《菌种改造技术》word版

1、 菌种改造技术 摘要：微生物在工业上的应用日益增多，而一般从自然中得到的微生物产率都不高，达不到生产要求，而经过改造后的菌种产率会大幅度提高。本文论述了诱变育种、代谢调控育种、基因重组育种等菌种改造技术。关键字：菌种改造；技术微生物已广泛的应用到医药、卫生、食品、酿酒等各个领域，都取得了很好的效益，而原始的微生物产率都不高，我们必须对其进行菌种改造，才能更好的应用于工业领域中。微生物改造的技术有很多，例如，选择性培养、诱变育种、代谢调控育种和基因重组等1。这些技术的应用，促使微生物产率大幅度提高，微生物产品应用越来越广。微生物菌种改造技术涉及微生物学、生物化学、遗传学、分子生物学等多门学科，是

2、一个综合性的应用技术。1.出发菌株的选择发酵工业上选用的菌株最初都是从自然界中分离出来的，筛选出优良的菌株是菌种改造的第一步，也是很重要的一步。菌株的自然选育包括采样、增殖培养、纯种分离、性能测定等2步骤。 （1）采样 采样地点的确定要根据筛选的目的、微生物的分布状况以及菌种的主要特征与外界环境等，进行综合、具体的分析来决定。如果预先不知道微生物的具体来源，一般可从土壤中分离。采样的方法多是在选好的地点，取离地面515 cm的土壤几十克，盛入预先消毒好的牛皮纸袋或塑料袋中，扎好，记录采样的时间、地点、环境状况，以备参考。（2）增殖培养 收集到的样品，如果目标菌株比较多，可直接进行分离并进行增殖

3、培养。而如果目标菌株比较少，则需要对其进行富集培养。提供有利于所需菌株生长而不利于其它菌型生长的条件，使所需菌株大量繁殖，从而有利于分离它们。例如，生产脂肪酶产生菌时，使用植物油作为唯一碳源，可以更快而准确地分离出产生脂肪酶的菌株。（3）纯种分离 通过增殖培养还不能得到微生物的纯种，因为生产菌在自然情况下通常与各种菌混杂在一起，所以有必要进行分离纯化，才能获得纯种。分离纯化的方法常选用菌落分离法。把菌种制备成单孢子或单细胞悬浮液，经过适当的稀释后再在平板上进行划线分离。菌种经过多次从点到线的稀释，最后经培养得到单菌落。（4）生产性能的测定 纯种分离后需要对菌株的生产性能做测定，一般使用两步法，

4、即初筛和复筛。而作为育种的出发菌株，这种直接从自然界分离得到的菌株成为野生菌株以区别于人工育种得到的变异菌株。经过以上四步培养出的菌株即为出发菌株，出发菌株的优劣对于菌种改造有着重要的影响，所以在增殖培养和纯种分离是培养基的选择很重要。我们需要在实验前对目标菌种有充分的了解，根据其特性配制培养基使之更好的和其他菌株分离。2.诱变育种 （工业菌种基因超级诱变技术的开发与应用研究）二战期间，由于青霉素高产菌株的急需，人们进行了最早的通过诱变技术筛选性能改进菌种的工作。突变泛指微生物细胞内遗传物质的结构或数量突然发生的可遗传的变化，突变往往导致产生新的等位基因及新的表现型。然而自然条件下基因突变的概

5、率非常低，所以我们采取人工诱变的方式使微生物发生可遗传的变异，然后通过选择作用保留下对我们有益的菌株，完成诱变育种。2.1诱变剂的类型（1）物理因素 物理因素有很多包括紫外线、X射线、射线、射线、射线以及快中子和超声波等。由于紫外线应用最为广泛,效果好，操作方便，我们在此对紫外线诱变做以详细介绍。一般诱变用15W低功率的紫外灯，这时灯光集中于2537A1，是较有效的诱变作用光谱。具体操作方法：在暗室中安装具有稳压装置的15W紫外线灯管，将5mL菌悬液注入直径9cm的培养皿中，放置在离灯管30cm左右的位置，培养皿底要放平，处理前赢先开灯20-30min，预热稳定。照射时启动电磁搅拌装置，以保证

6、照射均匀。一般微生物营养细胞在上述条件下几十秒钟即可死亡，因此要选用适当剂量照射。还应当注意的是，为了避免光复活作用，诱变后应再红光下操作，处理后的菌悬液若需进行增殖培养，也要用黑布包起来。（2）化学诱变剂化学诱变剂用量少、设备简单，所以今年来发展较快。但是一般的化学诱变剂都有毒且多为致癌物，所以在使用时应当格外小心谨慎。同一诱变剂对不同微生物或同一微生物不同条件下处理作用效果也不同，因此在设计实验时应认真考虑。我们根据化学因素的作用方式，可以把它分为碱基类似物、引起DNA和核苷酸组成成分变化的化合物和改变DNA结构的化合物三种。碱基类似物的作用原理是碱基类似物能够代替DNA结构中的四种碱基进

