免疫组织化学及其在病理诊断中的应用课件

1、免疫组织化学及其在临床病理中的应用第一部分免疫组织化学技术及其原理一、概 述免疫组织化学（Immunohistochemistry, IHC）： 利用抗原抗体特异性结合的特点，通过化学反应，使标记于抗体上的显色剂（酶、金属离子、荧光素）显示出一种颜色，借助电子、荧光或普通显微镜观察其颜色变化，从而在抗原结合部位确定组织细胞某种成分的方法。分 类 根据实验中标记物的种类和检测方法不同，免疫标记技术分为： 免疫荧光技术 放射免疫技术 免疫酶标技术 免疫电镜技术 免疫胶体金技术 亲和免疫技术 免疫铁蛋白技术发展过程1941年：建立免疫荧光技术；20世纪50年代末开始推广使用；1956年：建立了放射免

2、疫检测；1966年：发现酶可作为底物，并于20世纪70年代初建立酶标免疫技术，之后发展迅速；1976年：亲和组织化学（affinity histochemistry）。免疫组化的优点特异性强：抗原和抗体呈现一对一特异 结合。交叉抗原交叉反应敏感性高：更敏感方法的出现，如SP法 等，临床应用更方便定位准确：形态与功能相结合，便于深 入研究设备少，操作简单、易行免疫组化室常用小设备冰箱(4 、-18 )；贮存免疫组化试剂用。高压锅，电炉(1000-1500W)或微波炉(700-800瓦)(抗原修复用，可任选一种)，1000ml烧杯；孵育盒、塑料耐高温切片架；冲洗瓶、定时器、塑料试管、5-10ml玻

3、璃试管等；100l 、200 l 、20 l 可调微量移液器各1支；相应的吸嘴。磨砂玻片；空调1台；恒温箱1台；pH计1台(PHS-25型)。免疫组化室常用设备全自动免疫组化染色机二、免疫酶标技术20世纪70年代建立80年代为发展高峰90年代在国、内外病理科广泛应用1.免疫酶标技术原理：将抗原和抗体反应与酶的催化反应相结合而建立的一种免疫检测技术。先用结合剂（戊二醛）将酶结合在抗体分子的氨基或羟基上而形成酶标记抗体。然后和相应抗原反应，使抗原抗体复合物上带有酶分子，再借酶对底物的特异催化作用，生成有色的不溶性产物或有一定电子密度的颗粒，在光镜或电镜下进行细胞表面及细胞内各种抗原成分的定位。 2

4、.标记酶的要求 凡对抗体无毒性又具有高催化效率的酶，理论上均可标记抗体。1）酶催化的底物必须是特异的，且容易被显示，可在光镜和电镜下观察。2）所形成的终产物沉淀必须稳定，不向周围弥散。3）中性PH值时酶应稳定，酶标记后活性不改变。4）被检组织内最好不存在与标记酶相同的内源酶。5）酶的相应底物易于制备和保存，价格低廉，酶分子量不能太大，有商品出售。3、免疫酶技术中常用的标记酶 辣根过氧化物酶（horseradish peroxidase，HRP）最常有 碱性磷酸酶（alkaline phosphatase，ALP）常用方法酶桥法：相当于间接法，将酶标于二抗 （抗酶抗体）上。桥二抗PAP法：HRP

5、抗HRP复合物，双PAP法等。三、亲和免疫细胞化学技术出现于70年代。使免疫细胞化学敏感性进一步提高。特点：以一种物质对某种组织成分具有高度亲 和力为基础，本质上不是抗原抗体反 应。 1976年Bayer将其称之为亲和组织 化学（affinity histochemistry）。抗原抗体反应本质上属于亲和组织化学包括：抗原与抗体； 植物凝集素与糖类； 生物素与抗生物素； 葡萄球菌A蛋白与IgG等1.基本原理维生素H（biotin，生物素）缺乏症：给动物喂养大量卵蛋白，会导致动物出现维生素H缺乏症，即蛋白质伤害。卵蛋白（avidin）与生物素有极高的亲和力，且具有与其它示踪物质（荧光素、铁蛋白、

