制备色谱分离技术及实际应用

1、制备色谱分离技术及实际应用Contents 凝胶色谱分离技术及其应用1 高速逆流色谱分离技术2 制备薄层色谱分离技术3 制备柱色谱分离技术4概述 亲和色谱分离技术5色谱（Chromatography)“色谱”这一术语是根据“Chromatography”一词翻译而来的 。它是由俄国植物学家茨维特（Tsweet）于1903年首创的，是由一个实验而得名。后来扩展到纸色谱、薄层色谱、电泳、逆流色谱等不同形式的色谱。色谱（Chromatography)色谱法是一种物理化学分析方法。根据所用样品混合物中各组分物理、化学性质的差异，各组分在互不混溶的两相之间分配、吸附、分子亲和力等行为存在差异，当两相相对

2、运动时，各组分在两相中反复多次重新分配，结果使混合物得到分离。色谱法是一种从混合物中分离组分的方法。色谱法能分离物理化学性质差异很小的用其他方法很难分离的化合物。填充剂由碳酸钙发展到硅胶、离子交换树脂、凝胶等，流动相也出现了气相、超临界流体流动相。分离的规模也从实验室毫克到了以吨计的工业规模。色谱技术在中药中的应用已经日趋重要，其中尤以大孔吸附树脂、离子交换色谱、硅胶色谱等的应用最为广泛。在人参皂苷、绞股蓝皂苷、甜菊苷等多种中药的单方、复方、有效部位、有效成分等的生产中得到广泛应用，成为分离纯化的重要手段。第一节 概述一、制备色谱简介 利用各待分离组分在相间的吸附、分配系数的差异、离子交换平衡

3、值的区别等，使得各组分在相间滞留时间不同而进行分离，从而制得所需产品。大型制备色谱-吨计； 微型制备色谱-克、毫克二、色谱分离原理及特点利用各组分在互不混溶的两相之间分配、吸附、分子亲和力等行为的差异，并通过两相不断的相对移动而实现分离的方法的总称。互不混溶的两相分别是固定相（stationary phase，表面积很大或多孔性固体）和流动相（mobile phase，展开剂-液相或气相）。下图是分离机理过程的模型。图 6-2 与其他分离技术如萃取、蒸馏等相比，色谱法具有高超分离能力和效率，其特点主要如下：1. 分离效率高分析出较复杂的样品。 2灵敏度高可以检测出10-13g级的物质。3分析速

4、度快几分钟几十分钟。4应用范围广有机、无机、低分子或高分子等。色谱法的特点三、色谱的分类按流动相类型 气相色谱，液相色谱，超临界流体 按固定相的形状柱色谱，纸色谱，薄层色谱 按分离机制吸附色谱（固定相为固体），分配色谱（固定相为液体），凝胶渗透，离子交换色谱、亲和色谱、大孔吸附树脂法、聚焦色谱 按操作压力 低压（0.5MPa），中压（0.5-4.0MPa），高压（4.0-40MPa）液相色谱 按展开方式洗脱，前沿，置换按使用领域分析用色谱、制备用色谱、流程色谱 （2）液相色谱：液体为流动相的色谱称液相色谱（LC） 液固(LSC)、液液色谱(LLC)柱色谱、纸色谱、薄层色谱、排阻色谱、超临界色谱

5、及电色谱等形式。1、按流动相和固定相的状态分类（1）气相色谱：气体为流动相的色谱。根据固定相是固体吸附剂还是固定液，气固色谱（GSC）气液色谱（GLC）流动相和固定相的状态分类（3）超临界流体色谱2、按分离机理分类（1）吸附色谱法是利用组分在吸附剂（固定相）上的吸附能力强弱不同而得以分离的方法。组分与吸附剂之间的作用力主要为分子间力，与两者的极性有关 。（2）分配色谱法利用各个被分离组分在固定相和移动相两相之间分配系数的不同 而进行分离的过程。分配色谱主要根据物质在两相中的溶解度差异而实现。 固定相为涂渍有固定液（液体）的多孔惰性载体。 硅胶、硅藻土、聚合物、纤维素粉、滤纸 若采用极性较大的相

6、为固定相、极性较小的相为流动相，则称为正相色谱；相反，则称为反相色谱。实践中有70以上都采用反相色谱。色谱类型固定相极性度流动相极性范围冲洗剂极性或非极性的程度增加流动相极性的效果正相色谱极性弱至中等极性最后冲洗用极性更强的溶剂保留时间减少反相色谱非极性强至中等极性首先冲洗用极性更强的溶剂保留时间增加表6-2 正相和反相色谱中流动相极性的关系 2、按分离机理分类 是利用大小不同的分子在微孔固定相中的选择渗透而达到分离的方法。 又称尺寸排阻色谱法、空间排阻或分子筛色谱是利用组分与离子交换剂（固定相）结合力强弱的差异而达到分离的方法。被分离混合物中各组分的离子交换能力，将取决于各组分电荷的差异。

7、利用固相载体上的配基对目标组分所具有的专一的和可逆的亲和力而使生物分子分离纯化的方法，又称亲和层析和吸附解吸色谱 。专一而又可逆的亲和力的生物分子 称为生物对。酶一酶底物、抑制剂、辅酶或辅基；抗体一抗原、细胞一细胞表面特异蛋白、外源凝集素等。 （3）离子交换色谱法（4）凝胶色谱法 （5）亲和色谱法 （6）聚焦色谱法 利用具有两性电解质特点的组分如氨基酸和蛋白质、酶等在等电点上的差异，当混合物流经具有pH梯度的固定相时，各组分在相应的等电点上进行聚焦而达到分离的目的 。 疏水作用色谱利用蛋白质表面在非变性状态下容易与非极性物质相互作用的性质，从而将溶解性不同的蛋白质得以分离。上述方法主要用于两性

