吴乃虎《基因工程原理》总复习提纲

1、基因工程原理总复习提纲第一单元基因的基本概念和现代概念一、基因与基因工程概述基因工程诞生的理论基础40年代确定了遗传信息的携带者，即基因的分 子载体是DNA,而不是蛋白质。50年代揭示了 DNA分子的双螺旋结构模型和半 保守复制机理，从而解决了基因的自我复制及传 递；50年代末和60年代初相继提出了“中心法则” 和操纵子学说并成功地破译了遗传密码，从而阐 明了遗传信息的流向和表达问题。基因工程诞生的技术基础DNA分子的切割与连接技术(核酸内切限制酶和 DNA连接酶的发现)；测序技术(DNA核酸序列的结构及分析技术)；克隆载体构建技术(质粒载体；噬菌体载体;柯 斯载体;单链噬菌体载体;噬菌粒载体

2、；遗传转化技术(大肠杆菌转化体系)；琼脂糖凝胶电泳技术；Southern杂交技术；基因的定义基因的数量二、基因的命名法通则细菌基因的命名法酵母基因的命名法线虫基因的命名法果蝇基因的命名法植物基因的命名法脊椎动物基因的命名法人类基因的命名法三、基因的结构基因的组成部分编码区(coding region);非编码区(noncoding region);启动区(promoter region);终止区 9terminator).原核基因定义原核基因的组成：启动区序列区转录区序列区(5, 一 UTR; cDNA序列 区-编码区；3, 一UTR); 终止序列区真核基因定义真核基因特征：真核基因编码区中往

3、往含有非编码序列的内含子(intron);真核基因是单顺反子，编码 单基因产物；成熟mRNA分子的5-，端有 一个帽的结构，3，-端有一段 poly(A)尾巴。真核基因的组成：启动子序列区终止子序列区 转录序列区真核基因初级转录本的组成：5，-UTR序列区表达子(exon) 内含子(intron)3, -UTR序列区真核基因成熟mRNA的结构组成：5-端帽的结 构;5, -UTR;编码序列区;3, -UTR;3,-端 poly(A)尾 巴。四、基因的类型根据拷贝数分类单拷贝基因多拷贝基因根据表达特性分类组成型基因(Constitutive gene)又叫看家基因 (Housekeeping g

4、ene)诱导型基因(Inducible gene)根据产物类型分类结构基因(Structural gene)调节基因(Regulator gene)根据实验用途分类选择基因(Selectable gene)标记基因(Marker gene)报告基因(Reporter gene)根据排列组合特性分类基因家族(Gene family)基因簇(Gene cluster)弧独基因(Orphons)根据细胞类型分类原核基因(Prokaryotic gene)真核基因(Eukaryotic gene)根据结构特点分类断裂基因(Split gene)移动基因(Movable gene)假基因(Pseudog

5、ene)根据序列重复特性分类重叠基因(O verlapping gene)嵌套基因(Nested gene)重复基因(Repeated gene)9.根据同源性分类d.程序基因扩增(Programmed gene同源基因(Honologouse gene)共生同源基因(Paralogous gene)amplipication)e.生物进化基因扩增直向同源基因(Orthologous gene)孤独基因家族(Orphon family)10.根据碱基突变分类野生型基因(Wild type gene)突变型基因(Mutant type gene)五、基因图与基因作图1. 基因图(gene map

6、)包括： a.遗传图(genetic map) 厘摩(centimorgan,cM)遗传图距或是染色体上基因间的距离 以摩尔根单位表示(morgan unit),摩尔 根单位等于100%的重组率(交换值)。八、基因表达正义链与反义链基因表达定义：基因通过DNA的转录和RNA的转译等过程，将其 遗传信息转变成蛋白质(RNA转录本)的过程，叫做 基因表达。基因表达产物有些基因如tRNA基因和rRNA基因最终表达产 物是RNA大部分基因的表达的最终产物是蛋白质基因表达的时空特异性基因表达活性的调控1厘摩(cM)则等于1%的重组率。人类基因组1cM相当于1000Kb拟南芥基因组1cM相当于290Kb蕃

