国家973课题申请标书：-炎症过程中细胞间相互作用的信号转导机制及其应用研究

1、项目名称：炎症过程中细胞间相互作用的信号转导机制及其应用研究首席科学家：耿建国 中国科学院上海生命科学研究院起止年限：2010年1月-2014年8月依托部门：中国科学院 上海市科委一、研究内容本项目将针对炎症过程中细胞的识别、黏附、极性形成、迁移和效应等细胞间相互作用的不同步骤，分别有侧重的展开深入研究，发现新的信号调控分子和揭示新的信号转导机制，并进一步对细胞参与炎症反应的整个过程进行综合分析和整体把握，加深我们对炎症反应过程本质的系统认知。主要研究内容包括以下几方面：1揭示调控炎症细胞识别炎症信号与其它细胞或胞外基质发生黏附，形成极性并响应炎症信号发生迁移，以及最终发挥生物学效应的信号转导

2、机制：从分子生物学、表观遗传学、生物化学和细胞生物学等角度，利用基因转录调控、表观遗传调控、生物化学分析和细胞活性检测等方面的现代生物学研究手段，深入探讨TLR等膜受体、整合素等细胞黏附分子、Par复合物等细胞极性分子、Src激酶等细胞内信号调节分子、NF-B等关键转录因子、组蛋白等表观遗传调控蛋白、IL-1等细胞因子、MMP等基质蛋白酶类以及SAP等细胞分泌蛋白等，对炎症过程中细胞的识别、黏附、极性形成、迁移和效应等细胞间相互作用进行精确调控的分子机制和关键因子。2. 解析炎症过程中细胞间相互作用的信号转导在炎症相关重大疾病发生发展中的生物学功能：利用基因工程小鼠技术和小动物炎症模型，建立与

3、发展基于炎症中细胞间相互作用的重大疾病研究模型与系统，深入研究上述发现的新的信号转导分子、调节分子和信号途径间的交互作用与恶性肿瘤、心脑血管疾病、哮喘、类风湿性关节炎和全身炎症反应综合征等重大疾病发生发展的关系以及可能存在的致病机理。结合本项目团队中来自医科大学的成员所拥有的临床资源，在病人样品和实例中确认所发现的炎症调控信号转导机制，对若干重大疾病的机理提出重要见解，并提供潜在的诊治靶点。3. 发现新的抗炎药物作用靶点，利用相应的药靶筛选系统进行主要基于小分子化合物规模化筛选的抗炎药物研发：争取发现针对炎症相关重大疾病的新的抗炎药物作用靶点，并建立有效的筛选系统，利用商业化合物库和已建立的小

4、分子化合物库，进行针对候选靶点的小分子化合物活性筛选。根据活性化合物的结构，进行合理药物设计和结构多样性的合成，通过数轮的结构优化和全面的构效关系分析，获得先导化合物。根据构效关系，对活性化合物进行选择性的分子标记（如生物素标记和荧光标记等），用作生物学研究的工具分子。同时积极开展活性先导化合物的体内抗炎活性评价。4. 建立和完善炎症研究领域的技术和生物学分析体系：在以上系统深入的研究过程中，依靠科技进步和技术创新，不断完善炎症中细胞间相互作用的研究技术和策略，建立更高效更合理的炎症领域研究系统和分析体系。二、预期目标（一）总体目标本项目将围绕炎症及其相关重大疾病中细胞的识别、黏附、极性形成、

5、迁移和效应等方面，系统研究炎症过程中的细胞间相互作用，阐释炎症细胞及其所处环境间相互作用的信号转导机制和调控规律，探讨炎症细胞参与重大疾病发生发展的生物学基础，鉴定一系列调控炎症反应的关键蛋白，为炎症相关疾病的诊治提供具有自主知识产权的策略和手段。通过本项目的实施，获得一系列国际领先的研究成果，打造一支达到国际先进水平的炎症研究队伍，使我国的炎症相关基础研究和应用研究跻身于国际先进行列。（二）五年预期目标在基础理论研究方面：从分子、细胞到动物整体水平，发现并确认多种调控炎症过程中细胞间相互作用的新的关键调控因子和信号途径，阐明这些新的分子调控机理在炎症细胞的识别、黏附、极性形成、迁移和效应等过

6、程中的生理功能。解析上述调控炎症过程中细胞间相互作用的信号转导机制在恶性肿瘤、心脑血管疾病、哮喘、类风湿性关节炎和全身炎症反应综合征等重大疾病发生发展中的分子病理学机制。建立和完善炎症研究领域的技术和生物学分析体系，形成12种新技术方法和本领域的前沿性研究体系。在应用基础研究方面：通过发现和揭示与重大疾病相关的调控炎症细胞间相互作用的新分子、新功能和新机制，确定有效的抗炎新通路或新靶标，建立快速可靠的活性化合物筛选模型。通过通量筛选、合理药物设计、多样性合成、和结构优化，获得10个以上有效的抗炎活性先导化合物，完成较全面的构效关系研究，并期望获得2个以上具有显著抗炎效果的药物候选化合物。成果考

7、核指标：努力在国际相关研究领域做出具有重要影响的工作，在国际一流杂志（IF10）发表10篇以上论文，在有影响力的杂志（IF5）上发表50篇以上论文，申请10项以上相关专利。人才培养：培养博士研究生5080人，国家杰出青年等高级人才13名。三、研究方案（一）总体研究思路炎症反应的发生从本质上讲就是各种炎症细胞在致炎/抗炎因子等作用下，通过不同的信号转导机制发生相互作用的过程，包括了从炎症细胞识别炎症信号与其它细胞或胞外基质发生黏附，到炎症细胞形成极性并响应炎症信号发生迁移，以及最终炎症细胞发挥生物学效应的整个过程，既有明确的阶段和步骤，又是相互间在时空上密切联系、有机统一的完整过程。整个过程可分