8、电解质或蛋白质的分离纯化。 2、按分离机理分类3. 按固定相的外形分类 柱色谱：固定相装于柱内的色谱法。可分为填充柱色谱法和开管柱色谱法。平板色谱：固定相呈平板状的色谱，它又可分为薄层色谱和纸色谱。 4. 按色谱动力学分类 洗脱法：又称淋洗法，如将3组分的样品注入色谱法，流动相连续流过色谱，并携带样品组分在柱内向前移动，经色谱分离后，样品中不同组分依据与固定相和流动相相互作用的差别，而顺序流出色谱柱。前沿法：又称迎头法，如将含3个等量组分的样品溶于流动相中，组成混合物溶液，并连续注入色谱柱。此法仅第一个组分纯度较高。置换法：又称顶替法，待分离混合物样品与固定相有强作用力，因此需使用一种比样品组

9、分与固定相间作用力更强的置换剂做流动相，当它注入色谱柱后，可迫使滞留在柱上的各个组分依次洗脱下来。5. 按使用领域不同对色谱仪的分类 分析用色谱仪：这类色谱仪主要用于各种样品的分析，其特点是色谱柱较细，分析的样品量少。 制备用色谱仪：制备用色谱仪又可分为实验室用制备型色谱仪和工业用大型制造纯物质的制备色谱仪。 流程色谱仪：流程色谱仪在工业生产流程中为在线连续使用的色谱仪。四、色谱法中常用的术语与参数色谱图 ：各组分经色谱柱分离后，从柱后流出进入检测器，检测器将各组分浓度（或质量）的变化转换为电压（或电流）信号，再由记录仪记录下来。所得的电信号强度随时间变化的曲线，称为流出曲线，也叫色谱图。1.

10、 区域宽度 (1) 标准偏差：W1的一半叫标准差，即峰高处色谱峰宽的一半。 半峰宽W1/2：即峰高一半处对应的峰宽。 它与标准偏差的关系为 W1/2。峰底宽度Wb ：即色谱峰两侧拐点上的切线在基线上截距间的距离。 它与标准偏差的关系为 Wb =4。W1Wb2. 保留值 保留值是各组分自色谱柱中滞留的数值，通常包括时间、距离及各组分流出色谱柱所需要的流动相的体积等参数。 （1）保留时间 保留时间（retention time, tR）：从进样到柱后某个组分出现浓度极大值的时间。死时间（dead time, t0）：不保留组分的保留时间，即流动相通过色谱柱的时间。调整保留时间（adjusted r

11、etention time, tR）：扣除死时间后的保留时间。 （2）保留体积保留体积（retention volume, VR）：从进样开始到某组分在柱后出现浓度极大值时流出溶剂的体积。又称为洗脱体积。 VR=tRFc死体积（dead volume, V0）：由进样器进样口到检测器流动池未被固定相所占据的空间。它包括4部分：进样器至色谱柱管路体积、柱内固定相颗粒间隙（被流动相占据，Vm）、柱出口管路体积、检测器流动池体积。其中只有Vm参与色谱平衡过程，其它3部分只起峰扩展作用。为防止峰扩展，这3部分体积应尽量减小 。V0=t0Fc调整保留体积（adjusted retention volum

12、e, VR）：扣除死体积后的保留体积。 VR=VR-V0= tR Fc3. 分配系数 样品在固定相和流动相中的分离达平衡时， Cs（固定相浓度）和Cm（流动相的浓度）的比值为平衡系数 K=Cs/Cm 在各种色谱中K的表示方法有区别。分配色谱：K为分配系数表示为：对吸附色谱而言 K为吸附系数，表示为 ：4. 容量因子 在两相分配达平衡时，物质在两相的量的比为容量因子（或分配容量、容量比、质量分配系数）。物理意义：表示一个组分在固定相中停留的时间是不保留组分保留时间（t0）的几倍。k0时，化合物全部存在于流动相中，在固定相中不保留，tR0；K越大，说明固定相对此组分的容量越大，出柱慢，保留时间越长

13、。 5. 选择性因子 选择性因子（selectivity factor）为相邻两组分分配系数或容量因子之比。它可以表示为：要使两组分得到分离，必须使1。与化合物在固定相和流动相中的分配性质、柱温有关，与柱尺寸、流速、填充情况无关。从本质上说， 的大小表示两组分在两相间的平衡分配热力学性质的差异，即分子间相互作用力的差异。五、色谱法的基本理论（一）塔板理论塔板理论认为溶质在色谱柱内的一次分配平衡，需要在一定的柱高内完成，通常将这段色谱柱称为一个理论板（theoretical plate），其高度称为理论塔板当量高度H（height equivalent to a theoretical plat

14、e，HETP）或塔板高度。色谱柱中存在着许多塔板。塔板理论的基本假设为：（1）样品的各组分都加在第0号塔板上，样品沿色谱柱轴方向的扩散可以忽略。（2）流动相是间歇式进入色谱柱，每次进入一个塔板体积。（3）在所有塔板上分配系数相等，与组分的量无关。设高度为L的色谱柱的理论板数为N，则：单位长度的柱内塔板数越多则柱效越高。保留时间峰底宽（二）速率理论 速率方程（也称范.弟姆特方程式）: H = A + B/u + Cu H：理论塔板高度，u：载气的线速度(cm/s) 减小A、B、C三项可提高柱效； 存在着最佳流速； A、B、C三项各与哪些因素有关？1. 涡流扩散项A A = 2dp dp：固定相的

