DB36_T 1190-2019 灌木辣椒种质SSR分子标记鉴定技术规程(高清无水印-可复制）

1、ICS 65.020.01B 05DB36江西省地方标准DB36/T 11902019灌木辣椒种质SSR 分子标记鉴定技术规程Technical regulations for identification of capsicum frutescens germplasm by SSR molecular marker2019 - 12 - 27 发布2020 - 06 - 01 实施江西省市场监督管理局发 布DB36/T 11902019DB36/T 11902019I 目次前言II1 范围12 规范性引用文件13 术语和定义14 原理15 主要仪器设备与试剂耗材26 试剂配制27 核心引物

2、28 参照种质29 操作步骤210 指纹比对411 结果判定4附录 A（资料性附录） 主要仪器设备与试剂、耗材5附录 B（规范性附录） 试剂配制6附录 C（规范性附录） 核心引物8附录 D（资料性附录） 参照种质9 前言本标准按照GB/T 1.1-2009给出的的规则起草。本标准由江西省农业农村厅提出并归口。本标准起草单位：江西省农业科学院蔬菜花卉研究所。本标准主要起草人：周坤华、方荣、陈学军、袁欣捷、郭丽虹、罗海平、黄国东、袁青云、涂年生。II DB36/T 11902019DB36/T 11902019 PAGE 9 PAGE 8 灌木辣椒种质 SSR 分子标记鉴定技术规程范围本标准规定了

3、利用简单重复序列（Simple sequence repeats，SSR）分子标记法快速鉴定灌木辣椒（Capsicum frutescens L.）种质技术有关的术语和定义、原理、主要仪器设备与试剂耗材、试剂配制、核心引物、参照种质、操作步骤、指纹比对、结果判定。本标准适用于灌木辣椒（Capsicum frutescens L.）种质的SSR分子指纹比对鉴定。规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本使用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB/T 3543.2农作物种子检验规程 扦样术语和定义下列术语和

4、定义适用于本文件。3.1待测种质 germplasm to be tested待鉴定的疑似灌木辣椒种质，由送检人提供。3.2指纹图谱 fingerprint采用SSR引物扩增出的DNA片段，通过变性聚丙烯酰胺凝胶电泳，得到不同大小的DNA片段图谱。3.3指纹比对 fingerprint intercomparison将待测种质与参照种质的SSR指纹图谱进行比对，分析待测种质与参照种质的SSR指纹是否有差异，并确定其大小。原理SSR分子标记，广泛分布于辣椒基因组中。不同种质间每个SSR位点重复单位的数量可能不同，因而形成SSR标记多态性。由于每个SSR位点两侧的序列一般是相对保守的单拷贝序列，因

5、此，可根据其两侧的序列设计一对特异引物，利用PCR技术对两条引物间的DNA序列进行扩增。通过电泳分离得到大小不同的扩增产物片段，经硝酸银染色加以区分。因此，根据SSR位点的多态性，利用PCR扩增和电泳技术可以鉴定灌木辣椒种质。主要仪器设备与试剂耗材主要仪器设备与试剂、耗材参见附录A。试剂配制试剂配制方法参见附录B。核心引物从120对SSR引物筛选出来，可以鉴定灌木辣椒种质的特异性SSR引物。相关信息参见附录C。参照种质参照种质为用于与待测种质进行指纹比对的若干标准灌木辣椒种质和一年生辣椒种质（Capsicum annuum L.），在进行等位变异检测时，应同时包括相应参照品种。参照种质参见附录

