工作报告之对流免疫电泳实验报告

1、对流免疫电泳实验报告【篇一：实验十一免疫电泳】免疫电泳技术抗原与抗体的结合在沉淀反应中，呈一定的分子比例。不同抗原和 抗体之间的分子比例是不同的，但只有在分子比例合适时，才出现 可见的沉淀。所以沉淀能否出现并不完全反映抗原和抗体是否存在 和发生结合。抗原结合多个抗体分子，称抗原为多价；抗体一般只 能结合两个抗原分子（igm类抗体分子通常可以结合5个抗原分子） 的抗原决定法簇，故为二价。只有在彼此的结合价饱和时，才出现 大量的抗原-抗体复合物沉淀。当抗原与抗体的比例合适时，即二者结合价彼此饱和，就可形成网 状结构的大分子抗原-抗体复合物沉淀，称为等价带。若比例不合适 时，抗体或抗原过量，则虽有抗

2、原、抗体的结合，但不能大量形成 网状结构的大分子复合物，沉淀量很少，甚至不出现沉淀。在抗原、 抗体数量关系曲线中，抗体过剩区域称为抗体过剩带，抗原过剩区 域称为抗原过剩带。如图1所示，在等价带的反应液中加入过量的 抗原或抗体，沉淀复合物就会有部分溶解，甚至全部溶解的现象。 这是由于新加入的抗原或抗体竞争地结合相应的抗体或抗原，使网 状大分子结构破坏，形成小分子复合物，致使沉淀出现溶解，沉淀 量减少甚至完全消失。在沉淀反应中，由于抗原过量而不出现沉淀 的现象，称为前带现象。此时不能误认为无沉淀就是无抗原存在， 为了检测就必须稀释抗原。抗体过量时，称为后带现象，同理需要 稀释抗体进行检测。图1的位

3、置抗原与抗体的结合是依赖于两者分子结构的互补性，故其特异性高。 这种结合也是相当稳定的。在一定条件下（过酸、过碱或浓盐存在 下），二者可以分开，即结合是可逆的。解离后的抗原、抗体的活 性一般保持不变。双向免疫扩散测定法原理双向扩散法（double diffusion）又称琼脂扩散法，是利用琼脂凝胶为 介质的一种沉淀反应。琼脂或琼脂糖凝胶是多孔的网状结构，大分 子物质可以自由通过，这种分子的扩散作用可使分别处于两处的抗原和相应的抗体通过扩散相遇，形成抗原-抗体复 合物，比例合适时出现沉淀。由于凝胶透明度高，可直接观察到复 合物的沉淀线（弧）。沉淀线（弧）的特征与位置取决于抗原相对 分子质量的大小

4、，分子结构、扩散系数和浓度等因素。当抗原、抗 体存在多种系统时，会出现多种沉淀线（弧）。依据沉淀线（弧） 可以定性抗原，诊断疾病。此法操作简单，灵敏度高，是最为常用的免疫学测定抗原和抗血清效价的方法。 操作方法（一）制备离子琼脂板用10ml量筒，量取4ml融化的巴比妥离子琼脂，倒在玻璃片上， 待琼脂凝固后，按图2所示的方法打孔。图2的位置打空后用注射器针头将孔内琼脂挑出，在酒精灯上烘烤背面，使琼 脂与玻璃板贴紧。（二）稀释抗原和抗体 采用2倍连续稀释法。将抗原与抗体按2的等比级数即20、21、22、23?方式连续稀释。方法是取试管数支，各加入稀释液（生理盐水）一份，在于第一管中加入抗原或抗体一

5、份，用吹吸法混匀后，吸出，目一份加入第二管中，如此依次稀释到最后一管。其稀释倍数依次是：2,4, 8?。（三）加样将稀释好的抗原或抗体依次加入外周孔中，中心孔加入相应的抗体 或抗原，加入的量以平琼脂表面为度或用微量进样器定量加入。加 样后置大培养皿内（皿内放有湿滤纸或湿纱布以维持湿度）。盖好 皿盖，于2437C温箱内保温2448小时。扩散后可出现清晰的 沉淀线，以出现沉淀线的抗体稀释倍数最高的一孔为被测抗体的效 价。（四）染色及保存经染色后可提高沉淀线的可见度。漂洗琼脂板：将琼脂板置生理盐水中浸泡两天，每天更换生理盐 水2次以洗去未结合的抗原或抗体。生理盐水浸泡后，更换蒸馏水 浸泡1天，换水2

