(完整版)3_环境污染的微生物检测课件

1、Environmental Microbiology郑州大学生物工程系 席 宇环境微生物学第十章 环境污染的微生物检测主 要 内 容 环境污染的指示微生物 污染物生物毒性的微生物学检测方法污染物致突变的微生物学检测方法微生物的存在离不开环境，而微生物的数量分布和种群组成、理化性状、遗传变异等，又是环境状况的综合而客观的反映。因此利用微生物我们可以指示环境状况，监测环境污染,评价污染物毒性。第一节 环境污染的指示微生物指示微生物（indicator microorganism）:也称为指示菌（indicator bacteria）是指在常规的环境监测中，用于指示环境样品污染程度，并评价环境污染状

2、况的具有代表性的微生物。一、一般污染指示微生物1.细菌总数（total bacteria count）:指环境中被测样品，在一定条件下培养后所得的1ml或者1g检样中所含的细菌菌落总数。细菌总数主要反映环境中异养型细菌的的污染度，也间接反映一般营养性有机物的污染程度微生物总数的表示方法：细菌总数一般采用：个/ml、cfu/ml 或cfu/g来表示。cfu(colony forming unit)是指单位体积、单位表面积或单位质量检样中菌落形成单位。pfu(plaque formation unit ):空斑形成单位，用于病毒、蛭弧菌的效价测定。2.霉菌和酵母菌总数(fungi and yeas

3、t count)指环境中被测样品经过处理，在一定条件下培养后所得的1ml或者1g检样中所含的霉菌和酵母菌菌落总数。检测霉菌和酵母菌，是从另一生物学层次，反映环境的一般污染。我国在食品、药品和化妆品都规定了检出标准(p387)二、粪便污染指示菌1.总大肠菌群（total coliform）也称为大肠菌群(coliform 或者 coliform group)。大肠菌群是一群需氧和兼性厌氧的，能在37培养24h内使乳糖发酵产酸产气的革兰氏阴性无芽胞杆菌，包括埃希氏菌属、柠檬酸杆菌属、肠杆菌属、克雷伯氏菌属等。2.粪大肠菌群（fecal coliform）指能够在44.5 (44-45)发酵乳糖的大

4、肠菌群，亦称耐热性大肠菌群(thermotolerant coliform)。粪大肠杆菌也包括同样的4个属，但以埃希氏菌属为主。粪大肠菌群与粪便中大肠杆菌数目直接相关，在外界环境中不易繁殖，作为粪便污染指示菌意义更大Coliforms are several different types of bacteria that exist in the intestines of warm blooded animals and are found in bodily waste, animal droppings, and naturally in soil.Coliform bacteria

5、are described and grouped, based on their common origin or characteristics, as either total or fecal coliforms.The group of total coliforms includes faecal coliform bacteria, such as Escherichia coli (E.coli), as well as other types of coliform bacteria that can survive in soil and vegetation.Total

6、coliforms do not necessarily indicate recent water contamination by faecal waste, however the presence or absence of these bacteria in treated water is often used to determine whether water disinfection is working properly.我国目前水质标准中规定的大肠菌群数（cfu/L）：饮用水3 游泳池水 100地表水 第一级500 第二级10000 第三级50000* * *第二节 污染

7、物生物毒性的微生物学检测方法一、生态毒理学的基本概念1.毒性的概念与检测毒性（toxicity）:指外源化合物与肌体接触或进入体内的易感部位后，能引起损害作用的相对能力，毒性越强的物质造成损害所需的剂量和浓度越低。毒性的检测一般有动物试验和微生物试验当我们以微生物为检测手段时多称为生物毒性（biotoxicity）微生物检测方法的原理是选择微生物的某一项或几项生理指标作为指征，根据待测物质影响或者抑制这些指征的程度来判断毒性的强度。2.毒性试验的常用参数致死剂量或致死浓度：Lethal Dose，LD或者 Lethal Concentration，LC.绝对致死剂量：Absolute Leth