15、平均颗粒直径：固定相的填充不均匀因子 固定相颗粒越小dp，填充的越均匀，A，H，柱效n。表现在涡流扩散所引起的色谱峰变宽现象减轻，色谱峰较窄。2. 分子扩散项B B = 2 Dg ：弯曲因子，填充柱色谱，1。 Dg：试样组分分子在气相中的扩散系数（cm2s-1）。由于柱中存在着浓度差，产生纵向扩散： a. 扩散导致色谱峰变宽，H(n)，分离变差。 b. 分子扩散项与流速有关，流速，滞留时间，扩散， c. 扩散系数：Dg （M载气）-1/2 ； M载气，B值3.传质阻力项 C 组分在气相和液相两相间进行反复分配时，遇到阻力。传质阻力包括气相传质阻力Cg和液相传质阻力CL ，液相传质阻力大于气相传

16、质阻力。即： C =（Cg + CL）4. 载气流速与柱效-最佳流速 载气流速高时： 传质阻力项是影响柱效的主要因素，随着流速的提高，柱效下降,右图曲线的右边。 载气流速低时： H - u曲线与最佳流速： 由于流速对这两项完全相反的作用，流速对柱效的总影响使得存在着一个最佳流速值，即速率方程式中塔板高度对流速的一阶导数有一极小值。 以塔板高度H对应载气流速u作图，曲线最低点的流速即为最佳流速。 分子扩散项成为影响柱效的主要因素，随着流速的增加，柱效提高，右图曲线的坐边。5、 分离度 塔板理论和速率理论都难以描述难分离物质对的实际分离程度。即柱效为多大时，相邻两组份能够被完全分离。 难分离物质对

17、的分离度大小受色谱过程中两种因素的综合影响：保留值之差色谱过程的热力学因素； 区域宽度色谱过程的动力学因素。 色谱分离中的四种情况如图所示： 柱效较高，K (分配系数)较大,完全分离； K 不是很大，柱效较高，峰较窄，基本上完全分离；柱效较低，K 较大,但分离的不好； K 小，柱效低，分离效果更差。分离度的表达式：R ：两峰的分离程度可达89%；R ：分离程度98%；R ：达99.7%（相邻两峰完全分离的标准）。提高分离度有以下三种途径：增加塔板数：增加柱长或降低塔板高度。增加选择性：改变流动相的组成及pH改变柱温改变固定相改变容量因子：可通过调节流动相的组成来实现。第一节 制备薄层色谱分离技

18、术制备色谱是指以色谱为手段从混合物中分离提纯所需要的纯化合物。 主要技术有薄层色谱:离心薄层、快速薄层制备柱色谱：干柱色谱、真空液相色谱；压力液相色谱、逆流色谱等。一、薄层色谱条件固定相的选择在制备色谱中应用较多的是以吸附剂为固定相的吸附色谱。固定相的选择应从被分离物质极性和固定相的性能的强弱这两方面考虑。被分离物质极性固定相性能/活性展开剂极性大弱（稍小）大小强小常用吸附剂简介(1) 硅胶：SiO2xH2O 是一种极性吸附剂，微带酸性，适用于酸性物质及中性物质的分离。硅胶的吸附活性与其表面吸附的水的量有关，硅胶表面存在硅醇基，通过氢键与极性化合物结合，用于分离有机物，也可通过氢键与水结合，当

19、吸水大于12%时，则失去活性或吸附性，不能用作吸附色谱，只能用作分配色谱的载体。但加热到100左右，此结合水能被可逆地除去，硅胶又恢复吸附能力。我们在制备薄层板后需进行活化，即为此目的。硅胶的分离效率取决于其颗粒大小和粒度分布范围，颗粒大范围宽效果差，但是展开快，斑点分散荧光硅胶：在硅胶中加入荧光剂，制成的薄层在紫外光照射下显荧光，而样品斑点处不显荧光，呈暗色，从而可检出斑点位置；这适用于那些本身无色，在紫外灯下也不显荧光，又无适当显色剂显色的化合物。荧光硅胶两种，波长254nm和波长为365nm， GF254、GF365 、HF365、HF254等。 硅胶可用于吸附色谱，也可用于分配色谱。主

20、要区别在于活化程度不同，前者活化程度较高，后者低得多。反相硅胶：当硅胶表面的羟基被部分烷基化时，称反相硅胶，其对物质吸附性恰好相反，对弱极性的物质具有吸附性（相似相容），用反相硅胶分离效果会大大提高。和正相相反，反相色谱常常被用于从极性溶液中或水相中分离非极性物质。非极性物质通过非极性官能团与固定相的相互作用被吸附在固定相的表面，一个非极性更大的溶剂将分析物从固定相上洗脱下来。常用的反相硅胶有C18、C8等。(2) 氧化铝有三种类型：碱性氧化铝（pH 9）、中性氧化铝（pH 7）及酸性氧化铝（）。它们都是由氢氧化铝制得，但条件不同。活性与其含水量有关。目前除了生物碱等减性物质外，很少用。 (3

21、) 纤维素纤维素有两种：天然纤维状纤维素，简称纤维素，通常是用木材或废棉经化学处理而制成微晶纤维素是用棉花等原料制成，纤维素分子由排列得比较规则的微小结晶区域（一般约占分子组成的 85）和分子排列杂乱的无定形区域交链而成，微晶纤维素的粒度为2040m。纤维素薄层主要适用于亲水性物质的分离，用途与层析纸相似，但在相同条件下比纸层析的分离效果好。多用于分配色谱法。展开剂的选择薄层色谱展开剂的选择，主要根据样品中各组分的极性、溶剂对于样品中各组分溶解度及吸附剂的活性等因素来考虑。溶剂的选择可采用微量圆环技术，其方法为：将样品溶液点于薄层板上，挥去溶剂，滴少量溶剂与薄层的斑点上，若样品斑点未发生扩散或