7、入到DNA中去，而又不妨碍DNA的复制，由于他们的化学结构改变了，就有可能引起变异。常用于诱变的碱基类似物有：5-溴尿嘧啶、5-溴脱氧尿核苷、2-氨基嘌呤等。引起DNA和核苷酸组成成分变化的化合物主要是指烷化剂和亚硝酸类物质。烷化剂类的诱变剂带有一个或多个活性烷基，此烷基能转移到其他分子中电子密度高的位置上去，所有这些物质通过烷化磷酸基、嘌呤和嘧啶与DNA作用。改变DNA结构的化合物能同DNA或RNA作用改变其化学结构，但又不形成共价键，引起突变。（3）其他因素诱变因素除物理因素化学因素外，还有抗生素、杀菌剂、脱氧核糖核酸和增变因子等，其中以抗生素应用最广。2.2诱变育种的步骤和方法诱变育种的

8、一般方法3，如图所示：从图中可以看出，诱变育种的一般过程与上述出发菌株的选择步骤基本一致，只是加入了诱变处理的操作。由于各种诱变剂都有其作用的特殊性，但是目前对绝大多数微生物表现各种性状的相应基因了解还很不够，所以要求通过选用诱变剂来达到某一性状的改变，还远远做不到。诱变剂的选择只能靠实际的工作经验。诱变处理的方法有单一诱变剂处理、紫外线和光照复活交替处理和复合处理。紫外线照射和光照复活交替的处理方法能够大大提高突变的概率；两种诱变剂复合处理的作用效果也要明显优于单一诱变剂处理。3.代谢调控育种代谢反应的协调对生命过程是绝对必需的，这种机制是的微生物对培养条件具有很强的适应性。典型的细菌细胞整

9、个遗传过程要形成1000多种酶。细胞的协调功能确保在任何特定的时刻只形成特定的酶。协调功能控制酶的合成量，一旦酶合成，其活性又受到激活因子和抑制因子的调节。因此尽管遗传基因不变，微生物根据环境变化有改变自身组成和代谢的惊人能力。环境虽不能改变其基因型但却影响着他的表现型。其调节机制主要是控制微生物产物的生产弹性和防止产生过量的中间产物。代谢的调控类型主要有诱导、碳分解代谢产物调节、氮分解代谢产物调节、磷硫的调节、反馈调节。3.1代谢的产物调节代谢产物的调节主要包括初级代谢产物的调节和次级代谢产物的调节。初级代谢产生细胞中的小分子，这些小分子是合成生物大分子的材料或辅酶。为了控制支路的反馈调节就

10、要采取两种操作：降低抑制型或阻遏型终产物的浓度。初级代谢产物调节的方式主要有：（1）降低产物的浓度 在一些较为简单的代谢途径中用这种办法能积累中间产物。在一条从A到E的代谢途径中，如果要积累化合物C，首先要获得缺失酶C的营养缺陷型突变菌株，这样的突变株需要E存在才能生长，添加低浓度的E使得生物体不能积累到有抑制或遏制水平的E。这样C就会积累。（2）反馈抗性突变 用所需化合物的毒性类似物容易分离出某个酶反馈一直抗性或酶合成系统反馈阻遏突变株。讲培养物涂布到含有这种抗代谢物的平皿上能杀死大多数细胞从而筛到抗性突变株，其中有些可能过量代谢。次级代谢产物是由很少的一些微生物产生的，尽管他们对于某些特殊

11、的微生物很重要，但在生命过程中没有普遍性的功能，他们通常是相关化合物的混合物。次级代谢调节的方式主要有：（1）酶的去阻遏 次级代谢物产生的一个特点为次级代谢物在分批培养的菌体快速生长阶段通常不产生而在后期形成。在恒化器的稀释率无限降低的过程中，酶的专一活力到达一个峰值后开始降低。限量添加不同的营养物酶活在不同的生长速率下达到峰值。（2）反馈调节 次级代谢物的积累能反馈调节他们自身合成过程，初级代谢终产物反馈调节初始代谢共同的酶。（3）碳源分解代谢产物调节 在碳源代谢代谢阻遏机理被普遍认识之前，抗生素发酵生产中也发现了碳源分解代谢阻遏。在青霉素生产发现早期就发现能被快速利用的葡萄糖是生产青霉素的

12、最差碳源，乳糖虽然仅能呗缓慢用于生长，却有利于青霉素的形成。经典的化学培养基含有葡萄糖和乳糖，在这样的培养基中产黄青酶在生长期时快速利用葡萄糖，当葡萄糖耗尽后，乳糖利用的阻遏去除了，生长期开始缓慢利用乳糖，抗生素便能够大量合成。此外还有调节氮源，调节磷以及对微生物进行诱导等方法。3.2营养缺陷型的筛选营养缺陷型是指丧失了合成某种营养物质的能力，在培养基中若不外加这种营养成分就不能正常生长。筛选出营养缺陷型的方法，一般是经诱变后经过中间培养淘汰野生型，检出营养缺陷型和确定生长谱等。在实际应用中，可根据需要灵活运用。（1）中间培养 由于发生突变后，变异的细胞需要培养一代至几代才能够完全分离，为了减

