学习情景三培养微生物课件

1、微生物应用技术学习情景三 培养微生物、测定其生长主要内容任务1 测定微生物生长 任务2 理化因素对微生物生长的影响12任务3 微生物的分离和纯培养技术3学习情景三 培养微生物、测定其生长（1）微生物纯种分离、培养和常用的接种技术以及菌落的初步鉴定；（2）生长曲线，生长的测量方法，环境对微生物生长的影响等；（3）理化因素对微生物生长的影响。【学习内容】学习情景三 培养微生物、测定其生长 掌握微生物纯种分离、培养和常用的接种技术以及菌落的初步鉴定；掌握生长曲线和生长的测量方法；掌握理化因素对微生物生长的影响。【知识目标】【技能目标】 根据菌种需要，配制不同类型的培养基；完成菌种的纯化及测量等操作过

2、程。任务1 测定微生物生长学习情景三 培养微生物、测定其生长 为了全面对微生物的测量，需要了解微生物生长曲线的相关内容。任务分析任务1 测定微生物生长 无论在自然条件下还是在人工条件下，微生物作用的发挥，都是“以数取胜”或是“以量取胜”。生长、繁殖就是保证微生物获得巨大数量的必要前提。 任务提出任务1 测定微生物生长一微生物的生长繁殖生理生命活动机理（食、住）生命活动营养、呼吸、环境卫生营养物及其获取方式营养营养物质的代谢 呼吸那些环境因素使细菌病、死？环境卫生任务实施的相关专业知识任务1 测定微生物生长个体生长细胞物质有规律地、不可逆增加，导致细胞体积扩大的生物学过程。群体生长：在一定时间和

3、条件下细胞数量的增加。繁殖微生物生长到一定阶段由于细胞结构的复制与重建并通过特定方式产生新的生命个体，即引起生命个体数量增加的生物学过程。提问：为什么这里不考察细菌个体的生长呢？个体太小，难观察计量; 群体细菌对环境产生影响任务实施的相关专业知识一微生物的生长繁殖各类细菌都是倾向于群居（物以类聚）一山不容二虎提问：弱势生物的群居优势是什么？生存状况提高，攻防具佳（攻）群居的细菌获得营养的能力大大高于游离的细菌， （防）群居的细菌不易被天敌伤害，还能释放类似外激素的调节因子，使群体主动适应环境的变化，可有性生殖；团结就是力量一微生物的生长繁殖外界因素引起的细菌数量的增加、停滞、衰减等变化。提问：

4、如何研究呢？ 测菌数量变化与外因的关系细菌群体力量改变环境通常都是将细菌群体作为研究对象，考察细菌群体的生长规律“生、老、病、死”。提问：细菌群的“生、老、病、死”表现为何呢？一微生物的生长繁殖（一）微生物生长繁殖的测定方法1.测生长量（1）测体积 初步比较。 把待测培养液放在刻度离心管中作自然沉降或进行一定时间的离心，然后观察其体积等。一微生物的生长繁殖（2）称重法方法 ：离心法或过滤法，测定样品的湿重或干重。已知单个细菌的平均重量 除法计算细菌的湿重量10-1510-11g/个细胞干重约为湿重的1020。干重法方法：含菌水样在105110下进行干燥恒重（本质测水中悬浮物重量MLSS或MLV

5、SS）。（一）微生物生长繁殖的测定方法1.测生长量悬浮物无机物+有机物（包括细菌）提问：如何确定悬浮物中有机物与无机物的量？高温(550)灼烧 无机物化学性质稳定，高温下不会分解提问：什么情况下可以直接用悬浮物的重量表示细菌的重量？悬浮物中绝大多数是细菌。一微生物的生长繁殖1.测生长量（2）称重法悬浮物中绝大多数为细菌时细胞数目=MLSS个体细菌的平均干重量离心沉淀 滤膜过滤计算105110下进行干燥恒重称重或MLSS悬浮物（一）微生物生长繁殖的测定方法除细菌外还有大量无机悬浮物时 W无MLVSS挥发性悬浮物MLSS W无 =细菌群体的干重量细胞数目= MLVSS个体细菌的平均干重量 550下

6、灼烧2h称重105110下进行干燥恒重称重MLSS（一）微生物生长繁殖的测定方法（3）有大量非细菌有机悬浮物时提问：如何测定呢？不能用重量法，应改用其他方法。总体来说重量法方法误差较大，一般只作为菌数粗略估算如活性污泥测定（以重量MLSS、MLVSS间接表示细菌数量）（一）微生物生长繁殖的测定方法 （3）比浊计数法浊细菌悬浮液的浊度提问：如何定量二者关系呢？细菌不完全透光，一定范围内菌溶液的混浊度与菌数量成正比原理：菌体的生长可使培养液产生浑浊现象。 方法：用比浊计、比色计、分光光度计测定培养液的浊度，用透光率或光密度表示菌悬液的浓度，再对照标准曲线，即可求出菌数。 （一）微生物生长繁殖的测定

