应用微生物第一章-第三节-微生物胞外多糖及其应用课件

1、1第三节 微生物胞外多糖及其应用第一章 微生物在工业领域中的应用生物技术专业应用微生物学课程2一、微生物胞外多糖概述31、微生物胞外多糖 胞壁多糖 肽聚糖、脂多糖 胞内多糖 糖原 胞外多糖（Extracellular polysaccharides） 分泌或扩散到细胞以外的多糖 荚膜 黏液层 最具开发利用价值的多糖4目前主要研究方向1、胞外多糖生理合成与调控研究2、胞外多糖合成遗传学研究 合成基因大片段定位在染色体上3、多糖分子结构与功能 一级结构、高级结构决定性能4、工业应用 建筑 石油5、免疫激活功能 灵芝多糖、香菇多糖、小核菌多糖的三股螺旋结构有免疫激活功能 干扰素的诱生剂，使抑制基因去

2、抑制 干扰素半衰期短 抗病毒、抗肿瘤的药物1、微生物胞外多糖5目前自然界发现有100多种微生物产胞外多糖主要是细菌：Xanthomonas sp.(黄单胞菌属)Leucostoc sp.(明串珠菌属)Azotobacter sp.(固氮菌属)Rhizobium sp.(根瘤菌属)Sphingomonas sp.(鞘胺醇单胞菌属)有少数真菌：Sclerotium sp.(小核菌属)Rhodotorula sp.(红酵母属)2、产生胞外多糖的微生物类群6粘稠、光滑的黄色菌落培养液呈粘稠胶状光学显微镜下包裹荚膜状物质电镜下分泌丝状多糖产生黄原胶野油菜黄单胞菌（Xanthomonas campestr

3、is）7黄原胶（Xanthan gum）“五糖重复单元”侧链残基被乙酰化或丙酮酰化不同菌株和不同条件所产的黄原胶存在异同8二、微生物多糖的合成模式和生理学调控1、依赖于糖基载体酯(C55-Lipid-p)的合成模式糖基载体酯（C55-Lipid-P）十一聚类异戊二烯醇磷酸酯，其功能是将胞质内的糖基聚合成多糖，并通过细胞膜运往胞外，因此它是控制多糖分子合成、运输与分泌的载体。糖基载体酯的科学研究功能调节、运载活性、提高产量9胞内玉米淀粉葡萄糖葡萄糖葡萄糖-6-磷酸葡萄糖-1-磷酸UDP-GlcGDP-ManUDP-GlcA-Glc-Glc-n Man-Ac GlcAMan=pyrUTPPPGTP

4、PPHMP途径C55-Lipid-pp特异糖基转移酶糖基载体酯焦磷酸化酶乙酰基转移酶丙酮酸转移酶多糖聚合酶UTP-Glc焦磷酸化酶GTP-Man焦磷酸化酶UDP-Glc脱氢酶淀粉酶胞外C55-Lipid-p+pAcPyrMembrane葡萄糖胞膜UTPPP二、微生物多糖的合成模式和生理学调控胞壁10黄原胶是依赖于C55-Lipid-P生物合成模式的典型代表。黄原胶合成生理调控核心步骤：1）胞外淀粉酶活性高低对黄原胶合成的影响X.Campestris NK-01以玉米淀粉为碳源玉米淀粉Glc进入细胞淀粉酶是控制底物进入细胞的“闸门”淀粉酶活性是碳源利用效率的关键高淀粉酶活性菌株筛选：淀粉酶N.K

5、-01细胞诱变比值大加碘液 证明是淀粉水解圈R水解圈(mm)R菌落(mm)玉米淀粉平板筛选淀粉酶活性高的菌株，检测黄原胶合成速率和产量二、微生物多糖的合成模式和生理学调控112)、C55-Lipid-P糖基载体脂运载功能的调节共利用调节：X. campestris NK-01，G-脂多糖、肽聚糖、黄原胶合成皆以C55-Lipid-P为糖基载体LPS合成pep合成C55-Lipid-PXanthan gumC55-Lipid-P共利用顺序：先用于胞壁多糖合成，后用于胞外多糖合成。 先长细胞，后合成胞外多糖Xanthan gum是次生代谢产物还是初级代谢产物？二、微生物多糖的合成模式和生理学调控1