8、为细胞的识别、黏附、极性形成、迁移和效应等不同步骤，而其中每一步骤都受到精细的信号调控，各种信号转导机制是调控细胞生命活动的基础。本项目将针对上述炎症过程中细胞间相互作用的每一步骤分设课题，分别展开深入的信号转导机制研究，以期能在整个项目层面上对整个炎症反应过程有一个系统综合的认知。只有在对炎症过程中调控细胞生命活动的信号转导机制进行充分认知的基础上，才能深入了解细胞生命活动在炎症相关重大疾病发生发展中的作用，有效确定治疗炎症的药物作用靶点，并进行相应的药物筛选和开发，为炎症及其相关重大疾病的诊疗提供新的策略和手段，提高人民群众健康生活质量。（二）技术路线本项目将针对炎症过程中细胞的识别、黏附

9、、极性形成、迁移和效应等细胞间相互作用的不同步骤，分别有侧重的展开集中深入的研究，设置了相应的六个研究课题，包括：1、炎症过程中细胞识别的信号转导机制；2、炎症过程中细胞黏附的信号转导机制；3、炎症过程中细胞极性形成的信号转导机制；4、炎症过程中细胞迁移的信号转导机制；5、炎症过程中细胞效应的信号转导机制；6、抗炎活性化合物筛选及优化。以下根据各个课题的具体情况分别进行介绍：总体技术途径示意图（三）可行性1. 本研究项目的总体研究方案切实可行从学术思路上看，本项目以炎症中细胞间相互作用为主线，以细胞间发生相互作用基本过程中调控各个步骤的信号转导机制为对象，并在前述基础研究的引导下进行抗炎药物的

10、研发。六个研究方向彼此间时空有序、相互补充、有机结合，综合研究了炎症过程中细胞间相互作用的各个层面，密切合作、互为指导，避免了单独某个方向或层面研究的局限性，为实质性推进炎症及其相关重大疾病的治疗奠定了基础。 从技术途径上看，本项目是在已有工作基础上的拓展和深入，研究内容是在各参与研究组工作基础上提出的具有原创性的内容，前期的工作都已取得了国际水平的进展，具有扎实的工作基础。相关的实验方案合理可行，实验方法成熟，必需的实验技术也已掌握，在技术上是完全可行的。各学术骨干均有独特的技术专长，涵盖生物化学、分子生物学、细胞生物学、免疫学、药学、有机化学和基础医学等学科，优势互补，便于联合攻关。六个具

11、体研究课题的技术途径和路线清晰明确，切实可行。2. 本研究项目凝聚了优秀的研究团队 本项目有高级职称人员26名，其他研究技术人员41名，平均年龄约为35岁。研究队伍包括“国家杰出青年基金”获得者5名、中科院“百人计划”入选者8名。本项目凝聚的优秀研究团队，确保了本项目切实可行。 研究团队成员已经承担过多项本研究项目相关项目，其中包括国家重大科学研究计划（首席科学家2名）、科技部“973”项目（首席科学家1名、课题负责人3名）、科技部“863”项目、国家自然科学基金重点项目、国家杰出青年基金等，具有相关国家级重大/重点项目顺利实施的丰富经验。扎实的工作基础确保了本研究项目顺利实施本研究团队在炎症

12、领域基础研究和应用研究方面有非常扎实的研究基础，近5年来，项目组成员已经作为通讯作者/第一作者在Cell、Nature和Science及其子刊上发表论文7篇，影响因子大于10分的共有14篇，影响因子大于5分的共有49篇。此外还有大量药物化学和应用研究方面的成果。良好的工作条件和环境为本研究项目顺利完成提供了保障本项目依托、承担和参加研究单位（中国科学院上海生命科学研究院、南方医科大学、中国人民解放军第二军医大学、中国人民解放军第四军医大学等）都属于国内一流的科研院校，有很强的综合科研实力。并且大部分科研骨干都依托于多个国家级和省部级重点实验室，包括医学免疫学国家重点实验室、肿瘤生物学国家重点实

13、验室、分子生物学国家重点实验室、生命有机化学国家重点实验室、中国科学院分子细胞生物学重点实验室、中国科学院再生生物学重点实验室、中国科学院营养与代谢重点实验室、再生医学教育部重点实验室和重大疾病的转录组与蛋白质组学教育部重点实验室。这些国内一流的科研院校及所依托的国家级和省部级重点实验室为本项目大开展提供了良好的工作环境和条件。本项目依托、承担和参加研究单位装备了开展生物化学、分子生物学、细胞生物学、蛋白质组学、结构生物学、药学、有机化学、免疫学、基础和临床医学等学科方面研究的仪器设备，如共聚焦显微镜、实时荧光定量PCR仪、HPLC仪器、ProteomoX质谱、核磁共振仪、红外光谱仪、元素分析

14、仪、X衍射仪、旋光仪、气相色谱仪、毛细管电泳仪、计算机工作站、流式细胞分析和分选仪、BIAcore、透射电子显微镜、活细胞工作站、Affymetrix基因芯片平台、原子力显微镜、共聚焦显微镜、实时荧光定量PCR仪、HPLC仪器、4800 MALDI-TOF-TOF质谱、SPR阵列检测仪、透射电子显微镜、活细胞工作站等先进的大型专业仪器设备。建立了成熟的实验方法，包括免疫荧光组织化学技术、激光共聚焦显微镜术、包埋前/后免疫电镜技术、活细胞成像技术、流式细胞分析技术、分子原位杂交技术、酵母双杂交系统、免疫共沉淀技术、动物模型制备、蛋白质肽谱分析、全基因组扫描和连锁分析、转基因动物制备和基因敲除技术

15、、实验动物平台等。这些条件都确保了本项目在仪器设备和技术方法的需求方面切实可行。（四）创新点与特色本项目是在项目组成员已取得的扎实的炎症领域科研成果基础上，以炎症中细胞间相互作用为主线，以细胞间发生相互作用基本过程中调控各个步骤的信号转导机制为对象，并在前述基础研究的引导下进行抗炎药物的研发，彼此间相互补充、有机结合，对炎症的发生发展展开集中深入的研究。六个研究方向有机整合，综合研究了炎症过程中细胞间相互作用的各个层面，无疑将极大地加深我们对炎症及其相关重大疾病发生发展的分子调控机制的了解，从而有力推动相应的药物研发和临床诊疗。选取炎症反应中最基本的细胞间相互作用这一特征，对炎症及其相关重大疾