6、D。操作步骤样品准备种子样品的扦样和保存，按照GB/T 3543.2的规定执行。选取每个待测种质和参照种质的样株10株， 每株取新鲜、幼嫩、健康叶1片混合制样并做好标记，用纱布包好并置于液氮罐中。DNA 提取采用改良CTAB法或试剂盒法提取样品DNA，试剂盒法按试剂盒说明书进行提取。改良CTAB法DNA提取步骤如下：将混合样品放入研钵中用液氮磨成粉末，然后迅速将粉末勺入2mL离心管的2/5处，加入预热至65 的CTAB提取液1mL（加入前先加1%的-巯基乙醇），充分混匀后将离心管放入65水浴锅中，水浴60min，每隔5min摇荡一次，使之充分反应；取出离心管静置数分钟后放入4 高速低温离心机中

7、，13000rpm离心15min。取上清液至另一离心管中，加入等体积的酚/氯仿/异戊醇（25:24:1）后，充分混匀，静置10 min，13000 rpm离心10 min； c）取上清液800L置于新的1.5mL离心管中。加入2/3体积冷的异丙醇，轻晃，置于-20冰箱30 min或者过夜；取出步骤c的离心管在4条件下，13000rpm离心10min，弃上清。用75%乙醇洗涤DNA两次， 自然晾干；向1.5mL离心管中加入ddH2O 200 L溶解DNA，再加10mg/mL的RNaseA 5L，置37水浴60min 。加入预冷的氯仿:异戊醇（24:1）200L混匀，静置10min，12000 r

8、pm离心10 min；取上清加入1/10体积的NaAc（3mol/L），2倍体积冷的无水乙醇。-20放置30min或更长时间， 在4下13000rpm，离心15min。用冷的75%乙醇洗涤沉淀两次，自然晾干；加200L灭菌1TE溶解DNA，并用核酸测定仪检测DNA浓度，将DNA稀释到20ng/L，并放入-20冰箱保存备用。PCR 扩增PCR 反应体系PCR反应体系：总体积10L，其中1LBuffer（10），0.8 LMg2+（25 mM），0.2LdNTPs（10mM）， 0.4L上游引物（10mM），0.4L下游引物（10mM），0.1LTaq酶（5U/l），2LDNA模板（20ng/L）

9、，5.1Ldd H2O。PCR 反应程序PCR反应程序：（1）94 预变性4min；（2）94 变性45s；（3）按附录C 推荐的引物退火温度退火45s；（4）72 延伸45s；（5）重复步骤（2）（4），共35个循环；（6）72延伸10min；（7） 4 保存。PCR 扩增产物检测变性聚丙烯酰胺凝胶垂直电泳玻璃板处理用自来水分别清洗干净长、短两块玻璃板，晾干后用95%酒精淋洗玻璃板表面，晾干后用擦镜纸将500L亲和硅烷工作液均匀涂在长玻璃板上，将500L剥离硅烷均匀涂在带有凹槽的短玻璃板上。约4 min5 min后，用蘸有95%酒精的擦镜纸擦拭玻璃板2次，除去玻璃板上多余的亲和硅烷和剥离硅烷

10、。组装玻璃板将长板平放，用厚度为 0.4mm 干净的垫片放于玻璃板的左右两侧，将带有凹槽的短板压于其上形成胶室，并使两块玻璃板底部和垫片对齐，然后用夹子夹紧两侧，用水平仪检测玻璃胶室是否水平。制胶取75mL的6%聚丙烯酰胺凝胶溶液至烧杯中，加500L的10%过硫酸胺（APS）与50L的TEMED后， 摇匀后迅速将胶液灌入玻璃胶室，待胶室灌满后，在凹槽处鲨鱼齿朝外轻轻插入样品梳至适当位置，在室温下聚合1h以上。凝胶聚合后，轻轻拔出样品梳，清洗凹槽处残留的凝胶。预电泳将胶板垂直固定于电泳槽上，上槽加入约1200mL的1 TBE电泳缓冲液，约高出凹槽板2cm左右， 下槽加入500mL的1TBE电泳缓

