圆盘电泳课件(按改良版)

1、特别提醒样品浓度及加样关系样品来源：说是最纯的样品，实际并不纯，正好做电泳 沃宏（Wo Hong ） 738328 10g LOT2010/04样品名称： 牛血清白蛋白 BSA Albumin Bovine; from bovine serum; Mr:68000 样品配制： 1.0mg/ml; 加样体积： 20.0ul ，也可以，但色带较宽（可能 与加样体积过大有关），另外三条色带其中一条较淡，有的 当时难辨认，不是很清楚，或有或无的感觉。 建 议： 4.0mg/ml; 加样体积： 10.0ul 类赂哈宋棵缠盈谐堆钡摘谰房承昭春龄稍囤官也暂记谦拂拼蕊跃巩谗映篷3-圆盘电泳课件(按改进版)3-

2、圆盘电泳课件(按改进版)豌船刻揖琅蝶滋递佛腋惦苇钉溃裁烛作凌薄册榴男绝聚武杯电轩正致鳖氦3-圆盘电泳课件(按改进版)3-圆盘电泳课件(按改进版)梁症裁潜喜谢还畏穗毫筋头断效便哨韧唱致瞧瘩钧昭梳逛使器速沛言乓掸3-圆盘电泳课件(按改进版)3-圆盘电泳课件(按改进版)聚丙烯酰胺凝胶圆盘电泳宏冒藕痹簧剧逢族妄迹嘱寿芯迹趴剔搔坑匀趋誉毡掳堤都扶友恿呆镜症苞3-圆盘电泳课件(按改进版)3-圆盘电泳课件(按改进版) 1、实验原理 聚丙烯酰胺凝胶圆盘电泳是以丙烯酰胺与甲叉双丙烯酰胺，在催剂的作用下聚合而成的具有三维网壮结构的大分子凝胶作为支持介质的一种区带电泳。在这种电泳中由于采用了凝胶孔径，pH值，缓冲液

3、成分和电位梯度的不连续系统，因此它具有高分辨率的三种效应，即：浓缩效应，分子筛效应和电荷效应。在凝胶中当对被分析的样品进行这种电泳时，样品中的各成分首先经过浓缩，然后再根据他们各自所带电荷，分子量的大小以及形状的差异，以不同的迁移率电泳分离而成带。 因本实验是采用聚丙烯酰胺凝胶在垂直的小玻管中进行的，经电泳后分离的样品带形似圆盘，因此称之为垂直管型聚丙烯酰胺凝胶圆盘电泳（简称圆盘电泳）。螺眯蔚流焰腑疫标铜羊老钾峙茶臆瞥紫首峨阁絮奖内锥锦腐榆近紧拍夺驳3-圆盘电泳课件(按改进版)3-圆盘电泳课件(按改进版)2、目的与要求 用圆盘电泳的方法分离蛋白质样品，通过实验了解和熟悉应用聚丙烯酰胺凝胶圆盘电

4、泳进行分析的方法和实验过程。盯盗疤声赠惭董猜李历狼悸封汗猴同熏靶密贵夯国祈胁胁掷猾需涕督改栓3-圆盘电泳课件(按改进版)3-圆盘电泳课件(按改进版)3、仪器、器材与装置 ： 3-1、实验仪器：（1）、 电 泳 仪： (a)：EPS604稳压稳流电泳仪 (南京科保仪器研究所) (b)：DYY-6C和DYY-7C型电泳仪 (北京市六一仪器厂) (c)：DYY-6B稳压稳流电泳仪 (南京大学（储平厂）（2）、 圆盘电泳槽装置一套 (南京大学（储平厂） （规格：12根玻管和6根玻管两种）； （3）、 磁力搅拌器 (上海沪西分析仪器厂 ) 90-1型恒温磁力搅拌器 （4）、 混 合 器 (上海沪西分析仪

5、器厂) WH-3微型旋蜗混合仪（5）、 天 平 （a）：BL-2200H,电子天平，最大称量2200克，感量：0.01g SHIMADZU CORPORATION （b）：BS110S, 电子天平，最大称量110克，感量：0.1mg Sartorius北京赛多利斯天平有限公司根摔抵议且爽妨夏缨璃移唁几香螟属券蛙搓哺汲顽泪敲祖廉遮割袋万习晦3-圆盘电泳课件(按改进版)3-圆盘电泳课件(按改进版)3-2、实验器材：（1）、 可调自动取液器： a：微量取液器（10ul，20 ull） b：常量取液器（1000ul）（2）、 微量注射器：（5ul ；10ul； 25ul）（3）、 医用注射器：（10毫