7、茄基因组1cM相当于750Kb小麦基因组1cM相当于3500Kb物理图(physical map)限制图(restriction map)2.基因作图(gene maping)六、DNA非编码序列的功能1.中心法则质疑九、基因克隆与基因工程克隆的词义基因克隆与DNA克隆基因克隆的方法互补作用基因克隆cDNA克隆基因组DNA克隆基因定位克隆基因克隆与基因分离第一单元DNA分子的体外切割与重组RNA的功能假基因的功能反义RNA的功能RNA的干扰作用微 RNA(micro RNA)的功能核糖开关表观遗传学遗传印记(Genetic imprinting)遗传印记与遗传性疾病表观遗传信息层(Epigen

8、etic lager of information)生命有机体遗传信息的第三层次， 它贮藏在围绕DNA分子周围并与DNA分子结 合的蛋白质及化学物质中，表观遗传信息层可 能比RNA甚基因更为重要。甲基化作用与遗传印记甲基化药物与癌症治疗七、基因扩增一、基因克隆涉及的一些重要的酶核酸酶(Nuclease)核酸外切酶核酸内切酶蛋白酶(Proteinase)基因工程中涉及的主要的酶2型核酸内切限制酶DNA 连接酶(Ligase)DNA聚合酶反转录酶(Reverse transcriptase)多核苷酸激酶(Polynucteotide kinase)末端转移酶(Terminal transferas

9、e)核酸外切酶(Exonuclease)碱性磷酸酶(Alealine phosphatase)小牛肠碱性磷酸酶(CIP)细菌碱性磷酸酶(BAP)Tag DNA 聚合酶(Tag DNA polymerase)基因增加与基因减少基因扩增的五种情况：PCR基因扩增克隆基因扩增环境压力基因扩增一、核酸内切限制酶与DNA分子的体外切割寄主控制的限制与修饰现象核酸内切限制酶及其类型：1型核酸内切限制酶2型核酸内切限制酶3型核酸内切限制酶2型核酸内切限制酶的特点识别序列粘性末端(Cohesive ends)平末端(Blunt ends 或 flush ends)平末端连接方法：T4 DNA连接酶连接法；同聚

10、物加尾法；衔接物(Linker )连接法；DNA接头(Adapter)连接法。同裂酶与同尾酶同裂酶(Isoschizomers)具有同样的识别位点，产生同样的粘性末端， 但是从不同的细菌中分离出来的类核酸内切限 制酶。同尾酶(Isocaudamers)一组来源不同、识别序列各异，但能够切割形 成相同的粘性末端的核酸内切限制酶。异裂酶(Neoschizomer)这是一组来源不同，但具有相同的识别序列和 不同的切点(cleave point)的核酸内切限制酶。影响核酸内切限制酶活性的因素三、DNA连接酶与DNA分子的体外连接DNA 连接酶(DNA ligase)简称连接酶，是指利用ATP分子中的r

11、-磷酸基团为 能量，催化在两条并排DNA链的5,-磷酸基团和3, -羟基之间或是双链DNA单链断裂位置形成一个磷 酸二酯键，而使两个DNA片段共价连接起来的一种 酶。DNA分子连接的条件：3 -端具有一个游离的羟基(-OH);另一条DNA链的5,-末端具有一个磷酸基团 (-P);连接反应需ATP的参加。影响DNA分子体外连接反应的因素：ATP浓度；连接酶浓度；反应时间；反应温度；插入 片段与载体分子间的摩尔比值。第三单元：基因克隆的载体一、质粒载体质粒载体定义质粒DNA分子的构型及其在凝胶电泳申泳中的位置SC构型(双链、共价、闭合的超盘旋DNA)-走在 凝胶最前面；OC构型(单链断裂的开环DN

12、A)-走在凝胶最后 面；L构型(双链断裂呈线型DNA)-走在凝胶的中间 位置。质粒载体的组成：具有复制区或复制因子(replicator)具有1-2个抗菌素抗性基因；具有若干种限制酶的单一识别位点；具有较小的分子量和较高的拷贝数。质粒DNA的自我转移质粒DNA的迁移作用(mobilization)迁移作用的分子机理质粒的拷贝数质粒的不亲和性质粒DNA的复制与拷贝数的控制质粒复制控制的分子模型：抑制蛋白稀释模型；自体阻遏蛋白质模型严紧型质粒与松驰型质粒质粒载体的类型：插入失活型载体表达型质粒载体；正选择质粒载体 重要的质粒载体：pBR322质粒载体：pUC质粒载 体。二、噬菌体载体噬菌体的一般生

