基因工程知识点(共8页)

1、名词解释1.基因工程(jyn gngchng)：是将目的基因或DNA片段与合适的载体连接转入目标生物细胞，通过(tnggu)复制、转录、翻译外源目的基因以及蛋白质的活性表达，使转基因生物获得新的遗传性状的操作。2.限制性内切核酸酶：能够(nnggu)识别双链DNA分子中的某一段特定核苷酸序列，并在此切割DNA双链的内切核酸酶。3.同切点酶：又称同裂酶，是一类来源于不同微生物、能识别相同DNA序列的限制性内切核酸酶。4.同尾酶：是一类限制性内切核酸酶，它们来源各异，识别的靶序列也各不相同，但切割后能产生相同的黏性末端。5.酶的星号活性（Star activity）：高浓度的酶、高浓度的甘油、低离

2、子强度、极端pH值等，会使一些核酸内切酶的识别和切割序列发生低特异性，即所谓的酶的星号活性现象。6.DNA连接酶：是能催化双链DNA片段靠在一起的3羟基末端与5端磷酸基团末端之间通过形成磷酸二酯键，使两末端连接的一种核酸酶。7.载体：在基因克隆中能携带外源基因进入受体细胞复制、整合或表达的工具称为载体。8.多克隆位点：是包含多种同一个限制性酶切点的一段很短的 HYPERLINK /s?q=DNA%E5%BA%8F%E5%88%97&ie=utf-8&src=wenda_link t _blank DNA序列9. 互补：为质粒DNA编码半乳糖苷酶的亚基，宿主细胞可编码亚基虽然宿主和质粒编码的片段

3、各自都没有酶活性，但它们可以融为一体，形成具有酶学活性的蛋白质，这种互补现象叫互补。10.黏粒载体（考斯质粒载体）：是一类人工构建的含有-DNAcos序列和质粒复制子的特殊类型的载体。11.质粒：是生物细胞内固有的、能独立于寄主染色体而自主复制、并被稳定遗传的一类核酸分子12.探针(tn zhn)：当用一个(y )标记的核酸分子与核酸样品杂交,便可查明该样品中是否存在与该标记核酸分子具有同源性的核酸分子。这个标记的核酸分子称为探针(probe)，可以是DNA，也可以是RNA，或合成的寡核苷酸.13、SD序列(xli)：是存在于原核生物起始密码子上游7-12个核苷酸内的一种4-7个核苷酸的保守片

4、段，它与16SrRNA3端反向互补，所以可将mRNA的AUG起始密码子置于核糖体的适当位置以便起始翻译作用。14、包含体：目的蛋白子啊细胞质的还原性环境中，以不溶性的形式产生并聚集形成蛋白质聚合物即为包含体。简答：1. 影响限制性核酸内切酶活性的因素答：1）DNA的纯度2）DNA的甲基化程度3）消化反应的缓冲液系统4）DNA的分子结构5）酶的纯度6）酶切反应的温度7）酶的星号活性2.大肠杆菌DNA聚合酶与klenow片段的比较答：1）结构上的区别：Klenow片段是完整DNA聚合酶的一个片段，是用 HYPERLINK /s?q=%E6%9E%AF%E8%8D%89%E6%9D%86%E8%8F

5、%8C%E8%9B%8B%E7%99%BD%E9%85%B6&ie=utf-8&src=wenda_link t _blank 枯草杆菌蛋白酶处理大肠杆菌DNA聚合酶时，得到的两个片段中分子量较大的一个，具有53聚合酶活性和35的外切酶活性，不含53外切酶活性。2）功能上的区别： HYPERLINK /s?q=DNA%E8%81%9A%E5%90%88%E9%85%B6I&ie=utf-8&src=wenda_link t _blank DNA聚合酶I可通过DNA HYPERLINK /s?q=%E7%BC%BA%E5%8F%A3%E5%B9%B3%E7%A7%BB&ie=utf-8&src=

6、wenda_link t _blank 缺口平移的方法制备 HYPERLINK /s?q=DNA%E6%8E%A2%E9%92%88&ie=utf-8&src=wenda_link t _blank DNA探针。而klenow酶主要用于缺口平移标记DNA，也用于DNA的缺口补平和延伸。还在 HYPERLINK /s?q=cDNA%E5%85%8B%E9%9A%86&ie=utf-8&src=wenda_link t _blank cDNA克隆中用于第二条 HYPERLINK /s?q=cDNA&ie=utf-8&src=wenda_link t _blank cDNA链的合成。3.载体的基本条