6、次以除去盐分。琼脂板较脆易破，操作需小心。干燥：取出琼脂板，覆盖滤纸片，于室温自然干燥或吹干、烘干。染色：将琼脂板置于染色剂（0.05%氨基黑10b）中浸泡，约5 分钟（*注意观察染色深度），再加5%的乙酸浸泡以脱去背景颜色为度。脱色后滴加少量5%的甘油至琼脂板上，置室温干燥保存。如 欲取下琼脂薄膜，则需在干燥前浸泡在10%的甘油中（或在染色剂、 脱色剂中加10%甘油），烘干后轻轻去下薄膜。本实验用琼脂糖效果最好，琼脂粉次之，琼脂所含杂质较多时，制 出的琼脂凝胶板透明度较差，影响沉淀线的观测、且重复性差，必 须做净化处理后方可使用。琼脂凝胶和玻璃片结合不紧密，样品可从样品孔下泄漏；在观察、 漂

7、洗时凝胶易于脱落。为防止上述现象，可将玻璃板进行处理，方法是用01%02%琼脂均匀 涂布在玻璃板上，自然干燥后再进行双向扩散实验。在抗原、抗体单一体系中，抗原浓度不同，沉淀线特征不同。如图3所示图3的位置抗原与抗体之间相对浓度不同，出现的沉淀线特征亦不同，如图4 所示在抗原、抗体多种体系中，抗原与相应抗体出现的沉淀线有多条， 彼此互部干扰，如图5所示图4图5试剂和器材1. 1.5%离子琼脂（1）琼脂的净化：高度净化的琼脂，买来即可使用，如果不纯则 需要净化处理。取30克优质琼脂加970ml h2o，加热至琼脂全部融化，即成3%的 琼脂。用三、四层纱布热过滤，滤液流入一个搪瓷盘内，凝固后，切成1

8、cm 见方的小块，放在大容器中，将自来水同到容器底部，流水冲洗3 天。冲洗时于容器上捆好一层纱布，以防琼脂块顺水冲走。然后用 蒸馏水浸泡23天，每天换水23次。琼脂块净化后即浸没于蒸馏 水中，加万分之一的硫柳汞防腐，置冰箱中保持待用。（2）巴比妥离子琼脂的制备：离子强度0.06, ph8.6缓冲液：称 取10.3g巴比妥取净化的3%的琼脂块，加热融化后加入等体积的离子强度0.06， ph8.6的巴比妥缓冲液，加热混匀，即成为离子强度0.03, ph8.6, 1.5%巴比妥离子琼脂。在制备离子琼脂时，可在琼脂中加入万分之一的硫柳汞防 腐。琼脂中的缓冲液，其离子强度最好比电极槽中的低1/2,这样可

9、以避 免在电泳时因电流过大引起琼脂变形（凸凹不平）。2.3.4.器材1.2.3.4.5.6.微量免疫电泳原理免疫电泳法（immunoelectrophoresis）是把蛋白质电泳分离技术（琼脂电泳）和免疫学检测方法（双向扩散）结合起来的检测方法。它提高了分辨率和灵敏度，是很理想的分离和鉴定蛋白质混合物的 方法。微量免疫电泳所用的样品和抗血清较少，而且测定时间短， 灵敏度高，因此应用比较广泛。在倒有离子琼脂的饿玻璃片的中心挖一长槽，槽的两侧个挖一个 孔，孔内加入待测样品，如图6a所示。电泳时，样品中各蛋白质的等电点不同，其带电性质各异，因而 被分离成几个区带（如图6b所示）。电泳后在中央槽中加入

10、相应抗 血清，置37C扩散。被分离的蛋白质与相应抗体形成大小不同、深浅 各异的沉淀弧（如图6c、d所示）。一般情况下，每一沉淀弧即代表 蛋白质混合液中的一种成分，以此定性或半定量。图6操作方法（一）制备离子琼脂板将前述实验的离子琼脂加热融化，取4ml倒在玻璃板上，凝固后 按图7所示打孔和打槽，用注射器针头将孔内琼脂挑出。槽内琼脂 在电泳分离以后在挑出，以免电泳时横槽变形影响双向扩散。图7（二）电泳 于两个电泳槽中防入离子强度为0.06, ph8.6的巴比妥缓冲液。将 琼脂板平置于两个电极槽之间，为使电路连通，于缓冲液的液面到 琼脂板之间，用单层滤纸或纱布搭桥形成通路，接通电源加10v电 压，用

11、小滴管取样品注入琼脂板孔内，假样量与孔平或稍少，调电 压至100150v，通电4060分钟，当血清中色素泳动到距边缘约 1.5cm时，断电，取出琼脂板，用注射器针头将横槽中的琼脂挑出， 加抗血清，水平置于湿盒（或培养皿中），于37或24进行双向扩 散24-48小时后，取出观察实验结果。（三）染色 参看双向免疫扩散法实验。在免疫电泳实验中的琼脂电泳分离法，可用其他蛋白电泳技术代 替， 如聚丙烯酰胺凝胶电泳、等电点聚焦电泳法等。电泳后切下相应的 胶带置于玻璃板上，倒上离子琼脂。当凝胶与胶带紧密帖在一起并凝固后，在距胶带约0.5cm处打横槽， 挑出琼脂，加抗血清进行双向扩散。由于不同电泳方法对蛋白质

