃所有可疑的试剂。工作区间彻底的清洁消毒。更换实验设备。改用另一对引物，扩增靶DNA的不同区域。PCR的基本步骤与污染的发生Reagent preparationSpecimen preparationAmplificationDetectionResults Calculation预防污染的措施建

5、立标准的PCR实验室，将PCR的不同过程在不同的区间进行。为污染控制策略的核心部分。酶法防止PCR产物的遗留污染。表面紫外线照射减少PCR的污染。用化学加合物如异补骨脂素将单链或双链DNA衍生化，这些加合物可防止污染的DNA作为反应的底物。标准实验室的组成及其功能（1）前PCR区（Pre-PCR laboratory）：又称试剂贮存与准备区，用于试剂的制备、分装、贮存以及配制PCR反应的“主混合物” 反 应 混 合 物 的 成 分Mg2+Mn2+dCTPdGTPdUTPdATPTaq DNA 多 聚 酶rTth DNA 多 聚 酶AmpErase 生 物 素 标 记 的 引 物 和 或 和主混

6、合物标准实验室的组成及其功能（2）标本处理区（Sample processing laboratory）：标本的保存，目的核酸的提取、贮存，目的核酸的添加以及cDNA的合成。Mn2+AmpEraserTth DNAPolymeraseBiotinylatedPrimersTarget RNA or DNAReverseTranscriptiondCTPdTTPdGTPdUTPdATPBiotinylatedAmpliconBiotinylatedAmplicon标准实验室的组成及其功能PCR扩增区（PCR amplification laboratory）：DNA或cDNA的扩增。PCR产物分

7、析区（PCR product analysis laboratory）：又称后PCR区，PCR产物的检测与分析。Step 2. Denaturation and HybridisationDenaturationBSABSAAMPLICONAMPLICONDenatured StrandsBiotin HybridisationCapture Probe linked to BSAStep 3. Binding of a Av-HRP Conjugate and Addition of Substrate(Incubate at 37 C)Capture ProbeMagnetic Micro

8、particlesAvidin-horseradish Peroxidase ConjugateBiotinAmpliconTetramethylbenzidine(TMB) SubstrateMMPMMPTMBHydrogenPeroxideoStep 4. Stop Solution Addition and Absorbance MeasurementAdd Stop Solution and Measure AbsorbanceCaptureProbeMicrowell PlateAddition of SubstrateTetramethylbenzidine(TMB) Substr

9、ateBiotinBSAAMPLICONBSAAMPLICONHydrogenPeroxideAvidin-horseradish peroxidase (Av-HRP conjugate)标准实验室的基本规章制度所有进入实验室的人都要遵守该制度。明确试验目的是否与实验室功能一致。明确试验中的不确定因素。物流和人流单向流动的原则。从“干净”的实验室到“脏”的实验室工作服(1)在实验室指定区域内更换指定的工作服。(2)实验室中应频繁更换手套。(3)一次性实验室用品(包括一次性手套与鞋套)应丢弃到生物危险废料容器中。(4)工作衣不能穿出指定的实验室外。实验室卫生实验室设备必要时应用10%漂白剂清洗

10、。所有实验室废物均应按照生活垃圾、医用垃圾、尖锐状废料以及破碎的玻璃器皿进行分类，尤其是感染性废料必须高压消毒后方能丢弃。防护罩/超净工作台工作前，工作台表面应用75%酒精擦拭台面，紫外灯消毒，工作后，把物品移出，用75%酒精擦拭台面，并打开紫外灯消毒。几点建议(1)所有试剂与样品准备过程中应使用一次性灭菌的管子与瓶子(2)每次实验应设阴性对照.(3)将标准品与阳性对照直接储存在标本处理区，标准品的稀释(管子离心后5min打开,以避免气溶胶的产生。不能剧烈振荡标准品与阳性对照)(4)正确使用微量加样器(5)定期用10%的次氯酸钠清洁微量加样器与工作台面(6)换气设备应正常工作.三、酶法防止PC

11、R产物的遗留污染限制性核酸内切酶法。修饰引物，使扩增产物被某种酶切割。UNG消解法UNG消解法原理1）在PCR反应体系中加入UNG，并用dUTP替代dTTP，扩增产物含有dUTP 。2）UNG可以去除遗留污染DNA中的dU， DNA聚合酶会在这些位点处停滞。3）无dU的位点是热不稳定的，在热循环中会发生断裂。以dUTP替代dTTP的PCR扩增产物，“ ”表示dUTP再次扩增，扩增体系加入UNG，37度10分，可消去dU。95度10分钟，DNA在无dU的区域断裂，因此遗留的DNA不能被扩增UNG消解法的缺点短于100bp的PCR产物不能用UNG完全消除污染，四、表面紫外线照射减少PCR污染的原理紫外线(Ultraviolet、UV)诱导DNA的损伤是通过在相邻的嘧啶碱基(CT、TT、TC、CC)之间形成环丁烷环而发生的，环丁烷环形成链内的嘧啶二聚体，从而抑制了聚合酶介导的链延伸反应。变性退火535355533紫外线照射延伸5533特 点需要较长的时间，不能消除所有污染，对序列长度有一定的依赖性，当DNA片段小于300bp时效果较差。被