16、病的发生发展进行重点突出、集中深入的研究，并且基础研究和应用研究紧密结合、相互促进，这在学术思路上具有良好创新性和重要科学价值。同时，我们将从分子水平、细胞水平到动物模型等多个层面揭示各种信号分子在炎症发生发展过程中的关键作用，在理论上和技术上均有突出的创新性和特色。理论创新：对国际前沿科学问题的把握和提炼保证了本项目的创新性，我们将针对炎症细胞及其所处环境间相互作用的信号网络和时空动态调控规律展开研究。我们将从炎症因子与 = 1 * ROMAN I型干扰素的差异性调节这一特殊的视角研究TLR介导的细胞识别的信号转导机制，提出“炎症和 = 1 * ROMAN I型干扰素反应失衡促进炎症损伤”的

17、理论观点，为炎症性疾病的治疗提供新思路。我们创新性地提出FPR2在识别A、激活小胶质细胞及AD病理变化中的作用，为AD的病理机制提供新的内容，为AD预防和治疗的研究提供新的思路和靶标。选凝素活化整合素的信号通路是我们原创性的发现，将对其展开深入揭示。我们拟开展的急性期蛋白对选凝素黏附活性的详细调控机制更是从未见报道。我们将从系统生物学的角度研究炎症过程中细胞迁移的信号调节机制。从调控关键转录因子、染色质结构、miRNA的关键信号通路和方式等角度揭示炎症复合体、转录复合物等生物大分子网络在炎症状态下对炎症信号转导的贡献及规律。我们也将创新性地开展组蛋白去甲基化酶与炎症效应的关系、miRNA对炎症

18、因子基因表达和炎症复合体在炎症因子释放中的作用方面的研究。技术创新：多种新的技术手段综合运用是本项目的一大特色。将结构基因组的模式运用于少数重要的核心蛋白质及其复合物，进行集中式高通量的目标片断优化设计，从而高效快速的获取靶蛋白及其复合物的结构信息，以高分辨率结构信息为切入点，从分子水平上阐释炎症反应过程中细胞识别的内部机理。建立了从基因蛋白水平、组织细胞水平以及动物模型水平的多层次多手段的炎症相关细胞黏附行为研究系统，为相关研究的系统深入的开展打下了基础。将传统的分子生物学、生物化学、细胞生物学、结构生物学与单分子纳米技术相结合，研究炎症反应中的细胞极性这一重大生物学问题。本研究涉及组蛋白甲

19、基化对染色质结构的影响、细胞内炎症复合体形成等研究，因此将充分利用分子细胞内活体示踪、荧光偏振能量转移等方法，争取在蛋白质-蛋白质/蛋白质-DNA等大分子复合物研究技术上有所创新。同时，我们已拥有相当规模的小分子化合物库，对活性小分子的化学合成和结构改造也已有多年的研究经验积累，有望开发出新的合成技术和获得新颖分子结构。（五）课题设置：课题一 炎症过程中细胞识别的信号转导机制：研究目标：揭示双特异性蛋白磷酸酶、Ets家族转录因子以及自主发现的DPK等分子对TLR介导的细胞识别信号转导的调节作用及其分子机制，解析相关重要蛋白质及其复合物的高分辨率晶体结构。明确FPR2在识别A、介导A所致AD脑部

20、炎症反应中的作用及其分子机制，阐明去甲肾上腺素对小胶质细胞识别、吞噬和清除A的影响及分子机制。研究内容：TLR介导的细胞识别导致促炎症细胞因子、 = 1 * ROMAN I型干扰素、趋化因子的产生，其信号转导对介导炎症反应的发生起关键作用。本课题将研究双特异性蛋白磷酸酶DUSP、Ets家族转录因子以及DPK等分子对TLR介导的细胞识别信号转导的调节作用。观察DUSP、Ets、DPK等分子表达缺失在体内外对TLR活化介导的促炎症细胞因子、 = 1 * ROMAN I型干扰素、趋化因子表达以及炎症细胞趋化效应的影响，研究DUSP、Ets、DPK等分子对已知TLR信号转导分子活化的调节作用及其分子间

21、的相互作用，解析重要蛋白质分子及其复合物的高分辨率晶体结构，阐明其分子间的相互作用的结构基础。在阿尔茨海默氏病（AD），淀粉样蛋白（A）通过激活小胶质细胞释放炎性介质而导致神经元死亡、突触功能障碍。小胶质细胞则可吞噬、降解A。另外，蓝斑神经元变性导致其投射区域去甲肾上腺素（NE）水平的降低加重AD的病理变化。本课题拟利用RNA干扰技术和基因敲除技术在离体和整体水平进一步研究小胶质细胞 A受体FPR2在识别A、介导A所致AD脑部炎症反应及病理变化中的作用及其信号转导机制；以及去甲肾上腺素对小胶质细胞识别、吞噬和清除A的影响及其信号转导机制。为AD病理机制及治疗研究提供新的内容和靶标。承担单位：中

22、国人民解放军第二军医大学课题负责人： 安华章，教授，中国人民解放军第二军医大学主要学术骨干：周兆才，研究员，中国科学院上海生命科学研究院 乐颖影，研究员，中国科学院上海生命科学研究院经费比例： 16课题二 炎症过程中细胞黏附的信号转导机制：研究目标：进一步揭示选凝素活化整合素的信号调控机制，确认此信号通路中Jak激酶、Src激酶、RhoA等关键分子的活性调节方式。阐明选凝素与急性期蛋白SAP和CRP的相互作用机理，加深对细胞黏附分子通过信号转导调节炎症细胞黏附行为的认识。研究内容：本课题将研究P-选凝素活化整合素通路中整合素活性调节的信号转导机制以及此信号通路的负反馈调控机制，并研究急性期蛋白

23、通过调节选凝素活性影响白细胞黏附的信号转导机制。利用我们建立的涉及分子、细胞和动物模型等多层次的炎症相关细胞黏附行为研究系统，研究P-选凝素动态调节整合素活化构像的变化以及与其配基的结合；研究RhoA对P-选凝素活化整合素信号通路的调控，对白细胞和血管内皮细胞之间相互作用的影响；利用PSGL-1的胞内区融合肽段研究对P-选凝素调控整合素的抑制效果；在P-选凝素引起的整合素介导的细胞黏附实验中，以及P-选凝素和整合素发挥关键作用的急性腹膜炎等动物模型中，确认此整合素活性调节机制的生理作用。同时我们还将研究在P-选凝素引起白细胞整合素活化过程中，c-Cbl被酪氨酸磷酸化的情况，及其随时间进程的变化