6、过氧化酶等）相结合的能力。其亲和力较抗原抗体高出100万倍。细胞免疫+亲和组织化学亲和免疫细胞化学2.常用方法ABC：抗生物素卵白素过氧化酶复合 物技术（avidin biotin-peroxidase complex technique, ABC） SABC：链霉亲和素生物素酶复合 物（strept avidin-biotin complex，SABC）Envision：多聚鳌合物标记的二抗S-P：链霉卵蛋白过氧化物酶 （StreptavidinPeroxidase，SP）四、免疫组化常用方法1、直接法将酶直接标记在一抗 2、间接法将酶标记在二抗，常用 3、PAP法、ABC法复合物4、SP法

7、 5、多重免疫组化染色法 1、直接法（酶标记） 将酶（以HRP为例）标记在特异抗体上，然后用酶标抗体直接与相应抗原特异结合。形成抗原抗体酶复合物，最后用底物显色剂显色。 2、间接法 将酶标记在第二抗体上，先将一抗（特异性抗体）与相应的抗原结合，形成抗原抗体复合物，再用二抗（酶标记抗体）与复合物中的特异抗体结合，形成抗原抗体酶标抗体复合物，最后用底物显色剂显色。 直接法间接法二抗一抗抗原酶3、PAP法 用第二抗体作“桥梁”，既与第一抗体结合，又与PAP复合物联结，最后用底物显色剂显色。 4、ABC法：卵白素生物素过氧化物酶连结法（avidin biotin-peroxidase complex

8、technique, ABC） 利用卵白素（avidin）与生物素（Biotin）特有的高度亲和力这一生物学性质，先将生物素与辣根过氧化物酶（HRP）结合，形成生物素化HRP，然后与卵白素按一定比例混合，形成ABC复合物。 用生物素二抗与第一抗体结合，再与ABC复合物联结形成抗原抗体生物素二抗ABC。最后用底物显色剂显色。 5、SP法（链霉菌抗生物素卵蛋白过氧化物酶连结法, Streptavidin-Peroxidase, SP ） 国外其他公司亦将此法注册为LSAB法，LABSA法和SABC法等 用链霉菌抗生物素蛋白代替ABC复合物中的卵白素蛋白即形成SP法。染色原理同ABC法。 SP放大系

9、统比传统的PAP、ABC方法更为简便、敏感、特异、低背景。6.多重免疫组化方法原理：根据各个染色系统显色剂的不同加以组合。应用：目前主要为双重染色，用于临床诊断或科研。 乳腺癌ki-67和EMA双标记五、免疫组化基本过程及注意事项：实验设计抗原、抗体的制备商品化抗体的标记商品化组织材料的处理（标本取材与贮存及固定、组织脱水、浸蜡、包埋等）缓冲液及有关试剂的配制抗体的稀释内源性过氧化物酶的阻断非特异性染色的消除 实验对照及结果的观察分析等。1.切片脱蜡至水。2.0.3%H2O2甲醇处理切片10-20分钟。3.水洗。4.抗原修复。5.PBS洗3次，1分钟/次。6.加入血清孵育10分钟。7.摔去血清

10、，加入一抗孵育30-60分钟。8.PBS洗3次，每次2分钟。9.加入二抗，孵育20分钟。基本过程（SP法）10.PBS洗3次，每次2分钟。11.加入SP复合物孵育20-30分钟。12.PBS洗3次，每次2分钟。13.DAB-H2O2孵育5-10分钟。14.PBS洗，水洗。15.苏木素染核5-10分钟。16.水洗，分化 ，蓝化，脱水，透明并封固 （一）标本的取材和固定 原则：取材新鲜、及时固定、形态的完好、 抗原性不丢失。1）取材：新鲜组织及时取材，部位合适， 工具锋利，大小薄厚合适2）固定：及时固定，选用合适固定液 新鲜组织及时放入液氮或低温冰箱 1.甲醛固定液固定原理：使蛋白质发生交联而起固