11、冲液，再次用胶头滴管将凹槽处剩余凝胶碎片冲出。设定电压2000V、电流100mA、恒功率100W条件下预电泳20min。样品制备在10LPCR产物中加入4L上样缓冲液，混匀后，在PCR仪上94变性4min后取出，立即将PCR板放入碎冰上冷却10min。点样及电泳预电泳结束后，用胶头滴管吹走加样孔内气泡，并将鲨鱼梳正向插入凝胶，齿尖入胶深度以不超过lmm为宜。每个加样孔加入5L待测样品和参照样品，在胶板两侧点入DNA Marker。设定电压2000V、电流100mA、恒功率60W条件下电泳，在溴酚蓝指示剂接近胶板底部时停止电泳。银染检测快速银染法步骤如下：分开长、短玻璃板：电泳结束后，小心地将长

12、、短玻璃板分开，凝胶应粘在长玻璃板上；洗胶：将长玻璃板胶面朝上放入装有超纯水的托盘A中，漂洗2次，每次15s，再将玻璃板取出， 竖直放置10s20s；染色：在托盘B中加入1.2L染色液，将长玻璃板胶面朝上放入托盘B，并放置摇床上轻摇10min。洗胶：从托盘B取出玻璃板，并放入装有超纯水中的托盘A清洗胶面约5s；显色：从托盘A取出玻璃板沥水后，立即放入盛有预冷显影液的托盘C中，并放在摇床轻摇5min7min至条带清晰呈现，不宜显色太久；洗胶：用自来水冲洗玻璃板2min，将胶上多余的NaOH溶液洗去。；干胶：通过热对流或室温放置，使胶变干。指纹比对每个样品SSR位点的等位变异采用扩增片段大小的形式

13、表示。根据待测种质与参照种质的SSR条带位置，确定是否有差异，并根据DNA Marker和待测样品条带的位置比较分析，确定待测种质和参照种质的片段大小。结果判定用附录C中引物进行检测，若待测种质能扩增出与参照种质中的标准灌木辣椒种质相同条带时，则判定待测种质为灌木辣椒（C. frutescens）种质；若待测种质不能扩增出与参照种质中的标准灌木辣椒种质相同条带时，则判定待测种质不是灌木辣椒（C. frutescens）种质。附 录 A（资料性附录）主要仪器设备与试剂、耗材A.1 主要仪器设备与试剂、耗材主要仪器设备与试剂、耗材见表A.1。 表A.1主要仪器设备与试剂、耗材步骤/类别主要仪器设备

14、主要试剂（试剂均使用分析纯试剂）主要耗材DNA提取高压灭菌锅、高速冷冻离心机、核酸测定仪、微量移液器、纯水仪、恒温水浴锅、电子天平、磁力搅拌器、PH计十六烷基三乙基溴化铵（CTAB）、聚乙烯吡咯烷酮（PVPP）、乙二铵四乙酸二钠、氯化钠、三羟甲基氨基甲烷（Tris碱）、浓HCl、Tris饱和酚、-巯基乙醇、RNase A、氯仿、异戊醇、无水醋酸钠、无水乙醇、液氮离心管（1.5mL，2mL）、移液器配套枪头、配套枪头盒、研钵、研棒、烧杯、量筒、棕色瓶、玻璃棒、PE手套、乳胶手套PCR扩增PCR扩增仪器、制冰机98%去离子甲酰胺、溴酚蓝、二甲苯青、DNA Marker、矿物油、Taq DNA 聚合

15、酶、SSR引物、dNTPs、10 Buffer缓冲液、Mg2+96孔PCR板聚丙烯酰胺凝胶电泳高压电泳仪、垂直电泳槽及配套的制胶附件丙烯酰胺、甲叉双丙烯酰胺、硼酸、尿素、亲和硅烷、剥离硅烷、过硫酸铵(APS)、四甲基乙二胺（TEMED）滤纸、漏斗、长玻璃板、短玻璃板、胶头滴管银染检测水平摇床、胶片观察灯甲醛、硝酸银、氢氧化钠、无水碳酸钠托盘附 录 B（规范性附录） 试剂配制DNA提取试剂的配制1mol/L Tris-HCl溶液（PH=8.0）称取24.22g Tris碱置于250mL烧杯中，加入约160mLddH2O，充分搅拌，加入约8.4mLHCl调pH值至8.0，加ddH2O定容至200