24、，探讨c-Cbl活性如何受Src的调节，包括白细胞中哪个Src激酶分子主导这一过程，c-Cbl哪个关键酪氨酸残基在这一过程中发挥重要调节作用；研究在P-选凝素信号刺激下c-Cbl对Src的详细调控机制，c-Cbl对Src激酶泛素化过程以及蛋白降解过程的调节；利用siRNA或c-Cbl无活性突变体抑制c-Cbl的活性，研究Src和c-Cbl的相互调节对此信号通路所起到的负反馈调节作用；在P-选凝素引起的整合素介导的细胞黏附实验中，以及P-选凝素和整合素发挥关键作用的急性腹膜炎等动物模型中，确认此负反馈调节机制的生理作用。我们还将研究选凝素与急性期蛋白SAP和CRP的相互作用特异性，利用缺失突变和

25、位点特异性突变等试验来寻找SAP和CRP结合P-选凝素的关键氨基酸，用表面等离子共振技术检测SAP和CRP与P-选凝素结合的亲合力和动力学，利用晶体结构分析研究SAP与P-选凝素的关键结合位点；用SAP转基因小鼠和SAP基因敲除小鼠研究SAP对炎症反应的调控作用，并利用SAP纯蛋白在选凝素介导的炎症细胞黏附实验中以及选凝素发挥关键作用的炎症等动物模型中，确认急性期蛋白通过调节选凝素活性影响炎症细胞黏附活性的生理作用。承担单位：中国科学院上海生命科学研究院课题负责人： 耿建国，研究员，中国科学院上海生命科学研究院主要学术骨干：杨雪松，教授，暨南大学陈铭，副研究员，中国科学院上海生命科学研究院经费

26、比例：25课题三 炎症过程中细胞极性形成的信号转导机制：研究目标：揭示炎症相关整合素及其配体在细胞极性形成中的作用及其对白细胞的黏附和迁移的影响；阐明整合素功能调控及其相关信号转导的机制；揭示细胞极性蛋白复合物Par复合物（Par3/Par6/aPKC）及其结合蛋白Lgl、Cdc42在淋巴细胞激活、迁移和炎症发生、发展中的功能及其信号调控机制。研究内容：本课题将研究细胞极性在淋巴细胞激活、迁移和炎症发生发展中的功能及其信号调控机制，阐明黏附分子及其配体、重要细胞极性蛋白复合物及其结合蛋白的生物学功能和分子机理。白细胞的滚动和稳定黏附与其在内皮细胞小静脉的定位、捕获和迁移有关。4整合素既可以介导

27、白细胞在其配体表面滚动，也可以介导白细胞的稳定黏附，这一特性是通过对其亲和性的动态调节实现的。而且，整合素对配体的亲和性与细胞的极性，迁移和信号转导相关。因此，研究4整合素亲和性动态调节机制和相关信号转导机制对于我们了解细胞极性与白细胞运动的关系是非常重要的。我们将研究：整合素亲和性动态调节的机制和结构基础；整合素亲和性动态调节对细胞极性与细胞迁移的影响；整合素介导的信号转导。通过研究细胞极性蛋白复合物PAR复合物及其相关功能蛋白，探讨细胞极性建立和维持与T/B淋巴细胞激活、迁移和炎症发生之间的相互关系，希望阐明PAR复合物及其相关蛋白在这些生命活动中的作用机理，推动对复杂系统中不同的细胞活动

28、间相互关系的认识，了解细胞极性如何影响淋巴细胞功能及其在炎症中变化规律。具体内容包括：细胞极性蛋白Par复合物及其结合蛋白在淋巴细胞极性形成机理研究； Par复合物及其结合蛋白对淋巴细胞功能的影响和信号调控机制；Par复合物及其结合蛋白对淋巴细胞迁移的影响和信号调控机制；Par复合物及其结合蛋白在炎症中的作用和机制研究。我们将利用单分子力谱法，在纳米级空间尺度上标定黏附分子在白细胞表面的分布以及活性。采用目前国际上常用的K562白细胞株作为样品，K562细胞将被转入4整合素，以及不同的趋化因子受体。利用原子力显微镜配合荧光显微镜成像的方法，我们将研究：K562胞内信号转导引发的胞外整合素介导的

29、黏附力变化并测量变化的动力学过程；K562细胞与人血管内皮细胞的黏附力以及在模拟炎症条件下的相互作用变化过程；K562细胞在受趋化信号吸引下做定向迁移时，其细胞前端和后缘的纳米级分辨率的形貌，黏附蛋白的分布以及活性。承担单位：中国科学院上海生命科学研究院课题负责人： 陈剑峰，研究员，中国科学院上海生命科学研究院主要学术骨干：陈正军，研究员，中国科学院上海生命科学研究院 张晓晖，研究员，中国科学院上海生命科学研究院经费比例： 16课题四 炎症过程中细胞迁移的信号调控及其分子基础：研究目标：建立和完善研究细胞定向迁移的技术平台，发现一系列调控细胞迁移的新的信号分子，并系统地研究这些分子对细胞迁移的

30、调控机制；结合原有研究基础，建立从胞外、胞膜到胞内调控细胞迁移的关键信号网络，发现调控炎症细胞定向迁移的新的信号途径，并鉴定若干新的抗炎药物作用靶位。研究内容：本课题将系统地研究炎症发生过程中调控细胞迁移的信号网络及其调控机制。拟以参与炎症发生过程中的各种白细胞和内皮细胞为靶细胞，结合已有研究基础，发展研究细胞迁移的新技术，建立高效、系统的细胞迁移研究技术平台；系统地研究细胞外信号分子、细胞膜表面受体群及细胞内信号分子网络对细胞迁移方向的决择及迁移速度的调控；基于多种筛选技术，寻找并鉴定正向或负向调控细胞迁移的细胞因子及化合物；以蛋白质组学为手段，鉴定白细胞迁移过程中的蛋白质修饰的调控机制，并