6、23）运载活性的调节载体脂焦磷酸化酶C55-Lipid-PPC55-Lipid-PP引物胞壁多糖或胞外多糖无活性有活性载体脂焦磷酸化酶：最适pH7.0黄原胶发酵液pH5.0以下，终止合成流加NH4Cl，调pH7.0，促进黄原胶合成二、微生物多糖的合成模式和生理学调控134）筛选C55-Lipid-P含量高的菌株 C55-Lipid-P含量高的菌株杆菌肽高抗性菌株的选育（杆菌肽与C55-Lipid-P有很高的亲和力）。C55-Lipid-PPC55-Lipid-P焦磷酸化酶C55-Lipid-P无运载活性有运载活性杆菌肽Bacitrain影印C55-Lipid-P含量高不长菌落（C55-Lipi

7、d-P含量低）小菌落(C55-Lipid-P含量高)含杆菌肽？在高浓度杆菌肽平板上长出的菌落C55-Lipid-P含量高二、微生物多糖的合成模式和生理学调控142、不依赖于C55-Lipid-P糖基载体合成模式 肠膜状明串珠菌(Leuconostoc mesenteroides)厌氧条件下合成右旋糖酐(dextrans)即属该合成模式(1). dextrans生物合成显著特点1). 菌体生长和dextran生物合成以蔗糖为特异性底物；2). 蔗糖诱导菌体细胞产生葡聚糖-蔗糖酶(胞外酶)；3). 蔗糖做底物不进入菌体细胞。在胞外水解成葡萄 糖 和果糖，果糖进入细胞作碳源和能源，葡萄糖在胞外聚合成

8、右旋糖酐。二、微生物多糖的合成模式和生理学调控15细胞生长和dextrans合成同时进行，不进入细胞合成细胞物质厌氧代谢Gru蔗糖n蔗糖n果糖葡聚糖蔗糖酶诱导葡6葡6葡6dextrans葡葡3131分解聚合能量16三、微生物多糖发酵研究1、培养条件优化研究(1). 最佳培养基的确立单因子试验多因子多水平正交试验均匀设计实验计算机软件的应用(2). 最佳环境因子的选择(3). 营养因子。环境因子多因素。多水平均匀设计最佳选择2、最佳培养条件下物质消失变化的规律(1). 发酵过程中菌体细胞数量变化(2). 底物消长变化(3). 产物消长变化(4). 发酵液粘度变化(5). pH值的变化(6). 物

9、质消长变化规律综合分析。真实反应菌体细胞生长、代谢与环境相互关系的规律171000330009500015700021900027pH765V(CP)菌体蛋白（）0.54 0.43 0.32 0.21 0.10 8 16 24 32 40 48 56 64 72 80 88菌体蛋白pH产量(g/L)玉米淀粉()残余淀粉粘度X.Campestris.N.K-01 1200L罐黄原胶发酵过程中代谢变化产量三、微生物多糖发酵研究18综合分析：(1) 24小时前菌体细胞生长，大量消耗玉米淀粉作碳源，pH下降，黄原胶不合成，发酵液无粘度(2) 24小时后菌体平衡生长，残余淀粉用于黄原胶合成，产量、粘度剧

10、增，72小时发酵终止。(3) 采用流加补充底物(淀粉、Glc或蔗糖)和氨水调节pH7.0，可进一步促进分批发酵过程中的黄原胶合成。3、黄原胶分离纯化分离原理与方法(1).乙醇、丙酮沉淀法国内外常用方法，纯度高，溶剂回收是技术与成本的关键(2).钙盐沉淀法Ca离子与羧基结合，碱性条件下沉淀 COO OOCCa+ Ca+(OH)219 碱性条件下钙盐浓缩黄原胶分子用酸醇处理脱钙，黄原胶分子才溶于水成本低，水溶性差(3).喷雾干燥法纯度低，水溶性差(4).滤膜超滤技术用滤膜浓缩，再用少量乙醇沉淀滤膜质量4、质量标准 GB:食品添加剂黄原胶粘度（CP）1水溶液600剪切性能值6rpm.V/60rpm.

