制备色谱技术课件

1、制备色谱技术及方法建立 内 容1 、概述2、常用制备色谱技术3、其它制备色谱技术4、展望 制备LC与 分析L比较 目的 填料流量流通池 联系 制备HPLC样品中特定成分的高纯度获取，大量、廉价的制备 20以上为佳 10-150ml/min 最大允许流速可为150mL/min在进行制备HPLC之前，常先进行分析HPLC实验，对分析方法进行优化、放大应用到制备HPLC中。分析HPLC 定性分析：检测的灵敏度定量分析：分离度、再现性 3-5 0.001-9.999ml/min最大允许流速仅为5 mL/min，或者10mL/min一、 概 述 线性色谱和非线性色谱 制备分离的目标和策略 制备分离的五要

2、素样品性质： 组成、基体、含量、价值等产品纯度： 天然产物、测试样、生物活性等 (70%) (95%) (活力)制备量：mg, g, kg, t时间和成本：科学研究 工业生产 分离的影响因素固定相、 流动相选择固定相颗粒直径、上样量、流动相等适当增加有利于制备分离选择最佳TLC 、HPLC 分离条件分析型TLC 或HPLC 上进行半制备性分离 放大到制备规模分析型TLC 或HPLC 上进行产品纯度检验如不符合要求，重新进行上述实验制备色谱操作条件优化一般步骤二、常用制备色谱技术1 、制备薄层色谱2、经典柱色谱3、低压、中压制备色谱4、高压制备液相色谱5、特殊形式色谱柱6、柱色谱中分离、实验条件

3、选择制备薄层色谱 展开槽 处理样品量 1mg 1g 条状上样 薄层制备 活化 点样 展开 检测/收集Centrifugal Thin-Layer ChromatographHarrisonHitachi 离 心 薄 层上个世纪60年代Dalcortivo 提出， 又称旋转薄层 特点： 操作简便、分离时间短、可重复使用 经典柱色谱类型： 吸附柱色谱： 硅胶、 氧化铝、聚酰胺等 分配柱色谱：载体（硅胶、硅藻土、纤维粉等）吸附一层液体构成 固定相，用另一种不相溶的溶剂洗脱 离子交换柱色谱：交联聚苯乙烯离子交换树脂 凝胶柱色谱： 琼脂糖、交联葡聚糖 亲和柱色谱：载体（琼脂糖、交联葡聚糖、聚丙烯酰胺、硅

4、胶等） 表面键合配基 干柱色谱：填充剂按干法装在柱中,欲分离的混合物吸着在干柱的顶端,用溶剂洗 脱,待溶剂达到柱底为止.以荧光定性或以化合物在薄层上的Rf值推定 位置,根据各个成分的位置进行分割,各段以有机溶剂提取. 优点：薄层色谱条件可直接套用到干柱色谱 分离效果比湿装柱高 样品带可切割，避免各成分交叉 溶剂消耗少，操作简单缺点：装填技术要求高 柱样品容量较小 方法建立： 分离类型选择 色谱柱选择 ： 材料 （玻璃、聚乙烯薄膜柱等） 尺寸 （内径：柱长=1：101：20） 填充剂选择： 粒度（200400目） 用量（1：201：500） 预处理 洗脱剂选择： 薄层色谱筛选 上样方式： 净试样

5、法、溶液法、涂覆法 后处理： 旋转蒸发、重结晶等 低压及中压制备色谱提高压力，增大流速低压（ 几个大气压）中压 （几十个大气压） 低压制备色谱减压柱色谱加压柱色谱 双链球 空气泵 蠕动泵 中压制备色谱高压制备色谱 检测器： 示差折光、 紫外 （分流器）特点： 1 柱长： 2050CM 2 内径：1100CM 3 颗粒小，流速高 特殊形式色谱柱优点：样品处理量大流动相流速高节省分析时间生物样品： 蛋白质、多肽、核酸 色 谱 饼 大 直 径 柱 径向压缩 轴向压缩 环型压缩用于石油化工、食品工业、药物工业等NovasepWatersd 10cm 轴向压缩技术 尺寸：41.6 填料：4000kg重量