8、al Dose ,LD100半数致死剂量：Median Lethal Dose ,LD50最小致死剂量：Minimum Lethal Dose ,MLD最大耐受剂量：Maximum Lethal Dose ,LD0半数效应浓度（Median Effect Concentration,EC50）能够影响微生物某种正常生理指标值50%所需的待测物质浓度,有时候也指能够引起50%的受试生物的某种效应变化的浓度.半数抑制浓度（Median Inhibition Concentration,IC50）能够引起受试生物的的某种效应50%抑制的浓度。二、原核微生物检测方法生物发光是某些生物的一种生理现象，海

9、洋生物中更为多见。（一）发光细菌-生物发光抑制试验上世纪70年代至80年代初，国外科学家首次从海鱼体表分离和筛选出对人体无害，对环境敏感的发光细菌，用于检测水体生物毒性，现已成为一种简单、快速的生物毒性检测手段。美国Microbics公司设计制造了一套微毒测定仪器。中国科学院南京土壤研究所成功地研制DXY-2型的生物发光光度计。华东师范大学生物系也分别成功地研制了9N-1型的生物毒性测试仪。美国的Beckman公司研制出系列的细菌发光检测仪，将毒性的测定过程标准化，命名为Microtox1.发光细菌(luminous bacteria)主要从海洋中分离的一类能够产生生物发光的细菌，目前发现的主

10、要有弧菌属、发光杆菌属，异短杆菌属。发光细菌均为革蓝氏阴性、兼性厌氧菌2.试验原理发光菌检测法是以一种非致病的明亮发光杆菌作指示生物，以其发光强度的变化为指标，测定环境中有害有毒物质的生物毒性的一种方法。细菌发光的生物学机制为：生物发光是发光细菌生理状态的一个反映，在生长的对数期发光能力最强。当环境条件不良或者有毒物质存在时，因为细菌的荧光素酶活性或细胞呼吸受到抑制，发光的能力受到影响而减弱，其减弱程度与毒性的大小和浓度成一定的比例关系。3.测试方法菌种复苏样品处理毒性测定向测试管中定量加入菌液和样品，以苯酚作为阳性有机毒物对照，Zn2+作为阳性无机毒物对照，蒸馏水为阴性对照。15 下培养5m

11、in或者15min，就可以生物发光光度计直接读出或者扫描出5min或者15min的光量抑制百分率(Inhibition rate,IR)IR=阴性对照组指标值-实验组指标值阴性对照组指标值100%IR为50%时样品的剂量即为IC50Microtox Toxicity TestingMicrotox is a standardized toxicity test system which is rapid, sensitive, reproducible, ecologically relevant and cost effective. It is recognised and used th

12、roughout the world as a standard test for aquatic toxicity testing. The Procedure employs the bioluminescent marine bacterium (Vibrio fischeri) as the test organism. The bacteria are exposed to a range of concentrations of the material being tested. The reduction in intensity of light emitted from t

13、he bacteria is measured along with standard solutions and control samples. The change in light output and concentration of the toxicant produce a dose / response relationship. The results are normalised and the EC50 (concentration producing a 50% reduction in light) is calculatedThe Microtox system

14、has been used as an aquatic toxicity test since the early 1980s and is accepted as a standard test in a number of countries including Australia. In the United States it is a recognised test method in a number of federal programs. The Acceptance of MicrotoxThe U.S. EPA, has adopted Microtox as a stan

15、dard test in an ongoing program of Assessment and Remediation of Contaminated Sediments. Microtox has been adopted by the U.S Fish and Wildlife Service as a screening test at the National Fisheries Contaminant Research Centre. Microtox is similarly recognised in Canada, the United Kingdom, Germany,