11、V 6干燥比重（）13灰分（）13总N含量（）1.5三、微生物多糖发酵研究20 砷（As）含量（ppm）3重金属（以Pb计，ppm）10微生物指标细菌总数（1g粉状产品）10000霉菌总数（1g粉状产品）300致病菌Coliform不得检出Salmonella不得检出S.aureus不得检出P.aeruginosa不得检出X.campestris不得检出未列入标准丙酮酸含量（）1.5三、微生物多糖发酵研究211、几种重要的胞外多糖分子组成（1）.Dextrans(右旋糖酐)产生菌:肠膜状明串珠菌糖基单体:-D-Glc分子结构分子量:数千万（2）.Pullulan（普鲁兰）产生菌：出芽 梗霉重复

12、单位结构 n分子量：41042106GlcGlcGlcGlcGlcGlc支链：-1.3链GlcGlcGlc-1.4四、微生物胞外多糖的分子结构与性质22（3）.cleroglucan(核菌葡聚糖)产生菌:葡聚糖小核菌糖基单体：DGlc重复单位结构（4）.Xanthan（黄原胶）产生菌：X.Campestris（野油菜黄单胞菌）糖基载体：Glc，Man，GlcA非糖基组分：Ac，Pyr重复单位结构GlcGlcnGlc-1、4键Glc-1、6键四、微生物胞外多糖的分子结构与性质23pyr含量越高，剪切稀释性能越好分子量25106（5）. Bacterial alginate（细菌藻朊酸）产生菌：棕

13、色固氮菌糖基单体：ManA,GulA非糖基组分：Ac分子结构ManAGulAManAGlcGlcnMan-AcGlcAMan=pyr(并非皆有pyr)-1、4键Ac|24（6）.Colanic acid（肠细菌酸性多糖）产生菌：大肠菌群糖基单体：Glc，Gal，Fuc，GlcA非糖基组分：Ac重复单位结构：大肠菌群细胞表面多糖抗原成分，不能作为商品 PyrGal|GlcA|Gal|nGlcFucFucAc|四、微生物胞外多糖的分子结构与性质25结冷胶主链结构是葡萄糖、葡萄糖醛酸、鼠李糖以211摩尔比聚合而成的四碳重复单元的长链分子。天然结冷胶与低乙酰基结冷胶在结构上的不同点在于：前者在第一个葡

14、萄糖分子C2 处被甘油酸酯化, C6处被乙酸酯化。天然结冷胶的分子结构（7）. 结冷胶四、微生物胞外多糖的分子结构与性质26一级结构：黄原胶分子主链以-1.4键构成纤维素骨架的线性结构，侧链含羧酸带负电荷，反向缠绕主链，呈锯齿状二级结构：两条线性黄原胶分子靠氢键维系成右手双股螺旋结构五、微生物胞外多糖的分子构型与性质 黄原胶的分子构型27双股螺旋结构间靠微弱的非共价键结合，排列成螺旋共聚体 黄原胶分子构型的变化：螺旋共聚体升温、高剪切降温、低剪切不规则线团双股螺旋三级结构：28黄原胶的优良性能粘浓曲线（1）增黏性黄原胶溶液具有一定黏度，并在一定条件下随溶液浓度增加而增大。29粘剪曲线（2）剪切

15、稀释性、触变性剪切稀释性表观粘度随着剪切速率的增加而降低的特性触变性由于剪切作用造成黏度降低的自行恢复能力螺旋共聚体双股螺旋不规则线团本质是由黄原胶分子构型的变化所决定的：黄原胶的优良性能30（3）乳化性，悬浮颗粒性黄原胶的优良性能31（5）稳定性（耐温，抗盐）COO-Na+，K+，Mg2+，Ca2+COO-黄原胶的优良性能（6）成凝胶性+ Cr3+（4）持水性32(1).食品工业应用冰激凌等冷冻食品烘烤食品果冻、果浆食品饮料、食品保鲜(2).非食品工业制药、印染、纺织、造纸、搪瓷、炸药、农药喷洒、建筑材料、墨水等(3).油田开发油田钻井泥浆、压裂液、固井液、注水采油增粘剂、注入调剖剂、大孔道