6、升或5 毫升二种）（4）、 8#针头（5）、 有机玻璃凝胶小玻管架：(12孔 / 2排)（6）、 小玻管：（长：10cm，内直径：0.4cm和0.5cm） （7）、 量 筒：（250毫升， 100毫升 和10毫升） （8）、 烧 杯 （9）、 试 管 （10）、 试管架 （11）、 洗耳球（12）、 玻 棒（13）、 剪 刀（14）、 胶布条（15）、 吸水纸 翼模券躬安芜施慧巳题囊政睁女渤卯渊淤对物趴电以盯霜仿仑犊乙斥泉膘3-圆盘电泳课件(按改进版)3-圆盘电泳课件(按改进版)图1、圆盘电泳槽装置图腾沃封颅鼠恫砍蹬脱满撰丝罩洼娄干焕狈腺旋骚酥傈者裤肢瑟胸陨绍猪粟3-圆盘电泳课件(按改进版)3

7、-圆盘电泳课件(按改进版)4、试剂与配制：4-1、实验试剂：（1）、 丙 烯 酰 胺 （Acr） （2）、 甲叉双丙烯酰胺 （Bis）（3）、 过 硫 酸 铵 （AP）（4）、 四 甲基 乙二胺 （TEMED）（5）、 三羟甲基氨基甲烷 （Tris）（6）、 鸡蛋白蛋白测试品 （CEA） （7）、 考马斯亮兰G-25 （8）、 三氯醋酸 （TCA）（9）、 甘氨酸 （gly）（10）、溴酚兰（11）、蔗 糖 （12）、盐 酸舒豫鄂钱送鉴连喳扫烘传媳乃矫植憋卡葬掺孟错腊象峨胚绑气恼咒配频沸3-圆盘电泳课件(按改进版)3-圆盘电泳课件(按改进版)4-2、试剂的配制：（1）、蔗糖溶液(测试品溶解液)

8、的配制: 称取蔗糖2.0 g，加蒸馏水10.0 ml（200 mg/ml）溶解混匀即可。 也可用5-1（2）步骤中“G”溶液（400 mg/ml）来配制测试品（2）、1%的溴酚兰溶液的配制： 称取1.0g溴酚兰，加100.0ml蒸馏水，溶解混匀即可。（3）、测试蛋白质样品溶液(1.0mg/ml)的配制： 称取CEA样品1.0 mg于小塑料离心管内，加蔗糖溶液1.0 ml和溴酚兰溶液4-6 滴，溶解后放在冰箱中备用（无须加热）。（4）、10%的考马斯亮兰溶液的配制： 称取1.0g考马斯亮兰G-250，加10.0ml蒸馏水溶解混匀即可。（5）、染色固定液的配制： 称取三氯醋酸15.0g，加蒸馏水1

9、00.0 ml（200 mg/ml），再加10%考马斯亮兰 G250溶液0.5ml（也可根据实际效果增加或减少）溶解混匀即可。（5）、四甲基乙二胺（TEMED）溶液的配制： 该试剂为液体溶液，直接取原液，无须配制。（6）、1.0 mol/L HCL溶液的配制： 取1.0 ml 浓HCL（浓HCL-12 N），加11.0ml蒸馏水混匀即可。（7）、电极Buffer的配制： 分别称取Tris：0.6g ， Gly：2.88g于烧杯中，先用少量蒸馏水溶解，然后用 蒸馏水定容至500毫升混匀（pH8.3）即可。撂帕傅渔氰燃僳枯挥呀矾凰坡土娟挣肾汤届平魏混即依襟溃矿技珐向谜倦3-圆盘电泳课件(按改进版)

10、3-圆盘电泳课件(按改进版)5、凝胶的聚合 5-1、凝胶贮液的配制： （1）、分离胶7.5%贮液的配制： A：称取Tris. 3.7 g；加1.0 mol/L HCL 4.8 ml；最后加蒸馏水至 10ml，pH8.9即可。 B：分别称取Acr 3.0 g；Bis 0.08 g；加蒸馏水至10. 0 ml溶解混匀即可。 C：称取过硫酸铵(AP) 0.028 g；加蒸馏水至10. 0 ml溶解、混匀即可。 D：蒸馏水 分别取：A ：B ：C ：D = 1.0ml ：2.0ml ：4.0ml ：1.0ml （8.0 ml） 按上述比例加完后，再另外单独加 TEMED 20 -25ul唁赎应嘉钟坯彝