6、： 36 000kg 径 向 柱特点： 外表面大，样品上样量多； 增加色谱柱长度，可成线性增大制备量； 样品保留时间短，可保留活性应用： 生物活性样品制备（离子交换和亲和色谱）柱色谱中分离、实验条件选择峰接触法峰重叠法微量组分的分离 难分离物质对的分离 正相色谱系统反相色谱系统三、其它制备色谱技术Simulated Moving Bed Chromatography (SMB)Preparative Gas Chromatography Preparative Electrophoresis HSCCC 原理及应用DrIto，1966： 运动螺旋管内两液相对流分配的现象。操作过程： 一根100

7、多米长的螺旋空管，注入互不相溶的两相溶剂中的一相作为固定相，然后用进样器进样；最后用恒流泵不断注入另一相（流动相），同时启动主机部分运转。由于行星运动产生的离心力场使得固定相保留在螺旋管内，流动相则不断穿透固定相；这样两相溶剂在螺旋管中实现高效的接触、混合、分配和传递。由于样品中各组分在两相中的分配比不同，因而能使样品中各组分得到分离。 北京新技术研究所张天佑：1980年，第一台逆流色谱仪器 HSCCC 原理示意图1.聚四氟乙烯管中的固定相不需要载体，因而消除了常规色谱中由于使用载体而 带来的吸附现象，特别适用于分离极性物质和具有生物活性的物质 。2. 由于其与一般色谱的分离方式不同，使其特别

8、适用于制备性分离。 最近的研究结果表明：一台普通的高速逆流色谱仪一次进样可达几十毫升， 一次可分离近10g的样品。 应用 中草药及天然产物有效成分的分离纯化：目前香豆素， 内酯类，黄 酮，类黄酮，生物碱 类，蒽醌，木质素，多酚类，苷类，萜类，有机 酸、酸酐及酯类等领域都实现了高纯度 的制备分离，纯度等达到99 以上 。 大分子生物活性物质的分离：蛋白质、多糖、多肽等生物大分子的分离 。 发酵产物纯化领域：福建微生物研究所成功的分离纯化环孢菌素，得到纯 度98.5%以上的 环抱菌素A,B,C,D单组分,收率达 8 5 %以上 。 SMB 原理及应用不能连续操作柱材料利用率底溶剂耗量大连续进样、连

9、续出料提高生产能力，降低生产成本20世纪60年代UOP， 应用于石油化学工业生产能力 提高60倍溶剂耗量 减少80倍 移动床色谱示意图分离材料磨损 大型 模拟移动床色谱示意图 刚进样 初步分离 稳定状态法国Separex (Novasep)公司LicoSep 6-800系统 鞍山科技大学林炳昌 教授研制的 模拟移动床色谱仪器应用 1 石油化工 领域： 对二甲苯与间二甲苯分离；对甲苯酚与间甲苯 酚；蒎烯混合物中分离蒎烯。 2 糖醇分离： 万吨果糖生产设备（蔗糖水解产物果糖与葡萄糖分离） 3 手性分离： 氨基酸、布洛芬、troger碱等的分离。 制备气相色谱技术 氮 气 填充柱预热 制 备 电 泳

10、 技 术电泳： 带电离子在电场的作用下，向着与其电性相反的电极方向移动，这种现象称之为电泳。聚丙烯酰胺凝胶： 是由单体丙烯酰胺(Acr)和交联剂N,N-亚甲基双丙烯酰胺(Bis)在催化剂过硫酸铵(AP)和加速剂N,N,N,N-四甲基乙二胺(TEMED)作用下聚合交联而成的三维网状结构的凝胶，通过改变凝胶浓度及交联度来调节凝胶的孔径，具有良好的分子筛效应。它已成为目前生化实验室最常用的支持介质。以它为支持物发展起来的各种聚丙烯酰胺凝胶电泳技术，不仅能分离、小量制备生物大分子，而且可以用来研究生物大分子的性质如电荷、相对分子质量、等电点以及构象等。制备凝胶-上样-电泳-活性染色-脱色-制干胶 Pharmacia公司的SE250小型夹心式垂直板电泳装置LDH4LDH3LDH5LDH1LDH2 1 2 3 4心肌乳酸脱氢同工酶(LDH)的电泳分离 四、展望 新的高性能色谱分离材料设备性能、工艺优化理论模型的深入研究低成本、环保、实用周同惠等。纸色谱和博层色谱。北京