11、定作用，缺点：会影响细胞膜的通透性，有时会使大分子 抗原丧失其活性。处理：1）在染色前必须经蛋白酶消化，以打开抗 原决定簇，使阳性率及阳性强度有明显 提高，但消化可能对某些抗原的显示起 破坏作用。 2）固定时间不超过24h小时为宜。 （二）常用固定液 常用的甲醛固定液10%福尔马林（配制法为取40%甲醛液10ml加蒸馏水90ml）10%中性缓冲福尔马林（40%甲醛10ml加 0.01mol/l PH7.4 PBS90ml）：应用最广 泛，其特点为组织穿透好，收缩性少 2.丙酮及醇类（乙醇、甲醇）固定剂固定原理：通过对蛋白质的沉淀而发生固定 作用。缺点：常使组织发生变形，优点：能使酶和其他蛋白的

12、反应基团在很大 程度上保持原有状态。对组织抗原 性影响很小。尤其是对组织结构抗 原、酶和微生物抗原的固定效果较好， 但对低分子蛋白质、多肽及胞浆内蛋白 质的保存效果较差。影响固定的因素温度：一般温度为7037之间，其中以 室温（22）为常用。浓度：10%中性福尔马林（4%甲醛）浓度最合适， 乙醇最常用95%。100%反而固定能力较差。 丙酮一般原浓度。 复合固定液的浓度都较单独用低。时间：固定时间要视组织块的大小，固定液的 种类及浓度、固定所处的温度等而定。 原则上，组织块大小与固定时间成正 比。（三）玻片的处理 目的：防止掉片 原因：许多抗体需要进行抗原修复（微 波或高压）。 现有试剂：防脱

13、片白胶（Elmers Glue） 多聚赖氨酸（poly-l-lysin） 防脱片剂（Apes）等， 后两者的效果比前者好。 （四）抗原修复 甲醛固定组织其抗原敏感性明显降低。原因：固定过程中形成醛键封闭部分抗原决定簇保存过程中形成羧甲基封闭抗原决定簇固定时，蛋白与蛋白间发生交联封闭抗原决定簇。修复方法化学方法（酶消化法）： 胰蛋白酶（trypsin） 胃蛋白酶（pepsin） 链霉蛋白酶（ponase）物理/化学方法在柠檬酸盐缓冲液中 单纯加热法 高压加热法 微波方法抗原修复机制 尚不清楚，可能因素为化学效应：化学分子或离子与抗原决定簇结合增加细胞通透性，使抗原抗体最大限度结合热效应：高温情况

14、下使封闭的抗原决定簇重新暴露和修复微波直接作用：高频电磁波打开蛋白间交联键，使抗原决定簇中的化学键修复（五）抗体的稀释如需要出现肉眼可见的反应，则抗原与抗体的量需保持一定比例。在抗原或抗体过量的条件下，不能聚合成大颗粒，因此不能出现肉眼可见的反应。 1.非免疫血清阴滞组织内反应部位针对原因：蛋白吸附于高电荷的胶原和 结缔组织上1）无关动物（除制备第一抗体以外的其它 动物）正常血清（1：20）孵育20分钟。 2）第二抗体同种动物的正常血清 （六）非特异性染色的消除2.内源性过氧化物酶的消除原因：由于切片内可能原有过氧物酶或类过 氧化物酶存在，当用免疫酶法显色 时，这种内源性酶的活性同时显示出 来

15、，造成对抗体上酶标记混淆（假阳 性）。方法：甲醇0.3%H2O2孵育1520min：抑 制类过氧化物酶 0.1NaN30.3%H2O2 孵育15 20min：抑制内源酶的活性。 3. 改善组织的透过性原因：当待检抗原是存在细胞内或有膜 被、而抗体是大分子的时候，抗体 就很难通过细胞的质膜顺利达到接 触抗原。 办法：用净化剂（即表面活性剂三硝基甲 苯）TritonX100溶解于PBS中，液 体浸洗组织切片或涂片。第二部分免疫组化在临床中的应用一、免疫组化临床应用的范围及意义（一）提高病理诊断准确性国际上病理诊断的质控标准：石蜡切片100 术中快速诊断98存在问题：A)对疾病本质认识不足； B)技