16、Sweden and the Netherlands.In Australia, the Microtox system is recognised by and listed in discharge, trade waste and effluent regulations by a number of Authorities. In Victoria, Microtox toxicity is used to check regulatory compliance of some discharges and effluents.The Benefits of MicrotoxThe M

17、icrotox system has many benefits over other toxicity testing systems. The low cost enables it to be used as a regular monitoring and screening test. A full Microtox assay is about a tenth of the cost of other toxicity tests.It is usually desirable to have toxicity results as soon as possible. Microt

18、ox assays can be completed within an hour and a report available within 24 hours, making them a very rapid form of testing. 二、硝化作用抑制试验（nitrification inhibition test）1989年国际标准化组织把该方法作为检测化合物或废水毒性的标准化方法（ISO9509）之一1.试验原理NH3 NO2-NO3-亚硝化细菌硝化细菌二、测试方法硝化作用抑制试验可单独选择亚硝化单胞菌或硝化杆菌，也可采用活性污泥中的混合菌株。菌种活化与增殖样品稀释与设置培养与

19、取样比较与计算三、真核微生物检测方法（一）藻类生长抑制试验（alage growth inhibition test）1.试验原理藻类对水体污染的反应十分敏感。藻类的生长量和水体污染的关系很大。水质监测和毒性检测常用的有硅藻、栅藻、小球藻等2.试验方法藻类生长量的测量藻体生长量 放氧量摄取14C量细胞DNA和ATP的测定藻体生长量的测量细胞计数藻体干重藻液浑浊度叶绿素a含量繁殖纯藻种试验配置与藻类接种同等适宜条件下培养定时取样检测并绘制生长曲线计算与分析3.毒性测定程序第三节 污染物致突变的微生物学检测方法污染物对人体的潜在危害，引起人们的普遍关注。世界上已发展了百余种短期快速测试法，检测污染

20、物的遗传毒性效应。 目前一般认为人类癌症的发生与环境污染物的致突变性有一定的关系。诱变剂作用的共性原则：超过95%的致癌物质对微生物有诱变作用；化学药剂对细菌的诱变率与其对动物的致癌性成正比。所有这些检测试验都基于两个原则90%以上的非致癌物质对微生物没有诱变作用。人和细菌在DNA的结构及特性方面是一致的，能使微生物发生突变的诱变剂必然也会作用于人的DNA，使其发生突变，最后造成癌变或其他不良的后果。生命的“生物化学统一性”法则：美国加利福尼亚大学Bruce Ames教授等于1975年正式建立的沙门氏菌回复突变试验（亦称Ames试验）已被世界各国广为采用，是检测环境诱变剂的的首选试验。一、 A

21、mes试验Ames试验是检测DNA碱基序列是否发生改变即基因突变的一种方法。1.试验原理鼠伤寒沙门氏菌（Salmonella typhimurium）的组氨酸营养缺陷型（his-）菌株，在含微量组氨酸的培养基中，除极少数自发回复突变的细胞外，一般只能分裂几次，形成在显微镜下才能见到的微菌落。受诱变剂作用后，大量细胞发生回复突变，自行合成组氨酸，发育成肉眼可见的菌落。野生型与组氨酸营养缺陷型关系如下：野生型his+营养缺陷型his-正向突变回复突变回复突变(reverse mutation或back mutation)：突变体失去的野生型性状，可以通过第二次突变得到恢复，这种第二次突变称为回复突

22、变。实验菌株目前推荐使用的一套菌株是组氨酸营养缺陷型菌株TA97、TA98、TA100和TA102。鉴定前先进行增菌培养。为鉴定结果可靠，需同时培养野生型TV菌株，作为测试菌基因型之对照。由于生物体内、体外可能存在的差异，可在体外加入哺乳动物（如大鼠）微粒体酶系统，使待测物活化，使Ames试验的准确率达80-90%。哺乳动物微粒体酶S9混合液：雄性大鼠肝脏匀浆物上清液+辅酶 +G-6-PMost environmental genotoxins are found in an inactive state (progenotoxin) and must be metabolically act