13、物学问题；烈性噬菌体与温和噬菌体；混浊型噬菌斑和清亮型噬菌班；噬菌体的溶源化与溶源性细菌；噬菌体的整合作用与原噬菌体；超感染免疫入噬菌体载体cos位点(粘性末端位点)入噬菌体载体构建原理；插入型入噬菌体载体与替换型入噬菌体载体；具有内删除作用的入噬菌体载体；入ZAP载体的结构：含有一个发生内删除作用的pBluescript噬菌粒 的DNA区段；在pBluescript的两侧含有f的起始子(I)和终止 子(T)；在pBluescript的内部具有LacZ基因；在LacZ基因内部具有两端分别为T3和T7噬 菌体启动子和多克隆位点区(MCS);内删除作用的原理入重组体DNA分子的体外包装体外包装原理

14、包装限制入噬菌体载体的克隆能力(23Kb理论值)三、柯斯质粒载体柯斯质粒载体的定义柯斯质粒载体的组成部分：质粒的复制起点；带有1-2个抗菌素抗性基因；来自入噬菌体DNA的cos位点；来自质粒的相当数量的核酸内切限制酶单一识 别位点柯斯质粒载体的特点：来自入噬菌体的特点，体外包装后可高效转导感 受态细胞，导入细胞后可重新环化，无法进入溶 菌周期，因此无法形成子代噬菌体。具有质粒载体的特点，带有质粒复制子，可像质 粒一样复制，在有氯霉素下扩增；具有抗生素抗 性基因，因此可像质粒载体一样筛选重组体。具有高容量的克隆能力(31-45Kb)四、单链噬菌体载体M13单链噬菌体的一般生物学特性 M13克隆体

15、系列组成：a. M13克隆载体；b. M13的寄主菌株X-gal显色反应原理顺反子内互补作用(a-互补作用)M13载体系列的优点：制备单链DNA序列重组子可用组织化学检测LacZ基因上有一段多克隆位点序列区(MCS)可定向克隆五、噬菌体展示载体构建噬菌体展示载体的原理丝状噬菌体展示载体噬菌体表面展示文库六、噬菌粒载体噬菌粒载体的定义噬菌粒载体的组成：来自质粒部分：a.来自ColE 1的复制起点(ori);b.抗菌素抗性标记；来自噬菌体部分：a. f!单链噬菌体的复制起点(ori);与形态发生有关的DNA序列。噬菌粒载体的优点：a.可像质粒一样复制，产生双链 DNA;复制方向可改变，形成单链DN

16、A，不必亚克隆，可直接用于测 序；可产生大片段的外源单链DNA。pBluescript 噬菌粒体外转录载体定义；pBluescript 结构特点c. pBluescript噬菌粒载体的组成：*a.具ColE1质粒的复制起点(ori)，可产生双 链 DNA;*b.具Ampr抗性基因，提供转化子筛选；*c.具pUC19的多克隆位点(MCS)，克隆外源 基因；*d.在MCS两端具有T3和T7启动子，指导 外源基因录*e.具LacZ基因，可组织化学选择重组子；*f.具M13单链噬菌体的复制起点，可产生单 链DNA亚克隆可进行测 序第四单元基因克隆与基因分离、基因克隆基因克隆的概念基因克隆与DNA克隆基

17、因克隆的基本过程基因文库的类型(基因组文库与cDNA文库)基因克隆与分离的实验策略物理策略生物学策略克隆样品的选择：从蛋白质出发；从mRNA出发；从DNA大分子出发。基因文库库容测算cDNA基因克隆概述cDNA文库的构建：第一步：分离细胞总RNA，根据poly(A)尾巴用 oliga(dT)柱分离纯化出mRNA;第二步：用适当的引物，通常用oliga(dT)和反转 录酶合成第一链 cDNA；第三步：双链cDNA的获得:用RNaseH酶降解 mRNA-cDNA分子中的mRNA链,再用第 一链为模板合成第二链cDNA。第四步：与适当载体重组，将重组体分子导入大 肠杆菌寄主细胞增殖，即构成cDNA文