31、鉴定调控细胞定向迁移关键信号蛋白复合体，研究调控白细胞迁移的各种信号通路间的新的对话机制；并结合功能基因组学，运用大规模siRNA筛选，寻找并鉴定调控白细胞定向迁移的新的调控分子及调控机制；结合细胞及模式动物技术，进一步研究这些新的调控分子对于炎症及相关疾病的影响。探索从胞外信号与膜蛋白GPCR结合启动的信号传递过程，通过研究磷脂代谢家族、小G蛋白家族到核转录因子的调控网络，系统深入的探索其与细胞迁移及炎症的关系。选择关键的分子靶位，筛选正向或负向调控细胞迁移的蛋白、短肽、寡糖或化合物，为控制炎症细胞迁移提供新的技术途径。承担单位：南方医科大学课题负责人： 姜勇，教授，南方医科大学主要学术骨干

32、：王平，教授，华东师范大学经费比例： 16课题五 炎症过程中细胞效应的信号转导机制：研究目标：系统研究在炎症过程中产生炎症放大和组织损伤效应的炎症细胞及其作用的靶细胞的信号转导规律，阐明这些细胞合成和释放炎症因子等效应分子的调控方式，认识细胞在炎症环境下参与控制表达效应分子的新的信号分子及作用机制，从炎症复合体、转录复合物等角度建立炎症状态下生物大分子相互作用的网络的理论模型，力争发现新的控制炎症的药物靶位。研究内容：本课题拟研究的主要炎症细胞为巨噬细胞，炎症效应的靶组织则主要利用关节炎中的滑膜成纤维细胞为研究对象。在这些细胞探讨在基因转录水平控制巨噬细胞IL-1、TNF-等促炎细胞因子基因表

33、达和表达产物成熟及释放的信号分子及其转导机制；在成纤维细胞则重点观察MMPs等细胞外基质降解酶的基因表达控制信号通路以及影响这些分子翻译后加工及释放的信号机制。在基因转录及转录后水平的研究中，将特别关注调控这些效应因子释放的组蛋白修饰编码、扩展对NF-B等关键转录因子作用的认识、系统认识调节炎症因子释放的miRNA表达谱及其作用。具体内容包括：（1）发现和鉴定炎症效应相关的组蛋白去甲基化酶（如H3K9me2组蛋白去甲基化酶），阐明它们在调控炎症效应因子（IL-1、TNF-、MMPs）表达中的作用，利用组蛋白去甲基化酶基因剔除小鼠研究组蛋白修饰与炎症效应的关系；（2）观察炎症细胞及其他效应细胞在

34、炎症应激信号作用下的转录因子含量及活性变化、miRNA 种类和含量变化，分析这些变化对于炎症效应信号（IL-1、TNF-、MMPs）的影响；（3）研究炎症细胞及相关细胞在炎症环境下细胞内信号与细胞外基质的相互作用，阐明细胞外基质成分（胶原、纤连蛋白、整合素等）在炎症环境下的变化及其对细胞炎症效应的影响。在炎症效应因子的翻译后调控信号方面则重点研究在促炎细胞因子或MMPs等的分泌调控中的重要蛋白质复合体，如炎症复合体的形成及作用。系统而深入地研究炎症复合体在病原侵入和应激刺激中形成的信号转导机制，及信号网络异常引起各种疾病的分子机理。拟通过规模性地蛋白质相互作用筛选手段，寻找各种炎症复合体介导信

35、号通路中新的蛋白分子，并研究其在信号网络中的功能和分子作用机制；同时研究信号转导关键分子ASC的复合体的形成，动态变化规律，并阐明蛋白翻译后修饰在此过程中的作用及对NLRs发挥功能的影响，为重大疾病的诊治提供新策略和新靶点。承担单位：中国人民解放军第四军医大学课题负责人： 药立波，教授，中国人民解放军第四军医大学主要学术骨干：陈德桂，研究员，中国科学院上海生命科学研究院 钱友存，研究员，中国科学院上海生命科学研究院经费比例： 16课题六 抗炎活性化合物筛选及优化：研究目标：针对本项目发现的与炎症相关的新通路或靶标，建立快速可靠的活性化合物筛选模型，通过通量筛选、合理药物设计和结构优化相结合的方

36、法获得高活性的化合物，并完成较全面的构效关系研究，获得具有显著抗炎效果的候选药物化合物。并为进一步研究相关靶标在炎症过程中的作用提供小分子化合物研究工具和探针。研究内容：本课题将开展大量抗炎活性化合物的筛选及优化研究工作。针对本项目发现的有效的抗炎新通路或靶标，利用分子和细胞生物学等方法建立快速可靠的筛选模型，并进行通量筛选，寻找相应靶标的小分子抑制剂。对所获得的活性化合物进行结构优化，提高化合物对靶标的活性和选择性，同时改善化合物的理化性质等其它性质。我们还将利用Western Blot、RT-PCR、Co-IP、EMSA等生化技术，以及免疫荧光分析、流式细胞仪分析等手段进一步验证化合物对靶

37、标的生物学作用和选择性等。此外，在了解药物靶标的三维结构的基础上，我们还将利用计算机辅助药物设计等技术合理设计和合成对应相关生物靶标的小分子调节剂。在获得针对生物靶标具有较好活性和选择性的化合物后，我们一方面将利用动物模型研究这些化合物对炎症反应的抑制作用，评价并改善其药代动力学特性并提高化合物的安全性，以期以此为基础开发具有自主知识产权的新型抗炎药物。另一方面，我们也将根据科学研究的需要，对化合物进行生物素或荧光标记，为进一步研究相关靶标及其信号通路提供有力的小分子研究工具和探针。承担单位：中国科学院上海有机化学研究所课题负责人： 俞飚，研究员，中国科学院上海有机化学研究所主要学术骨干：丁克