12、抗 原的浓度要求不同，要根据抗原、抗体沉淀反应的合适比例稀释抗 血清。沉淀弧的曲度大，说明该种蛋白质的含量较高，电泳时扩散也较为 严重之故。曲度对称说明蛋白质分子均一，不对称似直线或直线上 有小弧，说明蛋白质分子不均一。凹 1=电泳时一般稳压在100150v范围，电流可用凝胶板两侧滤纸桥 的层数加以调节，一般一层滤纸即可，电流过大致使凝胶发热，水 分蒸发快，影响电泳效果。凝胶中缓冲液浓度为电极缓冲液的一半， 这样可减少电流的作用，也可增加蛋白质的泳动速度。要根据样品鉴定的不同要求，选择抗血清。检测蛋白质混合液（如血清或组织粗提液）中所需成分的存在及多 寡，需用纯样品制备的抗血清和用混合液制备的

13、抗血清对照检测， 如图8。【篇二：免疫实验考试复习】实验复习题一、选择题：夹心elisa法检测hbsag时，用于包被固相载体的物质是：ca.纯化的hbsag b.酶标记的hbsag c.纯化的hbsabd.酶标记的hbsabe.辣根过氧化物酶间接elisa法检测hbsab时，用于包被固相载体的物质是：aa.纯化的hbsag b.酶标记的hbsag c.纯化的hbsabd.酶标记的hbsabe.辣根过氧化物酶血型鉴定实验时，待检红细胞悬液与抗a抗体混合发生凝集，与抗b抗体混合未发生凝集，则待检血的血型是：aa. a型b. b型c. ab型年d. o型e.不能确定血型鉴定实验时，待检红细胞悬液与抗

14、a抗体混合不发生凝集， 与抗b抗体混合发生凝集，则待检血的血型是：ba. a型b. b型c. ab型年d. o型e.不能确定不属于人工主动免疫制剂的是(c )a乙肝疫苗b.白喉类毒素c.破伤风抗毒素d,百日咳疫苗e,脊髓灰质 炎疫苗不属于人工被动免疫制剂的是(e)a,破伤风抗毒素b血浆免疫球蛋白c,胎盘免疫球蛋白d静脉注射用免疫球蛋白e白喉类毒素二、填空：对流免疫电泳实验，电泳时抗原端接阴极，抗体端接阳极。三、名词解释沉淀反应(precipitation reaction)毒素、组织浸液及血清中的蛋白等可溶性抗原与相应抗体反应后， 出现肉眼可见的沉淀物。凝集反应(agglutination r

15、eaction)细菌、细胞等颗粒性抗原或表面包被抗原的颗粒状物质与相应的抗体在电解质存在的条件下结合，出现肉眼可见的凝集团现象。免疫标记技术(immunolabeling techniques)是将抗原抗体反应与标记技术相结合，以检测抗原或抗体的一类试 验方法。人工主动免疫(artificial active immunization)用疫苗接种机体，使之产生特异性免疫，从而预防干扰的措施。人工被动免疫(artificial passive immunization)是给人体注射含特异性抗体的免疫血清或细胞因子等制剂，以治疗 或紧急预防感染的 措施。四、问答题简述e-花环试验的基本原理。人T细

16、胞膜上具有能与绵羊红细胞(srbc)上 lfa-3 (淋巴细胞功能相 关抗原一3)结合的受体(E受体，即cd2分子)。srbc与T细胞 在含有血清的平衡盐水中结合，形成以T细胞为中心，四周环绕 srbc，状如环瑰花环细胞集团，故称E花环试验。简述cdc试验的基本原理。细胞表面抗原与相应抗体特异结合所形成的免疫复合物，通过经典 途径激活补体而导致细胞膜穿孔。因此水溶性染料如台盼蓝进入受 损细胞，染成蓝色，为阳性反应；不带相应抗原的细胞。未受伤， 不染色，为阴性反应。3.简述elisa的基本原理。先将已知抗体包被在固相上，洗去未吸附的抗体；加入待检标本， 充分作用后，标本中相应的抗原与固相上已知抗