7、件答：1）.具有针对受体细胞的亲缘性或亲和性(可转移性)，可以(ky)携带外源基因进入受体细胞； 2）能在宿主细胞中自主复制(fzh)，并实现外源基因的增殖；3）.具有多种单一的限制性核酸(h sun)内切酶识别切割位点；4）.具有较高的外源DNA的载装能力；5）.具有合适的筛选标记。4.质粒的基本性质答：（1）自主复制。质粒DNA上都含有一个复制起始区，控制着质粒在宿主细胞内的复制，这一复制起始区称为“复制子”。一般一个质粒DNA分子上只含有一个复制子。按复制能力可将质粒分为严紧型和松弛型两类。（2）不相容性：在没有选择压力的情况下，两种亲缘关系密切的不同质粒，不能够在同一寄主细胞系中稳定地

8、共存的现象，又称为不亲和性。这样的两种质粒称为不亲和质粒。（3）转移性：能在自然条件下自发地从一个细胞转移到另一个细胞（接合作用）的质粒称为接合型质粒；不能在自然条件下独立地发生接合作用的质粒称为非接合型质粒。（4）编码性状：野生型的质粒DNA上往往携带一个或多个遗传标记基因，这使得寄主生物产生正常生长非必需的附加性状。5、Southern杂交（DNA）步骤:答：DNA的片段化及其电泳分离；凝胶电泳后的变性处理；转移并固定到滤膜上；杂交；检测与分析6、基因组文库与cDNA文库的区别基因组文库：基因组文库简称基因文库，是将某一生物基因组DNA片段化并全部克隆后获得的重组子群体的总称。CDNA文库

9、：是将生物特定的组织器官或特定发育时期的全部(qunb)mRNA反转录成cDNA，并全部克隆成重组子，在该重组子群集中包含了全部表达基因的转录本。区别(qbi)：基因组文库包含全部基因，但cDNA文库石油mRNA反转录得到的，已经去掉基因中的内含子部分7.比较克隆载体与表达(biod)载体的异同同：1）.具有针对受体细胞的亲缘性或亲和性(可转移性)，可以携带外源基因进入受体细胞； 2）能在宿主细胞中自主复制，并实现外源基因的增殖；3）.具有多种单一的限制性核酸内切酶识别切割位点；4）.具有合适的筛选标记。异：1）表达载体在克隆载体的基础上又增加了基因表达的调控元件：即启动子核糖体结合位点克隆位

10、点转录终止信号（区分二者的标志）2）克隆载体在菌体中一般是多拷贝的，而表达载体一般是低拷贝的。8、外源基因在大肠杆菌中的表达形式有哪些？如何纯化？1）包含体蛋白：纯化步骤：细胞收集与破碎，洗涤与溶解，变性蛋白质的纯化，重组蛋白质的复性，天然蛋白质的分离。2）融合蛋白：融合蛋白的提取，重折叠，纯化，天然蛋白的回收以及蛋白质的水解保护。3）分泌型蛋白：首先要进行浓缩处理，然后再根据发酵液中的有效成分和杂质之间的理化性质存在的差异来考虑选择合适的纯化方法。如离子交换层析，亲和层析，凝胶过滤等。4）可溶性表达产物：经细胞破碎后的可溶性离心上清液，可利用如果有可利用的单克隆抗体或相对特异性的亲和配基，可

11、选用亲和层析分离法。对处于极端等电点的蛋白，采用离子交换层析分离。5）周质表达蛋白：大肠杆菌细胞低浓度溶菌酶处理，渗透压裂解法，周质腔分离出目的蛋白。9、抑制性消减(xio jin)杂交（SSH）的原理和过程原理：SSH的核心技术是抑制性PCR，它是一种(y zhn)将检测子cDNA单链标准化步骤和消减杂交步骤融为一体的技术。抑制性PCR是利用链内复性优先于链间复性的原理，是非目标序列片段两端的长反向重复序列在复性时产生“锅柄样”结构(jigu)或“发夹结构”而无法与引物配对，从而选择性地抑制了非目标序列的扩增。论述题：1、PCR技术的原理、成分、步骤、应用及引物设计的要求1）原理: PCR技

12、术是以DNA互补链的聚合反应为基础，通过DNA变性、引物与模板DNA一侧的互补序列复性杂交，由DNA聚合酶催化引物延伸,最终获得特异DNA片段的体外扩增方法。2)成分：模板、引物、DNA聚合酶（耐高温）、Dntp3）步骤：变性：系统加热至92-96，使 dsDNA（双链）解链成为ssDNA（单链），且热变性不改变其化学性质；退火：降温至37-72，使引物与模 板的互补区相结合； 延伸(ynshn)：在72条件(tiojin)下，DNA聚合酶将 dNTP连续加到引物的3-OH端，合成(hchng)DNA。4）应用：1、引物设计；2、限制性内切酶位点分析；3、DNA 基元查找；4、同源性分析5）引