16、术水平低； C)低分化、未分化肿瘤缺乏特征性，存在 双向、多项分化，难以确定组织来源。目的：判断肿瘤组织来源，提高正确诊断率。（二）激素受体及生长因子与预后判断及治疗1.激素受体和生长因子的作用： 调节正常组织的功能 影响肿瘤的生物学功能：发生、发展、预后等。2.激素与肿瘤的关系： 乳腺癌、子宫内膜癌、卵巢癌：雌激素受体阳性者预后好，无瘤生存期长，对内分泌治疗反应好。3.生长因子：表皮生长因子受体（EGFR）阳性无瘤 生存期长。（三）瘤基因蛋白的临床应用瘤基因在细胞内的表现主要为扩增、突变、移位等；其活性的异常通过mRNA瘤蛋白水平增加表现出来；对肿瘤临床有意义的主要有： c-erbB：肿瘤恶

17、性度高阳性率 c-myc：核内瘤蛋白，高表达预示促进肿瘤生 长、发展 易出现浸润、转移 p53：通常检测的为突变型，高表达 预后差。（四）评价肿瘤细胞增生程度肿瘤细胞增生程度直接影响临床治疗与预后；传统方法：细胞异型性，异常核分裂象；免疫组化： Ki-67，PCNA阳性者恶性程度高预后不良， 以乳腺癌、淋巴瘤较为明显。 方法简便、可靠。Ki-67，乳腺癌，Ki-67阳性定位胞核，DAB显色，苏木素复染，福尔马林固定，石蜡包埋。SP X 200 （五）发现微小病灶淋巴结、骨髓中的早期转移病灶；发现活检原位早期病灶：如内窥鏡活检、细针穿刺活检等； （六）在肿瘤分期上的意义1. 帮助判断肿瘤是位于原

18、位/浸润/血管/淋 巴管侵袭；2. 检测层粘连蛋白（laminin）和型胶 原：判断基底膜浸润破坏情况；3. 因子相关蛋白，CD31，CD34检测可 显示血管、淋巴管浸润、破坏情况。（七）指导肿瘤治疗肿瘤多药耐药基因检测：二氢叶酸还原酶、P-糖蛋白肿瘤抗药抗CD20抗体阳性美乐华抗c-erbB-2抗体阳性乐塞啶（八）免疫性疾病的辅助诊断检测组织细胞内免疫球蛋白、补体、 抗体等。（九）病原微生物的检测对病原微生物的抗原抗体进行定量定位。如：SV40的大T抗原， HPV的E6、E7抗原， EBV的膜抗原、核心抗原， TB杆菌BCG抗原等。尖锐湿疣 HPV二、免疫组化在诊断中的应用原则1. 必须设置

19、严格对照：规范操作，防止污染，避免假阳性与假阴性；2. 抗原表达必须在特定部位，否则就应视为阴性结果，如ER、PR、P53为核内表达，LCA、CD20、CD45RO等为膜表达，CK、EMA等为胞浆表达；3. 选用2种以上的同类抗体：因肿瘤抗原为相关抗原，特异性较差；4. 免疫组化结果的判定应以HE切片为基础；5. 正确评价免疫组化结果：结果受抗体质量、特异性，技术操作，标本固定等因素影响；6. 合理选择抗体：既要达到目的，又要节约的原则，分1、2、3线抗体；7. 待检标本抗原保存要好：要求快速、新鲜、充分的固定，合适的固定剂，普通福尔马林固定液应进行抗原修复。三、临床常用标记物（一）上皮性肿瘤

20、标记1.细胞角蛋白（cytokeratin, CK）： 上皮细胞骨架结构蛋白，共20余种； 分两类：低分子CK单层上皮表达 高分子CK 复层上皮表达 移行上皮和假复层上皮低 分子及高分子CK均表达； 癌组织中：腺癌多表达低分子CK 鳞癌多表达高分子CK腺上皮CK标记阳性低分化腺癌 CK标记阳性2.上皮膜抗原 （epithelial membrane antigen,EMA）1）EMA为上皮细胞分泌的一种乳脂小球 糖蛋白，广泛存在于各种上皮细胞中；2）常用的上皮源性肿瘤标记物，膜、胞浆 阳性；3）分布与CK相似，但对内脏腺上皮优于 CK；4）间变性大细胞淋巴瘤、横纹肌肉瘤等也 可阳性。EMA大网