13、少以后筛选中再产生这种分离的混种现象，所以在缺陷型首次分离前，先进行中间培养是必要的。中间培养基可以是完全培养基或者补充培养基，培养过夜即可。 （2）淘汰野生型 淘汰野生型祈祷浓缩缺陷型的作用，主要方法有抗生素法和过滤法。抗生素主要是用青霉素，将中间培养后的菌种在基本培养基上划线培养，野生型可大量生长，而突变型由于营养缺陷生长受到抑制，这时用青霉素处理，杀死正在分裂繁殖的野生型，而保留了突变型。用离心法可将未被破坏的细胞分离出来。过滤浓缩法应用于霉菌和链球菌。在基本培养基上涂布孢子，野生型可以快速生长，而缺陷型不能生长，用过滤法可将未生长的缺陷型孢子分离出来。（3）营养缺陷型的检出 检出方法很

14、多，包括逐个测定法、夹层检出法、限量补充培养基检出法、影印培养法等。（4）确定生长谱 经过检出后，需要测定是什么缺陷型。将生长斜面用无菌水洗下或培养液离心，沉淀物用生理盐水洗涤后制成细胞悬浮液。去0.1mL涂布在MM上，也可以与已融化并冷却到50的MM混匀，倒入平皿中。然后在含菌体平皿上放置少量试验物质，观察生长情况，确定缺陷型的类别。4.基因重组育种基因重组广义而言是指基因型不同的个体交配产生不同于亲本基因型的个体，这表明进行了遗传信息的重组。微生物的基因重组可以这样来分类：通过双亲细胞的融合，涉及整套染色体基因的重组；通过双亲细胞的沟通。涉及部分染色体基因的重组；双亲细胞不接触，但涉及个别

15、或少数基因的重组，如转化和转导。4.1杂交育种的方法以酵母菌的杂交为例，步骤包括酵母子囊孢子的形成，子囊孢子的分离和酵母杂种的获得。（1）子囊孢子的形成 产包子酵母在长期的实验室条件下培养会引起省包子能力衰退，要形成子囊孢子就需要用生孢子培养基。应为往往在饥饿条件下才会减数分离形成孢子，所以生孢子培养基通常营养是比较缺乏的。（2）子囊孢子的获得 用几毫升蒸馏水洗下斜面或平皿上的子囊，加入1mL液体石蜡和5g硅藻土，在匀浆皿中研磨10分钟，然后在离心机中4500r/min离心10分钟，子囊孢子集中在最上一层石蜡中。（3）取集中子囊孢子的液蜡0.05mL，加入0.05mL15%的明胶，涂CM板，就

16、可获得单倍体菌落。如果要进行杂交可用显微操作器将子囊孢子配对，进行微滴培养，使之发芽结合形成合子。4.2转化与转导转化与转导也是通过遗传物质间的重组而达到育种目的的方法，但他们不是通过两亲株直接接触，而是通过其他手段达到重组目的的一些方法。转化育种是把对遗传起决定作用的DNA从甲菌中拿出来又放到乙菌中去，甲菌的部分遗传性状转移到乙菌中。其步骤包括DNA的提取，转化操作及转化体的检出。转导是噬菌体做媒介，将一个细胞的遗传物质传递给另一个细胞的过程。与转化一样，无需细菌细胞直接接触。转化中突出的问题是供体DNA易为受体DNA酶所破坏，难以进入，但转导是借助噬菌体将DNA带入感染记住，使之改变特性。

17、所以转导的关键是选择合适的噬菌体。4.3原生质体的融合原生质体育种技术主要有原生质体融合、原生质体转化，原生质体技术育种是在经典基因重组基础上发展的一种新的更为有效的方法。原生质体融合育种杂交率高、瘦结合型或致育型的限制较小、遗传物质传递更为完整等优点。原生质体融合的步骤：（1）标记菌株的筛选和稳定性验证；（2）原生质体制备；（3）等量原生质体加聚乙二醇促进融合；（4）涂布与再生培养基，再生出菌落；（5）选择性培养基上划线生长，分离验证，跳去融合子进一步试验、保藏；（6）生产性能筛选。5.基因工程育种基因工程又称重组DNA技术，是指讲一种或多种生物的基因与载体在体外进行拼接重组，然后转入另一种生物，是受体按人们的愿望表现出新的性状。基因工程最典型的操作一般包括三个步骤：外源DNA的获得与酶切、外源DNA与经同样酶切的载体的连接、连接产物转化受体细胞级阳性转化子的筛选。主要材料有外源DNA、载体、DNA体外重组用的酶及宿主细胞。江南大学王正祥等人利用DNA重组技术或得了一种高发酵产率的酒精酵母4。其主要思想是将酸性蛋白酶基因通过酵母的整合型表达载体转化到工业酒精酵母中，酸性蛋白酶的表达可以水解原料中的蛋白质，增加醪液中酵母可吸收性氮，促进酵母的增殖。应用这种重组酵母可提高酒精发酵速率，发酵周期缩短38%，而且并减少底物流失和能耗，提高原料出酒率，相对出酒率提高