18、 库。cDNA克隆的优越性：*a.以mRNA出发，对一些在增殖过程中 不经过DNA中间过程的RNA病毒， 特别适用；*b.从mRNA出发，其复杂度要比蛋白质 低 10-100 倍；*c.假阳性比例低。每一个克隆都含有一个mRNA;*d.具有特殊用途：克隆的真核基因在原核 细胞中表达；*e.测定基因核苷酸序列;发育调节基因表 达特性分析，即时空特异性。d.全长cDNA的合成基因组DNA克隆cDNA克隆的局限性基因组DNA克隆的过程：*a.分离基因组DNA;*b.体外切割片段化(超声波处理;机械切割；限 制酶局部消化)与适当载体重组；*c.转化大肠杆菌细胞增殖即构成基因组文库。基因组文库的优越性：

19、*a.基因类型的全面性，一个完整的基因组文 库中，该生物有机体的基因都有一个克隆；*b.基因结构的完整性，包括启动子、表达子、 间隔子、终止子等所有结构；*c.基因的恒定性，即不受材料组织部位和发育 阶的影响；*d.基因的功能性，适于研究基因的表达与调控。基因的定位克隆(用于分离编码产物未知基因的方法 之一)定位克隆的程序和条件分子标记RFLP在定位克隆中的应用RFLP作图过程染色体步移大尺度物理图谱的构建目的基因的分离分离克隆基因的若干方法：应用核酸探针分离克隆的目的基因应用差别杂交法和扣除杂交法分离克隆的基因PCR技术.mRNA差别显示技术(产物未知基因分离方法)表达文库技术酵母双杂交体系

20、(Y2H，产物末未知基因分离方 法)定位克隆分离产物未知基因DNA标签法分离产物末未知基因应用DNA芯片技术应用mRNA差别显示技术分离产物末未知基因mRNA差别显示的原理：基本原理是，以多细胞(或但组织)的总RNA反 转录成的cDNA群体为模板，通过合理设计的 5,端与3,端引物的配对组合，将细胞(或组织) 中表达的约15%的基因片段扩增，直接显示在 DNA测序胶上，从而找出一对细胞或组织中表 达有差异的cDNA片段。*a.高等真核生物的mRNA3，端大多具有 poly(A)尾巴,故可用oligo(dT)作引物，反 转录成cDNA;*b.根据mRNA poly(A)前2个碱基可把所有 的mR

21、NA分成12类群，如按一个碱基可 归为3大类群,3,端作锚定引物也就为3 大类群；*c.根据数理统计，5端的随机引物需80种， 因此80 x3=240组合对;就有可能分离到 目的基因。基因差异表达(differential expression)：在生物个体发 育的不同阶段，或在不同组织或细胞中 发生的，不同基因按时间、空间进行有 序表达的方式，叫做基因差异表达。k. mRNA差别显示技术的优点和缺点应用DNA标签法分离产物未知的基因原理：DNA标签法(DNA tagging)，是根据DNA的插 入作用发展出来的。其原理：当一段己知的特定DNA序列插入到基因组中目 的基因的内部、或附近，便会诱

22、发该基因发生突 变，并最终导致表型变化，形成突变体(突变株)以特定的己知序列为DNA杂交的分子探针，从 突变株的基因组DNA文库中筛选到突变的基 因。利用标签序列以外的突变基因序列为探针，再从 野生型基因组DNA文库中克隆出野生型的目的 基因。类型：转位子标签法：可分为一元转位子标签法 (One-element tagging systebm)二元转位子标 签法(Two-element tagging system)T-DNA标签法酵母双杂交体系(Y2H)分离产物未知的基因转录因子定义转录因子的结构：(a) DNA结构域(DNA-BD)转录调节域：(转录激活域 (AD);转录抑制域)核定位信号