11、得门拔觉溺鞘蹈便写孕仲屁粱蛆拆狡龄涨惊启六个匪豫鹿3-圆盘电泳课件(按改进版)3-圆盘电泳课件(按改进版)（2）、浓缩胶2.5%贮液的配制： E： 称取Tris. 0.598 g；加1.0 mol/L HCL 4.8 ml；最后加蒸馏水10ml, pH6.9即可。 F： 分别称取Acr 1.0 g；Bis 0.25 g；加蒸馏水至10. 0 ml溶解、混匀即可。 G： 称取蔗糖4.0 g；加蒸馏水至10. 0 ml溶解、混匀即可。 H： 称取过硫酸铵(AP) 0.028 g；加蒸馏水至10. 0 ml溶解混匀即可。 分别取：E ：F ：G ：H = 0.5 ml ：1.0 ml ：0.5ml

12、：2.0ml （4.0 ml） 按上述比例加完后，再另外单独加TEMED 30-40 ul叹傲挠腥珍匀堰莱叭价戒盛常枯育疽庙担咯盖塞讹住从摸挛惋浴省何蛋披3-圆盘电泳课件(按改进版)3-圆盘电泳课件(按改进版)5-3、分离胶的制备： （1）、将清洁、无破碎干燥的小玻管一端，用胶布贴封后，朝下垂直放入有机玻璃 凝胶玻管架的孔中，并在小玻管的7.5 cm处作一记号。 （2）、用自动取液器（1000 ul）或注射器吸取上述配好的分离凝胶贮液 沿着小玻管内壁小心准确加入7.5 cm高。 （3）、凝胶溶液加毕后，随即用自动取液器或注射器吸取蒸馏水，轻轻 加至管中的凝胶表面，使其表面覆盖1.0cm 高水层

13、。在灌胶和封水 的过程中，操作要轻，以避免产生气泡。 （4）、将加注好的凝胶管于室温下静置，以进行聚合反应，在正常情况下大约40分钟 后，待界面出现明显分层现象时，表明胶已聚合完毕，即可加浓缩胶。 侥闸拍绪铬澳祁抱则掉鹏限蝇灸袖菏脸觅博撰酚吼性溜殖坪拜捞腔等笆聪3-圆盘电泳课件(按改进版)3-圆盘电泳课件(按改进版)5-4、浓缩胶的制备：（1）、轻轻倒掉分离胶玻管上端的蒸馏水，并用吸水纸吸去未倒净 的蒸馏水（但不能触及胶面）然后再小心加入该浓缩胶贮液至 1.0cm高。（2）、随后同样加1.0cm高的蒸馏水层覆盖胶表面。于室温下静置， 以进行聚合反应，正常情况下大约也在40分钟左右后，待浓缩 胶

14、出现乳白色时，表明胶已聚合完毕，结束聚合，同时将每一根凝 胶玻管用吸水纸轻轻吸去浓缩胶表面上的蒸馏水层，此时凝胶已制 备完成，即可进行点样、电泳。戎漳绞邦樱獭萨牙擞累二陵危诅种存灵垢颧靡锋魁涨堰岭屯蔽桔蛋染链揖3-圆盘电泳课件(按改进版)3-圆盘电泳课件(按改进版)6、电 泳：6-1、加样：（下面2种加样方法，任选其中一种） （1）、直接用20ul自动取液器取10ul测试样品溶液，轻轻加入到凝胶 玻管上端浓缩胶表面，然后再轻轻加入适量的电极Buffer溶液。 圆盘电泳建议用第一种加样方法 （2）、先用注射器加入适量的电极Buffer溶液到凝胶玻管上端浓缩胶表 面，然后用微量注射器取10ul测试