17、体结合，洗去未结 合的抗原成分；加入已知的酶标抗体，再洗去未结合的酶标抗体； 加底物后，酶分解底物后产生呈色反应。【篇三：常见免疫学试验技术】免疫学实验实验一与免疫相关的细胞形态的观察目的要求：观察与免疫相关的几种细胞的形态，了解它们在机体免疫反应中的作用。实验器材：显微镜血液涂片(瑞氏染色)结缔组织切片方法：油镜观察血涂片的观察红细胞：淡红色，无核的圆形细胞，因红血球为双凹形，故 边缘部分染色较深，中心较浅，直径78微米。颗粒白血球嗜中性颗粒白血球：体积略大于红细胞，细胞核被染成紫色分叶状， 可分15叶，核叶之间联以染色质细丝，染色质染成粉色，其中充 满细小的大小均匀的颗粒被染成紫红色。直径

18、1012微米。嗜酸性颗粒白血球：略大于嗜中白血球，细胞核染成紫色，通常为2叶，胞质充满嗜酸性大圆颗粒，被染成鲜红色。直径1015微米。 嗜碱性颗粒白血球：体积略小于嗜酸性白血球，细胞质中有大小不 等被染成紫色颗粒，颗粒数目较嗜酸性白血球的颗粒少，核为12 叶染成淡兰色。直径1011微米。1（c）无颗粒白血球淋巴细胞：涂片中可观察到中、小型两种。小淋巴细胞与红血球大 小相似，圆形。其中含致密的核，染成深紫色。周围仅有一薄层嗜 硷性染成淡蓝的细胞质。中淋巴细胞较大，有较宽层的细胞，核 形。6-8微米。单核细胞：体积最大，细胞圆形。胞质染成灰蓝色。核呈肾形或马 蹄形，染色略浅于淋巴细胞的核。直径14

19、-20微米。肥大细胞的观察（示教）胞体较大，呈卵圆形，胞质内充满粗大均等的嗜硷性颗粒。其中含 肝素、组织胺等物质。常成群地分布于血管的周围。浆细胞的观察（示教）细胞呈圆形或卵圆形，胞质丰富，呈嗜硷性。核圆形，着色深，多 偏于细胞的一侧，染色质核膜呈车轮分布。正常组织浆细胞少， 性炎症时增多。浆细胞合成和分泌抗体，对免疫有重要意义。巨噬细胞：又称组织细胞，细胞形态不规则。常伸出短而钝突 起，有很强的吞噬能力。附：瑞特氏染色：.染色液配置称取瑞特氏染料0.1克溶于60ml甲醇中，过滤。贮褐色瓶中备用。（配置时，要先将瑞特氏染料置研钵体内边研边滴加甲醇，使染料溶液得更好。）.瑞特氏染色法：取小鼠骨动

20、脉血，涂制玻片。干后用玻璃笔在涂处之两侧划线（限 制染液流掉）。于划线内部滴加染液3-4滴，经3-5分钟后，再滴加等量的蒸馏水，轻轻晃动混合。经5分钟后，用蒸馏水洗净，待干 后用油镜检查。2实验二沉淀反应可溶性抗原与相应的抗体混合，在电解质存在的条件下，两者比例 适合，即可有沉淀物出现，叫沉淀反应（precipitation）,由于沉淀 反应抗原多系胶体溶液。沉淀物主要是由抗体蛋白所组成。为了求得抗原与抗体的适宜比例，保证有足够的抗体，而且抗原分 子小，具有较大的反应面积，因此操作上通常是稀释抗原，不稀释 抗体。沉淀反应的种类有环状沉淀、絮状沉淀、荚膜膨胀、琼脂扩散及免 疫电泳等。此外还有放射

21、性同位素标记、酶标记等测定法。（一）环状沉淀反应当抗原与相应抗体形成一个接触面时，如二者比例适当，接触面上 可形成一个乳白色的环状物即为阳性沉淀反应。材料：1.2.免疫血清：免疫兔抗人血清抗原：人血清小沉淀管、毛细吸管、 橡皮头、生理盐水。方法：取小沉淀管2只，以毛细吸管吸取抗人血清约02毫升，加入第 一管，加时注意不能有气泡。2.以毛细吸管吸取生理盐水0.2毫升加入第二管。用毛细吸管吸入 血稀释0.2毫升加入各管，加时应注意使抗原溶液缓缓由管壁流下， 轻浮于血清面上，使成一明显界面，切勿使之相混。4.性。置室温中10-20分钟，观察液面有无乳白色沉淀环，若有则 为阳3（二）.琼脂扩散试验琼脂扩散是抗原抗体在凝胶中所呈现的一种沉淀反应。抗体在含有电解质的琼脂凝胶中相遇时，便出现可见的白色沉淀线。 这种沉淀线是一组抗原抗体的特异性复合物。如果凝胶中有多种不 同抗原抗体存在时，便依各自扩散速度的差异，在适当部位形成独立的沉淀线，因此广泛地用于抗原成分的分析。琼脂扩散试验可根 据抗原抗体反