23、区寡聚化位点酵母半乳糖苷酶基因的转录因子-GAL4E.coli-Yeast穿梭质粒(定义)穿梭质粒(Shuttle vetor):是一类人工构建的具 有两种不同的复制起点和选择记号，可在两种不同的寄主细胞中进行复制和存 留的质粒载体。这种质粒载体可以携带外源DNA在原核细胞和真核细胞往返穿梭。j.酵母双杂交体系构建两种穿梭质粒载体DNA-BD质粒载体(具有色氨酸编码基因 Trp)产生第一种杂种蛋白AD质粒载体(具有亮氨酸编码基因Leu) 产生第二种杂种蛋白酵母双杂交体系的寄主菌株特点：*a.丧失了表达内源GAL4转录因子的 能力；*b.具有LacZ报告基因；*c. trpl和ler2转化标记，

24、在缺少色氨 酸和亮氨酸的培养基中无法生长。酵母单杂交体系(Y1H)原理：酵母单杂交体系是一种体内分析系统，用 于分离与顺式作用调控元件结合的特定蛋白质之 编码基因。许多真核转录因子都是结构上可以分开、功能上 相互独立的两个结构域组成。用一种未知蛋白质代替BD和AD形成融合蛋白 质，如果此未知蛋白质能够与调控序列结合，它 就可以携带AD靠近起始复合物，从而起动基因 转录。通过筛选cDNA-AD表达文库，可以分离 与鉴定新的DNA结合蛋白质。酵母三杂交体系(Y3H)第五单元新基因的功能鉴定一、新基因功能鉴定的技术转基因技术与基因过表达技术：a.转正义基因(目的 基因)转基因(目的基因)的过表达。基

25、因剔除技术(基因打靶)RNA干扰技术与新基因功能鉴定基因序列同源比对技术，验证新基因的功能蛋白质产物的结构与功能的检测基因定点突变途径探索新基因的功能报告基因技术反义RNA技化学遗传学方法；遗传互补法基因表达系列分析法噬菌体表面展示技术与酵母双杂交技术二、同源性分析与基因功能鉴定序列同源性与相似性、一致性及保守性概念基因序列同源性比对技术原理a. DNA分子的核苷酸序列或是蛋白质多肽链的氨 基酸序列，具有高度相似性或显著相似性的基因 或蛋白质，往往是同源的。亲缘关系密切的或相关的基因，具有相似的(或 相近的)核苷酸序列结构，可以通过机算机的检 索已经测序并己知其生物学功能的其它物种的 相关基因

26、(同源基因)并根据核苷酸序列比对分 析所得出的相似性程度，推断待鉴定的新基因之 可能的生物学功能。同源基因的类型：直向同源因(Orthologousgene)共生同源基因(Paralogous gene)三、基因失活与新基因功能鉴定同源重组与基因失活同源重组(Homologous recombination)：是指两 条同源DNA序列之间发生的遗传信息的重组或 交换的过程。.主要技术：*a.醇酵母缺失盒技术；*b. 基因剔除技术酵母缺失盒技术与新基因功能鉴定，其核心是使 用一种特殊的分子结构即酵母缺失盒，通过同源 重组途径，使待鉴定中的目的基因失活。酵母缺失盒的分子结构：*a.中央部分是一种抗

27、菌素抗性基因的编码序 列；*b.在此基因的两侧各有一个核酸内切限酶的 识别位点(R1和R2);*c.在缺失盒的5,端，位于限制位点R1和抗菌 素抗性基因之间，还有一个酵母启动子。2基因剔除(基因打靶)与新基因功能鉴定基因剔除技术主要应用于哺乳动物，其原理也是 利用同源重组使基因失活。基因打靶(Gene targeting)定义：使外源基因定 点地整合到核基因组上的一种特殊的基因工程 技术。也叫做基因定点重组或基因剔除基因打靶的分子基础：通过转染的细胞中发生的 外源打靶基因与核基因组上的目标基因之间的 DNA同源重组事件，使外源打靶基因定点地整 合到核基因组的特定位置上，从而达到改变细胞 遗传特