38、，研究员，中国科学院广州生物医药与健康研究院经费比例：11（六）课题设置思路：本项目拟从炎症细胞及其所处环境间相互作用的信号网络和时空动态调控规律这一关键科学问题出发，主要以炎症中细胞间相互作用为主线，以炎症细胞间发生相互作用基本过程中的信号转导机制为对象，并在前述基础研究的引导下进行抗炎药物的研发，彼此间相互补充、有机结合，对炎症的发生发展展开集中深入的研究。基于大量的文献回顾、长期的工作基础和储备的人才队伍，本项目拟设立六个课题：课题一，炎症过程中细胞识别的信号转导机制；课题二，炎症过程中细胞黏附的信号转导机制；课题三，炎症过程中细胞极性形成的信号转导机制；课题四，炎症过程中细胞迁移的信号

39、转导机制；课题五，炎症过程中细胞效应的信号转导机制；课题六，抗炎活性化合物筛选及优化。各课题间的有机联系以及与项目预期目标的关系：炎症反应的发生从本质上讲就是各种炎症细胞在致炎/抗炎因子等作用下，通过不同的信号转导机制发生相互作用的过程，包括了从炎症细胞识别（课题一）炎症信号与其它细胞或胞外基质发生黏附（课题二），到炎症细胞形成极性（课题三）并响应炎症信号发生迁移（课题四），以及最终炎症细胞发挥生物学效应（课题五）的整个过程，既有明确的阶段和步骤，又是相互间密切联系和时空有序的完整事件。治疗炎症性疾病是炎症领域基础研究的目的，通过对炎症的发生发展进行细致的分子调控机制研究，发现新的抗炎药物作用

40、靶点，无疑将有力促进抗炎药物研发（课题六）。本项目包含的六个课题的设置相互间紧密相关，围绕着揭示炎症及其相关重大疾病中细胞间相互作用的信号转导机制、促进抗炎药物研发等应用研究的项目预期目标，展开系统深入的研究，课题间相互关联、逐渐延续、密切合作、互为指导，组成一个完整的研究体系。课题间有机联系示意图四、年度计划年度研究内容预期目标第一年1. 研究包括DUSP1、Ets1、Ets2、Fli1、DPK在内的靶分子基因转染对原代培养的单核巨噬细胞/树突状细胞TLR反应的影响。2. 在mRNA、蛋白质及功能水平探讨FPR2在A激活脑小胶质细胞中的作用。3. 利用分子和细胞水平的炎症细胞黏附实验系统，研

41、究选凝素与急性期蛋白SAP之间的相互作用机理；研究P-选凝素与PSGL-1的结合如何引起Src激酶和c-Cbl之间的相互调节；研究不同白细胞间对同一活化信号的不同响应机制。4. 研究炎症相关黏附分子在鸡胚早期发育中的时空表达模式，以此建立利用胚胎作为模式动物研究黏附分子的实验模型。5. 研究整合素47的亲和性动态调控的机制。6. 完善和系统化原子力显微和单细胞力谱技术，使之适用于探测迁移中的活体炎症细胞。7. 建立血液细胞（T/B细胞）蛋白质组学定量技术方法：SILAC, iTRAQ；对Par3、Par6、aPKC和Lgl等极性蛋白质复合物进行研究分析。8. 以参与炎症发生过程中的各种白细胞和

42、内皮细胞为靶细胞，结合已有研究基础，发展研究细胞迁移的新技术，建立高效、系统的细胞迁移研究技术平台。并建立相应的筛选技术包括功能基因组、shRNA筛选、蛋白质组筛选。同时在此基础之上，建立小分子化合物的筛选平台。9. 用TNF-和IL-8等刺激和活化中性粒细胞，建立体外中性粒细胞黏附和迁移模型，结合抑制剂、基因共转染技术，分析c-Abl激酶、2整合素等蛋白的细胞分布、动态变化及对中性粒细胞黏附和迁移的影响。10. 探讨MAPK通路信号分子，尤其是PRAK在细胞骨架调整中的作用及其机制。11. 观察炎症细胞及其他效应细胞在炎症应激信号作用下的转录因子含量及活性变化、miRNA 种类和含量变化，分

43、析这些变化对于炎症效应信号的影响。12. 构建核蛋白质基因克隆库, 用免疫组化方法高通量筛选新的组蛋白去甲基化酶, 并用高表达Knockdown目标基因在细胞内鉴定组蛋白去甲基化酶的活性。13. 研究TLR4和RIG-I激活前体白介素1加工成熟通路的信号转导机制；14. 通过酵母双杂交系统、免疫共沉淀和GSTPulldown等手段筛选炎症复合体中新的信号分子；15. 针对目前已被验证过的抗炎药物新靶标（主要针对尚无药物上市的靶标）开发原创性的小分子调节剂作为新药候选物。如针对与机体免疫反应密切相关的JAK-STAT信号转导通路、与关节炎（OA）密切相关的ADAMTs开发选择性小分子调节剂剂等。

44、建设小分子化合物库。1. 发现新的对TLR反应具有调节作用的DUSP及Ets家族蛋白分子。2. 明确DUSP1、Ets1、Ets2、Fli1、DPK等基因表达在体外对TLR介导的炎症及固有免疫反应中的调节作用。3. 获得足够量的高纯度目标蛋白质以用于体外生化实验以及结构分析。4. 获得有效表达FPR2 shRNA的慢病毒载体；在细胞水平明确FPR2是介导A所致脑部炎症反应的关键分子。5. 揭示选凝素通过与SAP的相互作用调控炎症细胞的黏附行为的分子机制，揭示Src激酶与c-Cbl相互调控在炎症细胞黏附活性调节中的作用，揭示不同白细胞间对同一活化信号的不同响应机制。6. 采用原位杂交和免疫组化技

45、术进一步完善黏附分子E-Cadherin和N-Cadherin等在胚胎早期的表达，而后探讨其它黏附分子。7. 揭示整合素亲和性动态调控对白细胞在炎症过程中的极性形成和运动的影响。8. 开发出测量单个活体细胞表面分子分布和活性的纳米生物学方法。9. 从分子水平上，确定极性蛋白Par复合物在血液细胞的结合蛋白及其相互作用网络图；鉴定重要的功能性结合蛋白、确定其细胞定位和与T/B细胞功能的相关性。10. 建立多样化的、系统研究白细胞、内皮细胞等定向迁移技术平台。11. 建立并完善相应的筛选技术平台：包括相关功能基因家族的克隆、相关shRNA收集及构建、鉴定及相关表达系统的建立如逆转录病毒、慢病毒等系