22、位移，则需增加展开剂的极性或量，若样品斑点向展开剂前沿快速扩散，则需降低展开剂的极性。石油醚环己烷四氯化碳甲苯苯氯仿乙醚乙酸乙酯丙酮正丙醇乙醇甲醇水冰醋酸。考察溶剂选择的效果溶剂系统选好后，则可在制备薄层板上进行验证并根据实验结果进行进一步调整，以便达到分离的目的。薄层色谱的比移值（Rf值）可衡量分离效果。Rf的范围在01。被分离物质的Rf值较理想的取值范围。一般两种物质的Rf时，足以使之分开。在一定条件下，特定化合物的Rf值为一个常数，因此可用于鉴别化合物。多元混合展开剂的应用在实际工作中常用两种或三种溶剂按一定比例混合作展开剂 这样分离的效果往往比单一的溶剂要好。多元混合展开剂中不同的溶剂

23、往往起着不同的作用。一般比例大的溶剂往往是起溶解待测组分和分离作用，占比例较小的溶剂起到调整改善分离物质的Rf值等。展开剂的选择是一个摸索的过程，一般情况下，弱极性溶剂体系大多由石油醚、苯、环己烷等组成，适用于极性小的物质，实验中可根据需要加入甲醇、乙醇，乙酸乙酯调节溶剂的极性，以获得较好的分离效果。中等极性的溶剂体系由氯仿和水基本两相组成，由甲醇、乙醇，乙酸乙酯等来调节，适合于蒽醌、香豆素，以及一些极性较大的木脂素和萜类的分离。 强极性溶剂，由正丁醇和水组成，也由甲醇、乙醇，乙酸乙酯等来调节，适合于极性很大的有机碱类化合物的分离，如生物碱的类化合物的分离。二、制备薄层色谱操作技术 铺板活化点

24、样展开（显色）收集（定量分析、制备纯样品、定性检出 ）1.薄层板的制备与活化：黏合剂有10%15%的煅石膏、0.2%0.7%的羧甲基纤维素钠、5%的聚丙烯酸水溶液或5%的淀粉浆。硅胶薄层一般在105110活化3060min；氧化铝薄层如果不加粘合剂，活化温度可达150左右。活化好的薄层一定要放在干燥箱中保存。因为吸附剂非常容易吸水，在50湿度的空气中放置5min，可以吸收失去水分的50，10 min吸收 80。制备好的薄层板可现行用适当的溶剂进行预展开，以除去吸附的杂质。2.点样：制备薄层一般采用条形上样，样品条的宽度为35 mm，距离薄层板底端大约2.5 cm，距薄层板两侧的边距为13 mm

25、。可重复点样，但须在前一次点样干燥后。 3展开：上行和下行、单次和多次4显色 ：必须是不破坏型，即不能用试剂显色，可采用（1）碘蒸气显色（2）紫外线显色若必须化学方法进行显色，则也可用一玻璃板遮住中间部分，使其两侧各露出一小条，然后喷雾显色。 5.收集：展开确定了所要的谱带后，用适宜工具如刀片将所需成分的谱带同吸附剂一起刮下，收集，选取适宜溶剂将所要组分洗脱下来，并清洗工具，合并洗脱液。将洗脱液收集，浓缩即可。如必要，可对收集物进行重结晶，以提高提取物的纯度。制备薄层与常规薄层的区别薄板的厚度不同板的大小 分离的样品量大 检测必须是不破坏型，即不能用试剂显色。样品连同吸附剂一起刮下，放入烧杯中

26、（或装入柱中）选用适当溶剂将组分洗脱出来。RPC是在TLC和柱色谱基础上发展起来的，利用旋转离心力，连续洗脱。涂有吸附剂薄层的转子在旋转过程中，在离心力的作用下，使溶剂在洗脱过程中，将样品在吸附层被分离形成同心谱带，使Rf值的差异加大，依次将不同组分的化合物，从转子边缘分离而出。三、离心薄层色谱和加压薄层色谱离心薄层色谱 特点： 优点：（1） 快速 30 min （2） 流动相少 （3） 可反复使用 （4） 进样方便 （5） 直接洗脱 （6） 直接检测，接收灵活 （7） 可梯度洗脱 （8） 经久耐用，占地小，移动方便 （9） 与普通制备薄层板相比，分离量大缺点：（1） 固定相限制 （2） Rf

27、值（3） 显色（4） 收集污染（5） 上样量少第二节 凝胶色谱分离技术及其应用凝胶色谱法（Gel Chromatograph GC）又称凝胶过滤色谱GFC（Gel Filtration Chromatography）或空间排阻色谱法（SEC），亦称分子排阻色谱法，系指利用多孔性凝胶填料的分子筛效应进行色谱分离的一种方法。一、 凝胶色谱分离的原理和分类 空间排阻理论：凝胶内部有许多孔隙 ，类似分子筛。当含有大、中和小不同尺寸分子的被分离组分溶液通过凝胶柱时，物质就依其分子的大小在凝胶上发生分离。组成待分离混合物的物质，以分子量递减的顺序先后离开柱床。 凝胶色谱按其流动相的不同分为两大类：凝胶过滤