21、膜上低分化癌 CEA标记阳性3. CEA (carcinoembryonic antigen)： 消化道癌相关抗原，在腺癌中表达；（二）选择性上皮肿瘤标志1.甲胎蛋白（Alpha fetoprotein, AFP）： 1） 一种酸性糖蛋白，由胚胎肝细胞、卵黄 囊细胞及胎儿肠道细胞合成； 2）细胞膜或细胞浆表达； 3）主要用于原发性肝细胞癌、性腺或性腺 外生殖细胞肿瘤（如内胚窦瘤）的诊断 和鉴别诊断。 AFP标记胞浆阳性2.前列腺特异性抗原（prostate specific antigen，PSA）：A. 糖蛋白，前列腺上皮细胞特有，存在于 正常、增生及肿瘤性前列腺细胞中；B. 前列腺及其肿瘤

22、的特异性标记，用于与 其他组织起源肿瘤进行鉴别诊断；C. 不能用于前列腺良、恶性肿瘤的鉴别。3.黑色素瘤（melanoma，HMB45）：A. 黑色素相关抗原，存在于正常人皮肤的 交界痣和蓝痣细胞中；B. 人体内非色素细胞及皮内痣、正常成人 黑色素细胞均为阴性；C. 黑色素瘤及伴有黑色素细胞分化的肿瘤 （有或无色素）特异性达100。HMB45阳性, 恶性黑色素瘤（三）间叶组织源性肿瘤标记1.波形蛋白（Vimentin，Vim）：A. 细胞中间丝蛋白抗体；B. 多种软组织肿瘤均可表达，但纤维细胞 较明显；C. 常作为间叶源性与上皮源性肿瘤的一线 鉴别抗体；Vimentin胞浆阳性2.肌源性标记1

23、）结蛋白（Desmin，Des）：平滑肌、横纹肌均可 表达；2）肌动蛋白（Actin/HHF35）：广泛分布于所有 肌型细胞；平滑肌、肌上皮细胞均阳性；在 低分化平滑肌肉瘤和横纹肌肉瘤中，敏感性和特 异性均高于Desmin。3）肌红蛋白（myosin）：分平滑肌型和横纹肌型两 种，横纹肌型特异性较强。4）肌球蛋白（myoglobin）：横纹肌标记物。5）平滑肌肌动蛋白（smooth muscle actin， SMA）：平滑肌标记物。组织中平滑肌Actin标记阳性高分化平滑肌肉瘤，瘤细胞及血管壁Actin阳性血管壁平滑肌Actin阳性（四）组织细胞标记物1）CD68：全组织细胞标记物；2）Ma

24、c387：单核组织细胞标记物。组织细胞CD68胞浆阳性Mac387, 组织细胞肉瘤（五）血管源性肿瘤标记1）CD31：血小板内皮细胞粘附因子；2）CD34：人骨髓干细胞抗原，血管内皮、 原始干细胞、胃肠道内外间质瘤阳性表 达。血管内皮细胞CD34阳性（六）神经胶质细胞标记胶质纤维酸性蛋白（glial fibrillary acidic protein，GFAP）：脑胶质细胞特异性抗体，定位于胶质细胞胞浆和突起以及胶质网。S100蛋白（S100 protein）：从牛脑中提取的一种高度酸性钙结合蛋白，胶质细胞、周围神经雪旺氏细胞、脂肪细胞、朗格罕细胞、肌上皮细胞、黑色素细胞及其肿瘤均可阳性。树突

25、状细胞 S-100阳性（七）神经元标记神经细丝蛋白（neurofiaments，NF）： 神经元特异性中间丝蛋白； 中枢、外周神经元及其肿瘤阳性标记；神经元特异性烯醇化酶（neuron specific enolase，NSE）：仅存在于神经元细胞和神 经内分泌细胞。嗜铬素A（chromogranin A，CgA）：仅存 在于神经元细胞和神经内分泌细胞。突触素（synaptophysin，Syn）：神经元突触 前小泡膜蛋白，广泛存在于神经、肌肉突触处。 胰岛CgA标记阳性胰岛Syn标记（八）淋巴造血细胞标记1.白细胞共同抗原（leukocyte common antigen, LCA）： 膜性