46、统、以及相关的蛋白质组学技术的建立。12. 建立中性粒细胞铺片培养，实时观测并记录细胞的黏附和延展实验模型，单层细胞划痕实验模型，体外Transwell中性粒细胞迁移及侵袭模型。明确c-Abl激酶等与细胞骨架相关动态变化等相关蛋白在中性粒细胞黏附和迁移中的作用。13. 获得研究需要的部分小鼠品系。14. 发现一些新的MAPK通路信号分子与细胞骨架的功能联系。15. 发现炎症信号作用下某些特定转录因子、miRNA的变化；发现新的组蛋白去甲基化酶候选基因；在阐明TLR激活白介素1成熟加工的分子机制方面筛选出炎症复合体中新的信号分子。16. 完成STAT3，ADAMTs的筛选模型建立，并进行活性评价

47、和筛选。初步获得针对STAT3，ADAMTs的先导化合物。17. 定向合成200个左右小分子化合物，充实小分子化合物库。18. 在国际高水平学术杂志（IF5）上发表10篇以上论文，申请2项以上相关专利，培养博士研究生10人以上。第二年1. 合成并筛选DUSP1、Ets1、Ets2、Fli1、DPK等分子特异性干扰RNA，研究内源性DPK分子基因敲减对原代培养的单核巨噬细胞、树突状细胞中TLR介导的炎症细胞因子及I型干扰素反应的影响。2. 鉴定目标蛋白质及其复合物关键组分的生化特征。对目标蛋白质及体外重构的复合物并进行单晶培养。3. 通过RNA干涉技术， 在急性AD小鼠模型探讨FPR2 在A42

48、所诱导脑部胶质细胞侵润和炎性细胞因子生成中的作用。4. 利用生化实验和动物模型系统，研究机体调控选凝素与SAP相互结合的分子机理；研究P-选凝素与PSGL-1的结合如何引起Jak2激酶活化并进而活化Src激酶。5. 利用哮喘等模型，研究不同白细胞对同一活化信号有不同响应的生理意义。6. 开发已知的常见黏附分子的基因干扰（over-expression and siRNA）的同时，探讨其它黏附分子干涉的相应条件，设计构建dominant negative表达质粒等。7. 研究整合素介导细胞双向跨膜信号的机制及其生物学功能。8. 利用整合素配体修饰的探针，用于探测上整合素的在白细胞迁移时的分布与活

49、性。9. 从细胞水平，建立单分子和高分辨率的免疫荧光技术，以及原子力显微镜等先进的成像技术。利用上述技术研究Par3/Par6复合物及其结合蛋白在细胞水平的定位与细胞功能的变化相关性。10. 利用RNAi技术研究Par蛋白复合物的缺失对T/B细胞的功能以及细胞结构和功能不对称性分布的影响。11. 从动物水平，开始着手制备Par3和/或Par6的组织特异性条件性基因敲除小鼠模型各种质粒，或引进相应的小鼠模型。12. 以蛋白质组学为手段，鉴定白细胞迁移过程中的关键蛋白家族如GPCR、小G蛋白、磷脂代谢相关蛋白修饰的调控机制。13. 结合功能基因组学，siRNA等筛选技术，寻找并鉴定调控白细胞定向迁

50、移的新的调控分子。14. 结合酵母双杂交、蛋白质免疫共沉淀和质普分析技术，分析和鉴定在中性粒细胞黏附和迁移过程中与c-Abl激酶和2整合素相互作用的蛋白质，及相互作用的时空动态变化。15. 构建CD18的CD4+T细胞条件性基因剔除自身免疫性疾病的小鼠模型。16. 以细胞骨架相关蛋白为靶标，使用蛋白质免疫共沉淀、非变性凝胶电泳、GST-pulldown、DIGE和质普分析等多种技术鉴定相关信号蛋白复合体。17. 继续观察炎症细胞及其他效应细胞在炎症应激信号作用下的转录因子含量及活性变化、miRNA 种类和含量变化，进一步分析这些变化对于炎症效应信号的影响。18. 表达和纯化组蛋白去甲基化酶候选

51、基因, 用质谱和Western blot的方法在体外鉴定组蛋白去甲基化酶的活性, 并鉴定组蛋白去甲基化酶的催化机理。19. 研究NLR激活前体白介素1加工成熟通路的信号转导机制，并与TLR介导白介素1加工机制比较。20. 通过siRNA等手段研究筛到的炎症复合体中新分子的功能。21. 获得应激反应基因NDRG2的基因剔除小鼠，鉴定其一般表型变化。22. 对与机体免疫反应密切相关的JAK-STAT信号转导通路、与关节炎（OA）密切相关的ADAMTs开发选择性小分子调节剂剂等。建设小分子化合物库。1. 明确内源性DUSP1、Ets1、Ets2、Fli1、DPK等分子在体外对TLR介导的炎症及固有免

52、疫反应中的作用。2. 获得目标蛋白质及其复合物的翻译后修饰特征。通过体外分析，建立目标蛋白质复合物的动力学和热力学参数。获得初步晶体生长条件。3. 在急性AD动物模型明确FPR2在A所致脑部炎症反应中的作用。4. 揭示机体通过调控选凝素与SAP相互作用，影响炎症细胞的黏附行为的分子机制；揭示Jak2激酶在选凝素活化整合素信号通路中的重要作用；揭示噬酸性粒细胞在哮喘中的行为调控机制。5. 在明确目标黏附分子基因的基础上，建立稳定的基因干扰的条件，为后续工作打下坚实的基础。6. 阐明整合素相关的信号转导与白细胞极性形成以及运动的关系。7. 揭示整合素的在白细胞迁移过程中的纳米级空间分布、极性化过程