28、色谱(gel filtration chromatography，GFC)：以水或缓冲液做流动相，如硅胶和玻璃珠等无机填料、琼脂糖凝胶、交联葡聚糖凝胶等。主要适合于水溶性高分子的分离。凝胶渗透色谱(gel permeation chromatography, GPC) ：以有机溶剂做流动相，所用填料有聚苯乙烯凝胶、聚乙酸乙烯酯、聚甲基丙烯酸甲酯凝胶等。主要适合于脂溶性高分子的分离。二、 凝胶的种类及性质 用于色谱分离的凝胶，除具有分离的特性外，还应满足下列几点要求：凝胶骨架在化学上必须是惰性的，即在分离过程中不应与被分离物质发生结合；凝胶的化学稳定性好，应在很宽的pH和温度范围内不起化学变化，

29、不分解；凝胶本身应是中性物质，不含有（或仅含有最少量）能解离的基团，不会产生离子交换现象；具有一定的孔径分布范围；机械强度高，允许较高的操作压力（流速）。凝胶的种类：按材料来源可把凝胶分成有机凝胶与无机凝胶两类按凝胶对溶剂的适应范围可以把凝胶分成亲水性、亲油性和两性凝胶三类。按机械性能分可分成软胶、半硬胶和硬胶三类。 1. 交联葡聚糖凝胶 葡聚糖凝胶是应用最广的凝胶，构成的基本单位是葡聚糖，经交联而成。葡聚糖凝胶表63 各型号交联葡聚糖的性能型号颗粒大小/目干胶吸水量（mL/g干胶）干胶膨胀度（mL/g干胶）溶胀时间（h）2025分离范围G-1040-2001.O0.1232至700G-154

30、01201.50.22.53.52至1500G-2520-801003002.50.02.50.2521005000G-5020801003005.O0.3107250010000G-7540-1207.50.5121572100050000G-10040-12010.O1.0152072500010000G-15040-12015.O1.52030725000150000G-20020.O2.030407250002000002. 琼脂糖凝胶 琼脂糖凝胶：骨架结构如图所示。琼脂糖主要来源于海藻，它是由交替的D-半乳糖和3，6-脱水半乳糖残基构成的。琼脂糖凝胶不能承受可以破坏氢键物质的作用表6

31、-4 琼脂糖凝胶的性质商品名称琼脂糖浓度%分离范围商品名称琼脂糖浓度%分离范围Sepharose6B61044106Bio-GelA-50m21055107Sepharose4B461042107Bio-GelA-150m11061.5108Sepharose2B271044107Sagavac 10101042.5105Bio-GelA-0.5m101045105Sagavac 882.51047105Bio-GelA-1.5m81041.5106Sagavac 6651042106Bio-GelA-5m61045106Sagavac 4421041.5107Bio-GelA-15m4410

32、41.5107Sagavac 2251041.51083. 聚丙烯酰胺凝胶 聚丙烯酰胺凝胶 是一种人工合成凝胶，是以丙烯酰胺为单位，由亚甲基双丙烯酰胺为交联剂交联成的网状聚合物，经干燥粉碎或加工成形制成颗粒状干粉，遇水溶胀成凝胶。控制交联剂的用量可制成各种型号的凝胶。表6-5 聚丙烯酰胺凝胶的性质聚丙烯酰胺凝胶吸水量膨胀体积分离范围/相对分子质量浸泡时间/h（mL/g干凝胶）（mL/g干凝胶）20 100P-21.53.0100180042P-42.44.8800400042P-63.77.41000600042P-104.59.015002000042P-305.711.4250040000

33、123P-607.214.41000060000123P-1007.515.05000100000245P-1509.218.415000150000245P-20014.729.430000200000485P-30018.036.060000400000485三、凝胶特性参数 （1）排阻极限：是指不能扩散到凝胶网络内部的最小分子的相对分子质量。不同的凝胶过滤介质具有不同的排阻极限。 （2）分级范围：即能被凝胶阻滞，并且相互之间可以得到分离的溶质的相对分子质量范围。（3）溶胀率：每克干凝胶所吸收的水分的百分数称为溶胀率溶胀率= 100(溶胀处理平衡后重量一干燥重量)干燥重量A点一称为凝胶的排

34、除极限，即大于A的分子被排阻在凝胶颗粒之外；B点一称为渗透极限，即小于B的分子完全进入凝胶颗粒的徽孔中（4）柱体积：也称床体积，即 1g干燥凝胶溶胀后所占有的体积。也称膨胀度。凝胶的床体积可用于估算装满一定体积的层析柱所需的干燥凝胶量。 （5）空隙体积：也称外水体积，指层析柱中凝胶之间空隙的体积，即 V0值。（6）内孔体积 ：又称内水体积,颗粒内部的空间即 Vi值 。（7）峰洗脱体积 ：是指被分离物质通过凝胶柱所需洗脱液的体积。四、凝胶色谱分离的步骤 (一) 色谱柱的选择色谱柱是凝胶色谱技术的主体，一般用玻璃管或有机玻璃管。色谱柱的直径大小不影响分离度，样品用量大，可加大柱的直径。一般制备用的

35、凝胶柱，直径大于2 cm，但在加样时应将样品均匀分布于凝胶柱床面上。分离度取决于柱高，为分离不同组分，凝胶柱床必须有适宜的高度，分离度与柱高的平方根相关，柱高一般不超过1 m。柱高与直径的比一般称为柱比。一般凝胶柱长2030 cm，柱比为（5：1）（10：1），凝胶床体积为样品溶液体积的410倍。 (二) 凝胶的选择作为固定相的凝胶，其材料性质、颗粒大小、孔径、机械强度、化学稳定性及其均一性等都对凝胶色谱分离的效果有重要的作用。一般选择使用凝胶时应注意以下问题：混合物的分离程度主要决定于凝胶颗粒内部微孔的孔径和混合物相对分子质量的分布范围。凝胶的颗粒粗细与分离效果有直接关系。一般来说，细颗粒分