26、抗原，普遍存在于淋巴造血细胞，包括B、T淋巴细胞，组织细胞，中性白细胞，肥大细胞等。淋巴瘤LCA标记2. B淋巴细胞标记：1）CD20（L26）：B细胞标记；2）CD21：外套层和边缘带B细胞；3）CD79a：较成熟的B淋巴细胞及淋巴 瘤；4）轻链,（kappa, lambda）：淋巴瘤 单克隆性表达或，而反应性增生则 为多克隆性。B细胞淋巴瘤CD20膜阳性3. T淋巴细胞标记：1）CD3：标记T细胞及其肿瘤；2）CD45RO（UCHL-1），CD43：全T标 记；3）CD4：辅助T细胞；4）CD8：抑制T细胞。4.其它造血细胞标记：1）ALK（anaplastic lymphoma kina

27、se）： 间变性大细胞淋巴瘤特异性标记；2）CD56：NK细胞特异标记；3）CD30（Ki-1）：R-S细胞标记；4）CD15：造血细胞及R-S细胞标记；5）CyclinD1：套区细胞淋巴瘤标记。间变性大细胞性淋巴瘤ALK膜阳性何杰金淋巴瘤R-S细胞CD30阳性（九）与临床治疗有关的标记：1. Her-2（c-erbB-2或neu）：属于酪氨酸激酶家族中的生长因子受体erbB亚家族。阳性部位：膜/浆， 阳性在 + 须用FISH方法进一步检测。主要用于乳腺癌、卵巢癌、肺癌、胃癌、食管癌、宫颈癌、涎腺癌、膀胱癌等研究。研究表明，Her-2阳性者预后不良，可作为恶性肿瘤，尤其是乳腺癌的一个预后判断指

28、标。临床用药： Her-2+以上：乐塞啶， HerceptinHer-2（+）Her-2（+ +）Her-2（+ +）Her-2（+ + +）Her-2（+ + +）2.雌激素受体（ER ）、孕激素受体（PR） ：存在于正常子宫上皮、肌层细胞及正常乳腺的上皮细胞；研究表明，PR和ER阳性的乳癌大多数激素治疗有效，且缓解率高，复发率低，预后好；PR或ER一项阳性者，治疗效果及预后优于PR和ER全阴性者；为乳腺癌病人常规检查项目之一。ER （+）3. CD117：为c-kit原癌基因编码的跨膜酪氨酸激酶受体，称为细胞表面分化抗原（CD117）；临床病理主要用于间质瘤的诊断和鉴别诊断， CD117(

29、)，CD34()，Vimentin()， Actin()，Desmin()， S-100()；格列卫：干扰素治疗无效的CML； 不能手术切除和/或转移的恶 性间质瘤； 应用原则：CD117，阳性部位：胞浆 Ki67核抗原（ Ki67 nuclear antigen）： 可以识别除G0期以外处于其他细胞周期的细胞，用于判断细胞的增值活性，是确定良性和恶性组织生长状态的一种标记； Ki67直接反映细胞的增值情况，是某些恶性肿瘤的重要预后指标。（十）肿瘤细胞增殖活性：肿瘤细胞PCNA核阳性四、免疫组化在临床病理中的鉴别诊断作用1）小细胞性恶性肿瘤的鉴别诊断标记物淋巴瘤未分化癌尤文氏肉瘤神经母细胞瘤PNET横纹肌肉瘤LCACKVimentin大多数MyoglobinSMAS-100NSE部分大多数CGASYN2）淋巴瘤的诊断与鉴别诊断淋巴瘤WHO分类（1997）淋巴瘤非霍奇金淋巴瘤霍奇金淋巴瘤T细胞淋巴瘤B细胞淋巴瘤前驱T周围（成熟）T前驱B周围（成熟）BCD30+ CD15+基本组合：CD20和CD3或CD45ROCD20+CD20，CD3CD3+B细胞淋巴瘤可加入其它分型抗体标记物T细胞或NK细胞淋巴瘤可加入其他分型标记物非淋巴造血系统肿瘤浆细胞瘤淋巴母髓性白血病霍奇金淋巴瘤某些T淋巴瘤B细胞淋巴瘤的鉴别诊断CD20CD5CD10CD43CD2