53、及活性的调控机制。8. 在分子水平，进一步确定重要的功能性结合蛋白，及其细胞定位和与T/B细胞功能的相关性。9. 在细胞水平，确定极性蛋白Par复合物及结合蛋白细胞定位变化与细胞功能相关性。10. 预期将鉴定并发现2-3种调控在细胞定向迁移过程中起关键作用的信号分子的新机制包括新的修饰机制磷酸化、泛素化等、新的调控蛋白。11. 通过siRNA筛选，得到2-3种直接参与细胞定向迁移的蛋白。12. 在明确c-Abl激酶和2整合素在中性粒细胞黏附和迁移中作用的基础上，通过对相关复合物组分的动态分析，鉴定出与上述两种蛋白相互作用的蛋白及可能相互作用的环节，预期发现1-2种新的相互作用蛋白。13. 获得

54、CD18条件性基因剔除自发性自身免疫性疾病的小鼠模型。14. 鉴定出一些新的细胞骨架相关蛋白复合体，发现一些新的蛋白质作用关系。15. 初步证实所发现的某些特定转录因子、miRNA在炎症相关细胞效应中的作用；证实所发现的组蛋白去甲基化酶候选基因的活性；发现筛到新分子的部分功能；进一步阐明NLR激活白介素1成熟加工的分子机制。16. 利用不同模型完成对初筛到的STAT3，ADAMTs的小分子先导化合物的验证；针对先导化合物进行结构优化；定向合成200个左右小分子化合物，充实小分子化合物库。17. 在国际高水平学术杂志（IF5）上发表10篇以上论文，申请2项以上相关专利，培养博士研究生10人以上。

55、第三年1. 观察DUSP、Ets1、Ets2、Fli1、DPK等分子表达对TLR反应中MAPK、NF-B、IRF3、STAT1等信号分子活化的影响，研究DUSP、Ets、DPK等分子与已知TLR信号传导分子间的相互作用。2. 通过高通量优化筛选，结合蛋白质工程的方法，对目标蛋白质及其复合物的单晶进行优化，并进行衍射测试。3. 将FPR2基因敲除小鼠与APP转基因小鼠杂交，观察子代小鼠脑部病理变化和学习记忆能力的改变。4. 利用X-射线晶体衍射等技术，研究P-选凝素与SAP相互结合的精细位点；研究选凝素活化整合素信号通路中其它关键蛋白间的相互结合位点。5. 利用生化实验和动物模型系统，研究P-选

56、凝素与PSGL-1的结合如何通过Rho A等小GTP酶引起整合素活化。6. 在黏附分子基因干扰的前提下，实时在体观察细胞的生物学改变，如细胞分裂、迁移和分化，以及所导致的形态发生的变异，同时以基因表达的实验作为基因功能学研究的支撑。7. 研究整合素亲和性调控和信号转导的结构基础。8. 整合素抗体修饰的探针，通过不同表位的表达情况来分析整合素在膜上的构象。9. 利用RNAi和Rescue等技术确定Par蛋白复合物对T/B细胞的功能以及细胞结构和功能不对称性分布的影响的专一性。10. 在动物水平，完成Par3和/或Par6的组织特异性条件性基因敲除小鼠模型，或引进相应的小鼠模型并建立小鼠品系。初步

57、分析小鼠的特定基因缺失的表形变化。11. 进一步研究新的调控分子及调控机制对于炎症及相关疾病的影响。探索这些新靶点对在细胞过程中对胞外信号与膜蛋白GPCR结合启动的信号传递、磷脂代谢家族、小G蛋白家族到核转录因子的调控网络的影响，系统深入的探索这些新分子及调控机制对细胞迁移的影响。12. 通过GST-pulldown、far-western等实验，具体分析c-Abl激酶和2整合素与复合体中相互作用蛋白的作用机制。包括是组成性结合，还是活化依赖的；是直接结合和间接结合，以及对直接结合的结构域进行分析。 13. 评估CD18条件性基因剔除小鼠模型自身免疫性疾病的表型、白细胞的活化和多种炎症因子的表

58、达。14. 使用蛋白质组学、CHIP和DNA-pulldown技术，研究IP-10等趋化因子的基因表达调控机制。15. 在应激反应基因NDRG2的基因剔除小鼠观察其炎症环境下的细胞效应改变。16. 用RT-PCR, Western blot analysis鉴定组蛋白去甲基化酶、上述发现的重要转录因子、miRNA在炎症效应产生中的表达变化, 并用Knockdown和过表达鉴定它们调控炎症效应因子的作用。启动相应的基因剔除小鼠模型建立工作。17. 继续研究TLR和NLR激活白介素1成熟加工的分子机制。根据细胞水平的功能研究结果，筛选重要新分子进行基因剔除小鼠模型的构建。18. 与机体免疫反应密切

59、相关的JAK-STAT信号转导通路、与关节炎（OA）密切相关的ADAMTs开发选择性小分子调节剂等。建设小分子化合物库。19. 在本项目发现的有效新靶标及建立有效筛选模型的基础上进行活性筛选。1. 明确DUSP、Ets1、Ets2、Fli1、DPK等分子对TLR信号传导的调节作用，阐明DUSP、Ets、DPK等分子参与TLR信号传导的分子机制。2. 采集用于结构解析的X射线衍射数据。获得初步晶体学分析结果以用于制定相应的结构解析方案。3. 阐明FPR2在AD发生发展中的作用。4. 揭示P-选凝素与SAP相互结合的精细位点，揭示选凝素活化整合素信号通路中其它关键蛋白间的相互结合位点，为寻找其结合

60、特异抑制剂奠定基础。揭示Rho A等小GTP酶在炎症细胞黏附活性调控中的重要作用。5. 明确相关黏附分子基因在胚胎发育中的功能，可能的情况下在小鼠胚胎加以验证。6. 揭示整合素在炎症细胞极性化和迁移过程中的构象变化机制。7. 在细胞水平，进一步确定极性蛋白Par复合物及结合蛋白细胞定位变化与细胞功能相关性。8. 在动物水平，初步确定Par复合物及结合蛋白对炎症细胞功能的影响。9. 预期明确所鉴定的新分子及调控方式对细胞迁移的影响，并在此基础之上，确定这些信号分子对细胞迁移信号网络的影响，明确他们调控细胞信号迁移的具体机制。10. 阐明在中性粒细胞黏附和迁移过程中c-Abl激酶和2整合素与相关蛋