36、离效果好，但阻力大，流速慢；粗颗粒流速快，但会使区带扩散，使洗脱峰变平而宽。选择合适的凝胶种类后，再根据色谱柱的体积和干胶的溶胀度（床体积/g干胶），计算出所需干胶的用量。(三) 溶剂的选择考虑样品的溶解能力和仪器的承受能力,尽可能采用纯度高、毒性低、对样品溶解性能好、粘度低及已知粘度参数的溶剂。水溶性物质的洗脱一般采用水或具有不同离子强度和pH值的缓冲溶液。(四) 凝胶色谱操作溶胀装柱上样洗脱再生G-75以下的凝胶需要泡1天，而G-100以上的型号需泡3天 搅拌下，缓缓地、均匀地、连续地加入已经脱气的充分溶胀的凝胶悬浮液，同时打开柱端阀门 1.直接加样至层析床表面 2.样品液的加入量应掌握在

37、凝胶床总体积的510 控制速度五、凝胶色谱分离技术的应用与实例 分离纯化 ：凝胶色谱可用于相对分子质量从几百到106数量级的物质的分离纯化，例如蛋白质、肽、脂质、抗生素、糖类、核酸及病毒（50400nm）的分离与分析。凝胶色谱还可用于医药产业中的生物制剂中抗原性杂质的除去。 例如：1青霉素纯化2脱盐 除去相对低分子质量物质。 例如，经过盐析沉淀获得的蛋白质溶液中盐浓度很高，一般不能直接进行离子交换层析分离，可首先用GFC脱盐。3. 多糖的分离 六、凝胶色谱分离技术的特点（1）溶质与介质不发生任何形式的相互作用，因此产品收率可接近100；（2）每批分离操作结束后不需要进行介质的再生，故容易实施循

38、环操作，提高产品纯度；（3）作为脱盐手段，凝胶色谱比透析法速度快，精度高；与超滤法相比，剪切应力小，蛋白质活性收率高；（4）分离机理简单，操作参数少，容易规模放大。第三节 高速逆流色谱分离技术逆流色谱（CCC）是以液相物质为固定相的液-液色谱，是一种特殊的连续萃取装置。最早的逆流色谱是液滴逆流色谱（DCCC），后来发展了离心逆流色谱（CCCC）和高速逆流色谱（HSCCC）。特征是互不相溶的两相在分离过程中做逆流运动，溶质组分由于在两相中分配系数不同而得到分离。 已被应用于生化、生物工程、医药、天然产物化学、有机合成、环境分析、食品、地质、材料等领域。 一、简介 1. 液滴逆流色谱（Drople

39、t Counter Current Chromatograph，DCCC） 液滴逆流色谱最大的弱点是可允许的流速太低，因此分离时间长，两相混合差，相对来说，造成效率就低了。 离心液滴逆流色谱（Centrifugal planetary chromatograph,CPC）离心液滴逆流色谱比液滴逆流色谱进步的地方就是使用离心加快重力分离。 2. 高速逆流色谱（High-speed counter current chromatography，HSCCC）高速逆流色谱（HSCCC）利用了一种特殊的流体动力学（单向流体动力学平衡）现象，使两个互不相溶的溶剂相在高速旋转的螺旋管中单向分布。其中一相作固

40、定相，由恒流泵输送载着样品的流动相穿过固定相，利用样品在两相中分配系数的不同实现分离。 二、高速逆流色谱的原理与特点高速逆流色谱是一种建立在单向性流体动力平衡体系之上的一种逆流色谱分离方法。它利用了单向流体动力学平衡现象。高速逆流色谱是在旋转运动中完成的，两相溶剂都被剧烈振动的离心力场，依其界面特征甩成极微小的颗粒，样品、各组分会在两相微粒的极大表面上分配，并且能在颗粒振荡与对流的环境中有效地传递。所以，它就象是把通常的溶剂萃取过程成千上万次地、高效地、自动连续地完成。在逆流色谱中，留在管中固定相的量是影响溶质峰分离度的一个重要因素，高保留量将会大大改进峰分离度。当使螺旋管的转速加快时，固定相

41、保留就会增多，分离效果也就越好，从而极大地提高了逆流色谱的分离速度，故将此法称为“高速逆流色谱”，具有以下的特点：应用范围广，适应性好。操作简便，容易掌握。重现性好，回收率高。分离效率高，分离量较大。产品纯度高。三、高速逆流色谱溶剂系统的选择高速逆流色谱能否成功分离，溶剂系统的选择非常重要。溶剂系统不仅要求两相互不相溶，而且还要求它们有比较快的分离时间。溶剂系统的两相可以是两组分的，也可以是多组分的。溶剂系统通常通过下列两个方面进行考察：分离组分在两相中要有合适的分配系数。两相溶剂系统的初步筛选一般情况下，两相溶剂系统的初步筛选可首先通过薄层色谱法或者高效液相色谱法预测被分离物质的极性，然后根