16、mL，121高压灭菌20min。0.5mol/L EDTA溶液（PH=8.0）称取37.22g Na2EDTA2H2O置于250mL烧杯中，加入约160mLddH2O，充分搅拌，用固体NaOH调pH值至8.0，加ddH2O定容至200mL，121高压灭菌20min。2%CTAB溶液称取20g CTAB，81.9g NaCl，10g PVPP置于1000mL烧杯中，加入约500mLddH2O搅拌，再加入1mol/L Tris-HCl（pH=8.0）溶液100mL，0.5mol/L EDTA（pH=8.0）溶液40mL，65水浴溶解，加ddH2O定容至1000mL，121 高压灭菌20min。B.

17、1.4 酚/氯仿/异戊醇（25:24:1）溶液量取100mLTris饱和酚的下层有机相，96mL氯仿，4mL异戊醇置于棕色瓶中，充分混匀。氯仿/异戊醇（24:1）溶液量取240mL氯仿，10mL异戊醇置于玻璃瓶中，充分混匀。3mol/LNaAc溶液（PH=5.2）称取12.34g无水NaAc置于100mL烧杯中，加入约20mLddH2O，搅拌溶解，用冰醋酸调pH值至5.2， 加ddH2O定容至200mL，121高压灭菌20min。1TE buffer溶液用移液器吸取1mol/L Tris-HCl（pH=8.0）溶液1mL，0.5mol/L EDTA（pH=8.0）溶液200L，加ddH2O定容

18、至100mL，121高压灭菌20min。75% 酒精溶液量取150mL无水乙醇，50mLddH2O置于烧杯中，充分混匀。PCR扩增试剂的配制SSR引物稀释合成的核心引物（见附录C）先在高速离心机中5000r/min离心20s，根据引物说明书稀释到工作液浓度10mol/L。变性聚丙烯酰胺凝胶电泳相关试剂的配制10TBE缓冲液分别称取Tris碱108g，硼酸55g置于1000mL烧杯中，量取0.5mol/L EDTA（pH=8.0）溶液40mL，加超纯水定容至1000mL。40%丙烯酰胺凝胶溶液分别称取丙烯酰胺380g和甲叉双丙烯酰胺20g置于1000mL烧杯中，加入600mLddH2O慢慢搅拌，

19、37水浴溶解，定容至1000mL，过滤，4 保存。6%变性聚丙烯酰胺凝胶溶液称取420g尿素置于1000mL烧杯中，再分别加入100mL的10TBE缓冲液和40%丙烯酰胺凝胶溶液150mL，加入600 mLddH2O慢慢搅拌，37 水浴溶解，加超纯水定容至1000mL。10% APS溶液称取5g过硫酸铵，加入50mL的ddH2O溶解，4 保存一周即更换。1TBE缓冲液量取10TBE缓冲液100mL，用超纯水定容至1000mL。上样缓冲液分别称取溴酚蓝25mg，二甲苯青25mg置于玻璃瓶中，加入98%去离子甲酰胺98mL和0.5mol/L的EDTA（pH=8.0）溶液2mL，混匀。银染检测试剂的配制染色液称取硝酸银1.2g，加超纯水定容至1200mL。显色液称取NaOH 24g，无水碳酸钠0.48g，加超纯水定容至1200mL，4冰箱保存。显影前量取5mL甲醛倒入显色液中。附 录 C（规范性附录） 核心引物C.1 核心引物核心引物见表C.1。 表C.1核心引物编号引物名称引物序列(53)退火温度灌木辣椒扩增片段bp1Hpms 1-106F: TCCAAACTACAAGCC