23、ivated to become DNA-damaging substances. The incorporation of a mammalian (rodent) hepatic metabolic activation system - the postmitochondrial supernatant fraction (commonly referred to as the S9 fraction) - into a genotoxicity test significantly improved the assays sensitivity to a broader spectru

24、m of genotoxins.The use of fish S9 (Johnson, 1993c) has increased the ecological relevancy of these tests in aquatic ecosystems. This addition of a hepatic metabolic activation system has become an important milestone in the development of environmental genotoxicity testing . 检测鼠伤寒沙门氏菌(Salmonella ty

25、phmurium)组氨酸营养缺陷型菌株(his-)的回复突变率2.具体操作程序实验方法很多，目前主要应用的是斑点法和平板掺入法，此外还有一些其它的方法。Ames试验Ames试验Ames试验的应用范围检测食品添加剂、化妆品等的致突变性，由此推测其致癌性；检测水源水和饮用水的致突变性，探索较现行方法更加卫生安全的消毒措施 ；检测城市污水和工业废水的致突变性，结合化学分析，追踪污染源，为研究防治对策提供依据 检测土壤、污泥、废渣堆肥、废物灰烬的致突变性，防止土壤受致突变物污染后，通过农作物危害人类检测气态污染物的致突变性，防止污染物经由大气，通过呼吸对人体发生潜在危害 用Ames试验研究化合物结构与

26、致变性的关系，为合成对环境无潜在危害的新化合物提供理论依据检测农药在微生物降解前后的致突变性，了解农药在施用后代谢过程中对人类有无隐患 用Ames试验筛选抗突变物，研究开发新的抗癌药等等Ames试验的应用实例：国外曾开发了一种降低妇女妊娠反应的药物“反应停”，由于其药效显著，在60-70年代十分流行。但随后人们就发现畸形儿的出生率明显增高，而且生产畸形儿的妇女大多曾服用“反应停”，后来采用Ames试验发现这种物质的确具有很强的致突变作用，因此这种药物被禁止使用，但如果能在这种药物上市之前就进行Ames试验检测，那么这种大量出生畸形儿的悲剧完全可以避免。二、发光细菌实验（Mutatox）发光细菌

27、可用于各类污染物的急性毒性检测，经特殊处理后还可用于污染物的遗传毒性的检测检测的主要原理为发光细菌的自发暗变异株与致突变物接触后，可恢复一定强度的发光能力。美国的Microbics公司将这一方法标准化，命名为Mutatox.Mutatox toxicity testThe Mutatox test is considered as a promising tool for detection of mutagenic compounds in environmental samples. The genotoxicity of water samples can be determined w

28、ith Mutatox Genotoxicity Test System (Microbics Corporation, CAL U.S.A.).The Mutatox assay detects genotoxins with a dark mutant strain of the luminescent bacterium Photobacterium phosphoreum. DNA-damaging substances are recognized by measuring the ability of a test sample to restore the luminescent

29、 state in the bacterial cells .Light produced by luminescent bacteria makes an easy quantitative endpoint in the genotoxicity assayThe amount of light increase indicates the genotoxicity of the sample.Various genotoxins, base-substitution or frame-shift, DNA synthesis inhibitors, and DNA-intercalati

30、ng agents, have been detected with the Mutatox assay . Mutatox protocol is very simple, requiring minimal expertise. The assay may be initiated and completed in less than 24 hours. Prepackaged dehydrated media, freeze-dried bacteria, and standard disposable reaction tubes require only a few hydratio

31、n, mixing, and dilution steps and eliminate the rigors, tedium and cost of sterile technique.Bacteria are nonpathogenic, clonal, and require no reisolation or reculturing; in addition, they are completely disposable without causing any environmental harmIncubation time is short which reduces the possibility of cross-contamination with bacterial contaminants.Quality assurance and quality control are sim