13、物设计：长度：至少16bp，通常为18-30bp：两个引物之间的Tm最好接近，最好1以内，最多不超过5；避免引物内部或引物之间存在互补序列；G+C含量应尽量控制在40%至60%之间；引物3端的末位碱基对Taq酶的DNA合成效率有较大的影响，A的错配概率较高，应尽量避免使用；引物3端出现3个以上的连续碱基，如GGG或CCC，也会使错误引发机率增加；最好在模板cDNA的保守区内设计；引物序列在模板内应当没有相似性较高，尤其是3端相似性较高的序列，否则容易导致错误引发；的5端可以修饰，而3端不可修饰。2.基因工程技术流程答：1）目的基因克隆2)载体的准备3）目的基因与载体的连接4）重组DNA转化/转

14、染/转导5）体的筛选与鉴定6）重组体的大量培养，外源基因表达效应分析与开发应用3、转化率的计算（结合2回答）例题：某一DNA重组实验的充足率为20%，转化率为107/mg载体，经酶切和连接处理后的重组载体转化率比天然载体低约100倍，欲获得104个重组克隆，需要投入多少载体DNA进行重组实验？解答：若重组率为100%，则转化后产生104个重组克隆需要0.1mg载体DNA,重组率为20%时投入(tur)载体为0.5mg，载体投入量确定后，即可按10:1的要求算出5mg。4、根据(gnj)同源性设计引物（p102-104）/5RACE扩增1）分析(fnx)核心区段获得某蛋白质的氨基酸序列，根据密码

15、子与氨基酸对应关系，选取两段连续的保守氨基酸序列，写出其可能的编码序列，对蛋白质同源性或同源性基因cDNA序列进行充分的比对，如果利用的是蛋白质序列资料，在蛋白质数据库中比较与之同源的蛋白序列，找出蛋白质保守性高的区域，作为引物设计的位点，如果是利用同源cDNA的资料，从数据库中获得多个近缘物种同源序列后，进行序列多重比较，选择高保守性区段序列并设计引物。2）设计简并引物和扩增核心区段由于一个氨基酸可对应一个到多个密码子，因此一段氨基酸序列可以有多个可能的编码序列，称为简并序列。相应合成这一段序列作PCR扩增体系的引物即为简并引物。在选取氨基酸序列时往往优先选取对应密码子较少的残基，为了降低简

16、并度，放弃最后一个氨基酸 其密码子的第三位碱基。设计核心区段扩增的简并引物还要考虑扩增区段的长度和在cDNA分子中的位置，通常扩增序列在几百碱基内效果较好。3）设计RACE引物，并进行3RACE和5RACE扩增 3RACE 根据中间核心序列设计出3端RACE的上游引物后，利用dT作为下游引物，利用mRNA反转录成的第一链cDNA作为模板将cDNA3端扩增出来5 RACE尽管其下游引物可以根据克隆的核心序列可以确定下来，但由于5端上游序列未知，上游的引物难以确定，因而5 RACE要采用一些特殊方法确定其上游引物位点。5.基因工程的安全性问题（主观题，可两方面分析）其他知识点1、Northern杂

17、交(zjio)（RNA）; Western 杂交(zjio)（蛋白质）2、核酸分子骨架中的磷酸基团，呈负离子化状态；所以核酸带负电荷，在一定的电场强度(qingd)的电场中，它们会向正电极方向迁移。3、TA克隆法（填空）A/T克隆法是目前使用最广泛的PCR产物克隆法，无须在产物末端添加酶切位点；主要适用于Taq DNA聚合酶扩增的产物；Taq DNA聚合酶具有末端转移酶的活性，可以在扩增的DNA片段3末端添加一个A(腺苷酸)；Taq DNA聚合酶扩增产物可与T-载体进行互补连接，从而达到高效克隆的目的。4、凝胶电泳的介质：琼脂糖和聚丙烯酰胺5、切口平移制备探针（图，p75）6、基因工程的基本条件：目的基因、载体、工具酶和宿主细胞7、YAC载体的装载量最大8、限制性内切核酸酶的命名：答：1）名的第一个字母和种名的前两个字母，组成3个字母的略语（斜体）表示寄主菌的物种名称；用一个字母代表菌株或型，例如Hind、Hinc等； 3）来自于同一寄主菌株的不同的酶5）酶切消化反应的温度，则以罗马数字表示，例如HindI、HindII、HindII