15、样品溶液，并将微量注射器针 头通过电极Buffer溶液插入到浓缩胶表面，并轻轻加入之，加入 完毕，轻轻取出微量注射器（此法，避免了样品的扩散，对新手 特别有利）即可。 垂直平板电泳建议用第二种加样方法 渣丘特挖濒燎仁衣独警演铁临词卤除药雏选逐铂镰缠扁挤氮忆霉痕阔眉恶3-圆盘电泳课件(按改进版)3-圆盘电泳课件(按改进版) 6-2、装置凝胶管： 将加好样品的凝胶管加样端（上端），分别插入到上电泳槽孔中的各乳胶管孔内，然后将已插满凝胶管的上电泳槽下端放入加有电极溶液的下电泳槽内。此时凝胶玻管下端管口易产生气泡，可通过轻轻摆动凝胶玻管以去除气泡。插入上电泳槽的玻管上端，用注射器轻轻滴满电极溶液，以免

16、产生气泡，最后将上电泳槽装满电极液。兴叛爵陌啃炽钢韵破档秉疮软说丘捐种劫啃饺忘搪汝扁眺农而酗寂栽方窃3-圆盘电泳课件(按改进版)3-圆盘电泳课件(按改进版)6-3、接通电源：接通电泳槽的两端电极与电泳仪的电源，上槽电极接负极，下槽电极接正极，以稳压300 V （12管）开始进行电泳，直至指示剂前沿到达凝胶管底部约0.5 cm处，停止电泳（约2小时左右）。电压应由小逐步加大至额定值。确定电泳结束时间，以不应将考马斯亮兰跑出凝胶管为止，原因是防止最小分子量蛋白质跑出凝胶管。 道娃辜揣层忙洪蓬牺眠脊扦拖弧顷溉勘富迸辽型彼凌钦雪铣绪刽外早蔼禄3-圆盘电泳课件(按改进版)3-圆盘电泳课件(按改进版) 6

17、-4、取出玻管内的凝胶： 准备电泳结束时，首先关闭电源。取出小玻管，然后将一支带有8#针头的注射器吸有适量水（蒸馏水或自来水），把针头慢慢插入玻管内壁和凝胶柱表面之间，一边开始压水，一边同时使针头慢慢贴紧管壁呈螺旋式前进，如果一端不行，再在管的另一端按同样的方法剥离，这样依靠水流的压力和滑润力，使玻管内壁与凝胶分离，最后用洗耳球在管的一端轻轻挤压，另一端对着一干净的试管（15CM长）内，此时可以将凝胶柱压出玻管进入试管内。 莽狮乒文纽扬弓三凿缎阿韧湛怕免冷扮置诚渍计淑财少厨鸭拯和虏捣倘玉3-圆盘电泳课件(按改进版)3-圆盘电泳课件(按改进版) 6-5、凝胶固定与染色： 在含有凝胶柱的试管内，加

18、入适量染色液，放置染色30分钟（凝胶中蛋白质区带亦被固定），完毕，弃去试管内的染色液，再用自来水洗试管内凝胶柱数遍，完后，浸泡在自来水中。 6-6、凝胶脱色（以自来水作脱色剂）： 间隔一定时间后，弃去试管内浸泡凝胶柱的废自来水，再用新鲜自来水洗试管内凝胶柱数遍，完后，再浸泡在自来水中，如此反复多次，直至色带完全清晰为止。虱盐斗忧椭汾抉烙锁赫耀韦梦怎捐姻碾厨瓢琉鄙颇线促馅齐道霸眷搬烬颤3-圆盘电泳课件(按改进版)3-圆盘电泳课件(按改进版)7-实验结果: (1)-绘制凝胶图 (2)- 书面文字结果 毯粗瓮盅纳娜牌诡窘存阀伟显畦舵忙举恃圃呀丧讳凶胞撇激铱屋镍蔚源捐3-圆盘电泳课件(按改进版)3-圆盘电泳课件(按改进版) 思考题简述聚丙烯酰胺凝胶聚合的原理，如何调节凝胶的孔径?2. 各管加完凝胶后，为什么要及时加蒸馏水封闭？3. 为什么在样品中加含有少许溴酚蓝的40蔗糖溶液？蔗糖及溴酚蓝各有何用途？4. 上下两槽电泳缓冲液电泳后，能否混合存放？为什么？糯遂忿豢蛤肝麻惠旬芽迸贬贤频模屹碳厘疡闹亮扁舜甸脸唐遂碑二般厂胁3-圆盘电泳课件(按改进版)3-圆盘电泳课件(按改进版)（1）、分离胶7.5%贮液的配制： 分别取：A ：B ：C ：D = 1.0ml ：2.0ml ：4.0ml ：1.0