16、封堵剂四、微生物胞外多糖广泛应用33胞外多糖在矿物加工工程中的研究和应用 硫化矿的浮选中的抑制剂，其基本思路是以细菌胞外聚合物替代金属盐类和氰化物，这样不仅可以获得较好的经济效益，而且还可解决使用金属盐类和氰化物带来的环境污染问题。很多研究者借鉴环境领域中有关利用细菌胞外聚合物处理重金属废水的研究成果，在矿物浮选过程中将胞外聚合物作为生物絮凝剂。索马桑达兰等指出，细菌及胞外聚合物可增强方解石的絮凝。有色金属的湿法浸出及从有色金属废渣中回收重金属的研究，基本思路是吸附至矿物表面的细菌被自身产生的EPS所包裹，而EPS又介导了细菌与硫化矿物能源的接触，在生物膜的形成和细菌- 基质的界面作用中起着重

17、要作用。菌表面的脂类、多糖和蛋白质等物质形成的EPS是细菌真正的功能表面，在细菌与矿物之间的复杂界面作用中起着极其重要的作用。随着矿物加工行业的不断发展，胞外聚合物在矿物加工工程中的作用会越来越大，主要将体现在以下几个方面: 与其它处理方法结合处理低品位难处理矿石; 作为矿物浮选的生物药剂代替昂贵的对环境有危害的化学药剂; 与其它方法结合处理固体废弃物，回收有价金属; 除去矿物产品中的杂质，例如除去煤中的硫、除去钢渣和锰矿石中的磷等。 34胞外多糖在环境工程中的研究和应用 胞外聚合物在环境工程中的应用主要是去除废水中的重金属。由于胞外聚合物可以与金属离子之间相互作用，因而可以利用胞外聚合物去除

18、废水中的金属离子。 首先沉淀的金属离子被生物膜絮凝物捕获； 胞外聚合物与可溶性金属成键； 细胞积累可溶性金属； 使金属向大气中挥发。随着国家对环境保护的日益重视，胞外聚合物在环境工程中的应用前景也会更加广泛，主要将体现在以下几个方面： 与活性污泥相结合处理重金属废水； 用于修复被烃类和原油污染的土壤； 用于修复被重金属污染的土壤； 用于消除开放海洋或沿海环境中碳氢化合物的污染。35胞外多糖在食品工业中的研究和应用 食品工业中对胞外聚合物主要是利用其中占总成分量65%的胞外多糖。胞外多糖可以用作食品添加剂、抗凝剂、保鲜剂等，已经获得工业应用的有结冷胶、黄原胶等。在细菌胞外多糖中，被研究得较多的是

19、乳酸菌胞外多糖，其中包括乳杆菌属、链球菌属、明串珠菌属和乳球菌属等。由肠膜明串珠菌产生的右旋糖酐是最早被开发利用的乳酸菌胞外多糖，也是美国食品和药品管理局(FDA)批准的第一种可用于食品的微生物胞外多糖。乳酸菌胞外多糖主要用作食品添加剂，如作为酸奶、饭后甜点、汤、沙司和色拉的助剂，作为益生元，用来提高干酪的产量和保水性等。 随着人们生活水平的提高，胞外聚合物及其主要成分会越来越多地在食品工业中被应用，主要将体现在以下几个方面： 作为天然保健食品被开发； 用于酸奶、干酪的生产； 作为优良的天然食品添加剂，改善食品的结构，增加食品的风味； 用作保鲜剂。 36胞外多糖在生物医药工程中的应用 生物医药工程中对胞外聚合物的研究和应用主要集中在胞外聚合物的主要成份多糖的生物活性功能、药理作用与免疫保健作用方面。多糖作为药物应用开始于20世纪40年代，人们相继发现它具有很多生物学活性，如抗辐射、抗凝血、降血糖、抗感染，预防和治疗肿瘤及艾滋病等。因此，研究和开发生物多糖成为热点课题。EPS可以帮助细菌抵制抗生素、有毒金属、氯化物等不利因素。在牙菌斑生物膜中，变形链球菌产生的胞外多糖能帮助细菌躲避人类中性白细胞