42、据极性选择合适的分离体系；也可以首先选出一个能使样品全部溶解的溶剂体系，然后调整各溶剂的比例使得被分离组分满足K值和的要求，以提高分离度。在实际工作中，如果通过实验或文献已知与被分离物质极性相似物质的分离体系，则可借鉴。如果被分离物质的极性都比较大，可以选用乙酸乙酯体系。该体系是高速逆流色谱分离常用的体系之一，属强极性体系。一般由乙酸乙酯和水组成，并加入不同比例的甲醇、乙醇、正丁醇等作为极性调节剂，组成三元或四元溶剂体系。如果被分离物质一部分极性大，一部分极性中等可以选用中极性的氯仿体系。四、高速逆流色谱的操作过程及其应用实例实例6-2：高速逆流色谱在分离纯化木蝴蝶中的黄酮苷类化合物的应用。实

43、例6-3：高速逆流色谱用于分离制备厚朴酚与和厚朴酚。第五节 制备柱色谱分离技术常压柱色谱加压柱色谱减压柱色谱常压柱层析 (0.1-50 g) （Ordinary Column Chromatograpy）1.色谱柱：玻璃或石英柱子的径高比一般在1：51：20之间，对于易于分离的样品，可以用相对短的柱子，而对于难分离的样品，则可以用长柱子。 常压柱色谱固定相 ：硅胶G、氧化镁、氧化铝、活性碳、聚酰胺等。一般要求吸附剂：有大的表面积和一定的吸附能力；颗粒均匀，不与被分离物质发生化学作用；对被分离的物质中各组份吸附能力不同 洗脱剂 ：根据被分离物质各组分的极性大小、在洗脱剂中溶解度大小进行选择。极性

44、大的组份，选择极性大的洗脱剂（如水、乙醇、氨等）；极性小的组份宜选用极性小的洗脱剂（如石油醚、乙醚等）。 易溶于洗脱剂中不易吸附于吸附剂上的组份，被脱的快，优先随洗脱剂被洗出来；不易溶于洗脱剂而易被吸附剂吸附的组份，被洗脱的速度慢，从而达到分离物质的目的实际上单纯一种洗脱剂有时不能很好分离各组份，故常用几种吸附剂按不同比例混合，配成最合适的洗脱剂 操作方法 柱层析操作过程：装柱、加样、洗脱、收集、鉴定五个步骤。1 装柱 Al2O3：吸附剂 : 样品 (2050 : 1) (20100 :1) Silica：吸附剂 : 样品 (30100 : 1) (300400 :1) 1) 干法 与TLC吻

45、合度较好，溶剂消耗少 2) 湿法 紧密，前沿整齐 2 上样 1) 湿法 溶剂溶解上样（少量），低极性 2) 干法 低极性溶剂溶解性差 3 洗脱 常压 、低压、梯度洗脱（从低极性开始） 4 收集与检查 TLC UV应注意不可使柱面暴露于空气中 注意流速，不能太快二、加压柱色谱（Pressure Liquid Chromtograpy）压力液相色谱（PLC）泛指经加压的色谱柱，以区别于靠自然重力分离的常压开口柱，又称快速色谱。 依据压力将压力液相色谱技术分类 低压液相色谱（0.5 MPa），分离样品5 g中压液相色谱（2 MPa），1100 g高压液相色谱（2 MPa）。1. 低压制备色谱压力通过

46、色谱柱顶部提供，常见的加压手段有氮气钢瓶加压、双链球加压、空气加压泵加压及蠕动泵加压。 压力柱色谱的特点（1）设备简单，操作容易，流动相由低压（0.052 MPa）压缩空气或氮气驱动，速度快，效率高。（2）可与薄层色谱配合使用。（3）在薄层上面Rf值的组分，在快速色谱柱上都可以很好地分开。（4）色谱柱的材质多为玻璃或石英，易于观察洗脱状态。2. 中压色谱技术中压色谱柱大多是由耐压的强化玻璃制成，多数情况下，中压色谱柱需由实验人员自己填装。可采用湿法或干法装柱。在实际工作中，中压制备色谱既可利用制备色谱仪来完成，也可根据研究需要由自己来组装，其部件主要有：能提供几十公斤压力的横流泵、色谱柱、检测

47、器，而对于较完备的色谱装置还配有自动分馏收集器和进样阀。对于复杂的中药提取物中有效成分的分离，在进行中压色谱柱分离之前需进行预处理，如大空树脂处理、萃取等。填装好色谱柱后，将填装好的色谱柱进行减压或氮气加压，以便将色谱柱压紧。干法装柱可使固定相填装密度至少提高20。表6-6 中压制备色谱在各种天然药物分离中的应用分离物质柱尺寸/mm填料流动相吲哚生物碱71318.5RP-18（40m）甲醇-乙睛-四氢呋喃-水生物碱糖苷10010RP-18（4063m）乙睛-水（24:76）色酮46026Diod己烷-乙酸乙酯（4:1）单萜46036RP-18（1525m）甲醇-水（65:35）三萜46050S

48、iO（3570m）二氯甲烷-甲醇-乙酸（110:8:3）3. 高压制备液相色谱 高压制备液相色谱具有柱效高、分离速度快等特点。与分析型制备色谱相比，其通量是分析型的几百倍上千倍，制备型选用的是大流速的泵（数十毫升/min甚至上百毫升/min），5m以上的粗粒径填料，实验室用制备柱的粒径一般为520m。色谱柱较分析型粗（分析型色谱柱的内径一般为45mm），一般822mm，以提高柱子的载样量。高效液相色谱法按分离机制的不同分为液固吸附色谱法、液液分配色谱法（正相与反相）、离子交换色谱法、离子对色谱法及分子排阻色谱法。液液色谱法按固定相和流动相的极性不同可分为正相色谱法（NPC）和反相色谱法（RPC