28、性的目的。基因打靶的类型：(a)插入型基因打靶；(b)取代型基因打靶基因打靶载体(Gene targetion vector)基因打靶的过程基因打靶的应用：(a)新基因功能鉴定；提高基因表达效率；遣遗传疾病的基因治疗四、转译抑制与新基因功能鉴定1. RNA 干扰(RNA interference, RNAi)概念：近年来研究表明，一些小分子量的外源双链RNA(dsRNA)当其导入寄主细胞之后，便可促进 与其同源的内源mRNA发生特异性的降解作 用，从而高效特异地阻断体内相应基因的表达活 性，在细胞内发生奠基因剔除作用。这种RNA水平的基因抑制，是生物界普遍存在 的RNA水平调控基因表达的一种方

29、式，提供了 一种特异性失活功能基因的方法。研究表明，RNAi广泛存在于真菌、拟南芥、水 螅、斑马鱼等大多数真核生物中，是生物体内抵 御外耒来感染们的重要保护机理。RNAi的应用：新基因的功能鉴定;有望在疾病防 御和治疗的新药开发上发挥重要的作用。有关的名词术语和略语dsRNA:双链 RNA(double stranded RNA)siRNA:小分子量干扰 RNA (small interference RNA)RISC: RNA诱导的沉默复合物(RNA inducedsilencion complrx)RdRP : 依赖于 RNA 的 RNA 聚合酶 (RNA-dependent RNA po

30、lymerase)PIGS :转录后基因沉默(Post-transcripotional gene silencing)TIGS:转基因诱导的基因沉默(Transgene-induced gene silencing)VIGS:病毒诱导的基因沉默(Virus-induced gene silencing)Dicer:切丁酶，是一种RNase111样的核酸内切酶 (Rnase111-Like)。能把 dsRNA 切割成 21-25bp的小分子量的干扰RNA,即 siRNA， 但这是需要能量ATP的过程。RNAi的分子机理研究依赖于RdRP的RNAI途径不依赖于RdRP的RNAi途径关于Dicer

31、和Slicer酶功能的作用机理RNAi 的触发剂(Triggers of RNA silencing)siRNA的来源：由人工导入细胞的dsRNA经Dicer酶切割成的 siRNA由浸染的RNA病毒复制的dsRNA经Dicer酶切 割成的siRNA由脂质体运点的siRNA由小分子RNA前体(MicroRNAprecusor)等产生 的dsRNA经Dicer酶切割由psiRNA载体持续合成的siRNApsiRNA克隆载体RNAi的新基因功能鉴定的优越性*a.效率高，无需筛选突变体因此工作量小；*b.具有靶向性，根据psiRNA载体插入序列的 方向断定被失活的目的基因的功能；*C.具有多重失活功能

32、，既可特异地使某一特 定基因沉默，也可同时使该基因家族的多个 成员沉默；*d. RNAi技术不会导致致死效应，便于研究植 物生长发育的相关基因的表达活性与功能。五、基因表达系列分析与新基因功能鉴定基因的差异表达(Differntial expression of gene)看家基因(House-keeping gene)发育调节基因(Developmental regulatedgene)基因的差异表达基因表达系列分析法的定义基因表达系列分析法(Serial analysis of gene expression),简称SAGE，它是一种基于2型核酸内 切限制酶和3型核酸内切限制酶，对于cDN

33、A分子 联合切割反应的基因表达分析法。此法可快速、有 效、系统、全面地检测某种特定组织或细胞中基因 表达的状况，适于对大量基因的差异表达状况进行 系统的分析。SAGE技术是使用惟一的序列标签去鉴定每一种 mRNA分子。可同时检测许多种基因在同一时空条 件下是否表达及其表达水平，而还可比较不同组织 不同条件下，基因表达的差异。原理基因表达系列分析法的基本原理是，cDNA分子中 同一种核酸内切限制酶位点旁侧的9个核苷酸序列， 可以代表一种cDNA分子的序列结构特征。根据这 种长度为9bp的核苷酸序列，能够区分基因组中的 95%的基因。(49=262144种mRNA分子)所以这一 段序列可以作为特定基因的标签，特称之为SAGE 标签。应用特定的技术程序，能够制备某一组