7、方法 (2)比浊法（一）微生物生长繁殖的测定方法 制标准曲线（ODNo）测菌液浊度，查图表得出细菌数量浊度仪或721分光光度仪（一）微生物生长繁殖的测定方法仪器：浊度计、分光光度计等仪器测出菌液的浓度，然后再对照标准曲线，就可查出相似的菌数。注意:培养液的颜色太深会影响测定结果，不要混杂其他物质。适用范围：用于溶液的总细胞的计数。缺点：灵敏度较差优点：简便、快速、不干扰或不破坏样品。浊度计分光光度计（一）微生物生长繁殖的测定方法（4） 含N测定法原理：细胞蛋白质量是比较稳定的，可反映微生物的生长量。通过菌体含氮量的测定求出蛋白质的含量，并大致算出细胞物质的重量。方法：从一定量培养物中分离出菌体

8、，洗涤后用凯氏微量定氮法测定出总氮含量，其值乘以6.25，大多数生物包括细菌，细胞内的蛋白质氮含量比较稳定，一般为蛋白质干重1516，平均为16。（一）微生物生长繁殖的测定方法 2.计繁殖数 提问：前述方法中计数的不都是活菌，如何分辨菌死活？繁殖提问：细菌繁殖的可见现象是什么？产生菌落（固体培养基培养）、菌液混浊（液体培养基培养）计数原理：一个细菌可繁殖成一个菌落或一群细菌.缺点：慢 分固体培养法和液体培养法（一）微生物生长繁殖的测定方法 2.计繁殖数计算微生物的个体数目。适宜于单细胞状态的微生物或丝状微生物所产生的孢子。（1）显微镜直接计数法 又称为全菌计数法，借助显微镜观察测定优点：快速提

9、问:有哪些缺点?缺点：不能区分细菌的死活。（一）微生物生长繁殖的测定方法一微生物的生长繁殖（1）显微镜直接计数法计数器(血球计数板）测定法0.052cm2250.1ml菌液1625格或25*16格（一）微生物生长繁殖的测定方法提问：数了125个小格中有90个细菌，样品中的细菌浓度是多少？(90个125) 400 / 0.1ml =2880个/ml适用范围：测定个体较大的细菌或原生动物细菌个体若太小、过多，由于每一小格中细菌层层叠加，相互遮挡，难以准确计数。数数细菌（或其他微生物或细胞）数目，（一般数125个小格），折算样品细菌浓度；（一）微生物生长繁殖的测定方法 2.计繁殖数 (2)平板菌落计

10、数法 通过测定样品在培养基上形成的菌落数来间接确定其活菌数的方法。依据：在稀释情况下一个菌落是由一个活细胞繁殖形成的。（一）微生物生长繁殖的测定方法（一）微生物生长繁殖的测定方法无菌水（2）平板计数法第一步：菌样巧妙稀释得到不同稀释度 （10-x）菌液菌样被无菌水不同稀释倍率后平板培养图 10-2 10-3 10-4 10-5 各取1ml于培养皿上,再加入不烫手固体培养基平板上混合均匀冷却。第三步：培养稀释度过低，菌落密集无法计数可以计数，但数量过多，费时费力数量合适，统计计算，作为结果数量太少，误差因素太大，不做计数第二步：接种平板每一个细菌会生成一个菌落一微生物的生长繁殖一般计数平板的细菌

11、生长菌落数以30300个为宜。第四步： 计数细菌数量=？细菌数量=数出的菌落数/稀释度例如：10-5稀释度时菌落数为125cfu细菌数量=125/10-5=1.25107cfu/mL 平板计数法是采用最广的一种活菌计数法如国标法水中细菌总数的测定 。注意：作空白及取平行样（23组）均值减小误差平均（一）微生物生长繁殖的测定方法（3）膜过滤法方法：用微孔薄膜过滤定量的空气或水样，菌体便被截留在滤膜上，然后取下滤膜进行培养，计数其上的菌落数从而求出样品中所含的菌数。适用范围：对于细胞总数106个/ml的液体样品。对膜干燥后，染色、计数（一）微生物生长繁殖的测定方法（3）薄膜计数法薄膜微孔滤膜（0.

12、45m） 滤膜培养膜有菌面冲上原理膜抽滤（细菌浓缩）+ 膜平板培养 + 计数抽滤（滤器及膜事先灭菌）（一）微生物生长繁殖的测定方法统计计数提问：假如 测出250cfu菌落，抽滤了50ml自来水，自来水中菌浓度是多少呢？ 25050ml=5cfu/ml自来水样品中的细菌数量=菌落数抽滤样品的体积数提问：如何用活菌计数法测定较脏的水样？减少滤液体积、无菌水稀释（一）微生物生长繁殖的测定方法（4）稀释培养法原理：菌液经多次稀释后，菌数可随之减少直至没有。可从最后有菌生长的几个稀释度的35次重复中求最大概率数。 所以又叫MPN(最大可能数量)法。（一）微生物生长繁殖的测定方法 （4）最近似法特点：液体培养、统计学查表计数又称MPN法 （或最可能数法）例如测定SRB（硫酸盐还原菌，厌氧）的数量提问：能用稀释平板法计数吗？为什么？一般不能，厌氧菌暴露在空气中不能生长（除非厌