49、）。(1) 液液色谱-正相色谱法采用极性固定相（如聚乙二醇、氨基与腈基键合相）；流动相为相对非极性的疏水性溶剂（烷烃类如正已烷、环已烷），常加入乙醇、异丙醇、四氢呋喃、三氯甲烷等以调节组分的保留时间。常用于分离中等极性和极性较强的化合物（如酚类、胺类、羰基类及氨基酸类等）。 反相色谱法一般用非极性固定相（如C18、C8）；流动相为水或缓冲液，常加入甲醇、乙腈、异丙醇、丙酮、四氢呋喃等与水互溶的有机溶剂以调节保留时间。适用于分离非极性和极性较弱的化合物。反相色谱法在现代液相色谱中应用最为广泛，据统计占整个HPLC应用的80%左右。C18和C8使用的pH值通常为，太高的pH值会使硅胶溶解，太低的p

50、H值会使键合的烷基脱落。C18和C8使用的pH值通常为，太高的pH值会使硅胶溶解，太低的pH值会使键合的烷基脱落。（2）离子对色谱法又称偶离子色谱法，是液液色谱法的分支。它是根据被测组分离子与离子对试剂离子形成中性的离子对化合物后，在非极性固定相中溶解度增大，从而使其分离效果改善。主要用于分析离子强度大的酸碱物质。 分析碱性物质常用的离子对试剂为烷基磺酸盐、高氯酸、三氟乙酸分析酸性物质常用四丁基季铵盐，如四丁基溴化铵、四丁基铵磷酸盐等。 离子对色谱法常用ODS柱（即C18柱），流动相为甲醇-水或乙腈-水，水中加入310 mmol/L的离子对试剂，在一定的pH值范围内进行分离。 高压制备型液相色

51、谱的样品预处理由于制备色谱柱处理的样品多，比分析柱子更容易受污染，所以，必要的前处理就显得非常的必要。萃取、过滤、结晶、固相萃取等简单的分离方法均可作为样品上柱前的预处理方法。由于颗粒状杂质可能损坏高压液相色谱仪的阀门，阻塞管道或柱入口端的滤板，所以在高压液相色谱进样之前，需对样品进行过滤。用孔径为2m之间，微孔滤膜过滤，常用。表6-7 HPLC在天然药物分离制备中的应用分离物质色谱柱型号柱尺寸/mm流动相从大麦得到前花杏素RSL SiL C18HL（30m）5009水-醋酸从大豆得到异黄酮Partisil ODS-32509.4甲醇-水从Taxus media得到紫杉醇BondapakC18

52、（15m）30047乙睛-水（1:3）从藜属植物奎藜轩得到皂苷TSK-gelODS-120T30021.5甲醇-水（68:32）三、减压（真空）液相色谱在减压情况下，使洗脱液快速通过固定相，达到快速分离的操作。真空液相色谱为间歇式操作，每洗脱一次则收集一个流分，可通过更换洗脱剂极性，使极性相近的成分得以分离。7.5 超临界流体色谱（SFC）1 方法原理2 应用1 方法原理 超临界流体色谱法是以超临界流体作为流动相的一种色谱方法。 超临界流体时指既不是气体也不是液体的一些物质，它们的物理性质介于气体和液体之间。（1）超临界流体的特性（2）超临界流体的色谱仪（3）压力效应（4）固定相和流动相（5）

53、检测器（1）超临界流体的特性物质的临界点超临界流体的特性物质的临界点 当处于临界温度下时，其气体和液体具有相同的密度；当处于临界温度以上时，不管施加多大压力，气体也不液化流体。其密度随温度、压力改变。超临界流体的特性 超临界流体的粘度接近于气相色谱的流动相，传质阻力小；其密度与液相色谱的流动相类似；超临界流体的其它物理性质和化学性质，都是密度的函数。超临界流体的特性 只要改变流体的密度，就可以改变流体的性质，从类似气体到类似液体，无需通过气液平衡曲线。超临界流体程序升密度相当于气相色谱中程序升温度和液相色谱中的梯度洗脱。其高密度特性，使其具有足够的溶解能力。（2）超临界流体的色谱仪（3）压力效

54、应在SFC中，压力的变化对容量因子k值产生显著影响，以超临界流体作流动相，它的密度随压力的增加而增加，而密度的增加引起流动相溶剂效率的提高，同时可缩短淋洗时间。（4）固定相和流动相 用于SFC中的色谱柱可以是填充柱，也可以是毛细管柱。毛细管超临界流体色谱（CSFC）由于具有高的分离效率，倍受青睐。 流动相一般选择CO2。（5）检测器SFC可选择高效液相色谱用检测器，其一主要优点可选择GC中的FID(火焰离子化)检测器，提高对有机物测定的灵敏度。2 应用 SFC测定分子质量范围与LC相当。广泛用于天然物、药物、表面活性剂、高聚物、多聚物、农药、炸药、火箭推进剂等物质的分离和分析。 通常的色谱存在下列问题：(1)不能连续操作；(2)溶剂和分离材料利用率低；(3)流出组分被高度稀释； SMB同样的分离材料，生产力增加60倍，溶剂消耗量减少80倍。制备色谱技术7.6 模拟移动床色谱(SMB)模拟移动床色谱原理： 制备色谱技术 色谱对不同组分进行分离，主要是利用各种组分在色谱柱中的迁移速率不同来完成的考虑两种组分A和B的分离，其中B比A更容易在固定相上吸附，因而B在色谱中迁移速率要比A小如果让固定相以一个介于A，B两种组分迁移速率之间的速度与溶剂作反向运动，这样A，B两种组分就会分别由固