RNAi技术的发展

1、RNAi技术应用的研究进展生命学院2010级生命基地班喻曙光。RNAi( RNA interference)，即RNA干扰是由与靶基因同源的内源或外源双链RNA( double stranded RNA, dsRNA )所引发的一种在动植物中普遍存在的基因沉默现象。它最早在植物体中被发现，现在已发展成为一 种生物技术，并成为了后基因时代的重要研究手段。对RNAi技术在生物基础、医学、药学和植物学等领 域的研究成果进行综述。RNAi的发现1989年，Matzke等门首次报道了启动子介导的序列同源性基因共转染烟草，可引起转基 因表达发生沉默的现象。1990年，Napoli等把已知色素基因置于强启动

2、子后，导入矮 脚牵牛花中，试图加深牵牛花的颜色，结果却发现花的颜色全部或部分变白。该现象在当时 被称为“共抑制”(co-suppression)，即导入基因后，该基因和牵牛花内源的着色基因都 被抑制了。1995年，康奈尔大学的Guo等尝试用反义RNA去阻断线虫的par-1基因表 达，结果发现反义RNA的确能阻断目的基因的表达，但作为对照的正义RNA，虽不能与活 性RNA结合，也照样能引发抑制。1998年，Fire4将双链RNA( dsRNA)正义链与反义链的混合物注入线虫后，结果出现了比单独注入单链要强得多的沉默，并且导致子一代 同源基因的沉默。这种现象被称为“RNA干扰”(即RNAi，RNA

3、 interference) o同时， 这也是人们第一次对RNAi技术的应用。随后的研究发现，RNAi现象在多种生物中存在， 如线虫、果蝇、斑马鱼、真菌以及植物等，生物体可利用RNAi来抵御病毒的感染，阻 断转座子的作用5。RNAi 的定义目前对RNAi的定义有很多种，不同的资料对其定义的侧重点也不尽相同，如果将RNAi看 作一种生物学现象，可以有以下定义:(1) RNAi是由双链RNA介导的、由特定酶参与的特 异性基因沉默现象，它在转录水平、转录后水平和翻译水平上阻断基因的表达(2) RNAi是 有dsRNA参与指导的，以外源和内源mRNA为降解目标的转基因沉默现象，具有核苷酸 序列特异性的

4、自我防御机制，是一种当外源基因导入或病毒入侵后，细胞中与转基因或入侵 病毒RNA同源的基因发生共同基因沉默的现象。RNAi这种现象已被证实在植物中广泛存 在，它可能是生物的发育调控及抗外源或内源侵染的一种普遍机制。2002年，该发现被 Science杂志评为十大科技突破之一。如果将其作为一门生物技术，则可以定义为:(1) RNAi 是指通过反义RNA与正链RNA形成双链RNA特异性地抑制靶基因的现象，它通过人为地 引入与内源靶基因具有相同序列的双链RNA(正义RNA和反义RNA)，从而诱导内源靶基 因的mRNA降解，达到阻止基因表达的目的;(2) RNAi是指体外人工合成的或体内的dsRNA

5、在细胞内特异性的将与之同源的mRNA降解成21 - 23 nt的小片段，使相应的基因沉默 的技术;(3) RNAi是将与靶基因的mRNA同源互补的dsRNA导入细胞，特异性地降解该 mRNA，从而产生相应的功能表型缺失的技术，属于转录后水平的基因沉默(post-transcriptional genesilence， PTGS)。各种不同定义虽然说法不同，但所描述的事 实是大体相同的，即RNAi就是指由dsRNA介导的基因沉默现象。RNAi 的分子机制目前研究认为，RNAi的过程可能包括起始和效应两个阶段。在起始阶段，加入的小分子RNA 被切割为21 23 nt 长的小分子干扰RNA 片段(s

6、mall interfering， RNAs， siRNAs)，其中一个称为Dicer的酶，是RNaseH家族中特异识别双链RNA的一员，它能以一种ATP依赖的方式逐步切割由外源导入或者由转基因、病毒感染等各种方式引入的双 链RNA，将RNA降解为19 - 21 bp的双链RNAs( siRNAs)，每个片段的3端都有2个碱 基突出。在RNAi效应阶段，siRNA双链结合一个核酶复合物从而形成所谓RNA诱导沉 默复合物(RNA-induced silencing complex， RISC) 。激活RISC 需要一个ATP 将小分 子RNA解双链的过程，激活的RISC通过碱基配对定位到同源mR

7、NA转录本上，并在距离 siRNA 3端12个碱基的位置切UmRNA6j。尽管切割的确切机制尚不明了，但每个RISC都 包含一个siRNA和一个不同于Dicer的RNA酶。另外，还有研究表明，含有启动子区的 dsRNA在植物体内同样被切割成21 -23 nt长的片段，这种dsRNA可使内源相应的DNA 序列甲基化，从而使启动子失去功能，使其下游基因沉默。4 RNAi技术的应用现状近年来，作为一种高效、特异性强的基因阻断技术，RNAi技术发展迅速，在生物学基础、 医学、药学和植物学等很多领域的研究均得到较大发展。4. 1 RNAi在基础学方面的研究4. 1. 1真核细胞基因功能的研究随着基因测序

8、技术和生物信息学的不断发展，果蝇、线虫、 水稻、小鼠和人类基因组测序已经完成，而基因功能的研究步伐却相对缓慢。与传统的基因 功能研究方法(如基因敲除、反义RNA技术等)相比，RNAi技术是一种高效、特异、快捷 和成本相对低廉的基因功能研究手段。利用RNAi技术，可以在RNA水平部分阻断某基因 的表达，获得功能性丧失，进一步研究相关基因的功能。Dunn等刃利用RNAi技术针对 海葵肌动蛋白和半胱氨酸蛋白酶这两个基因，用原位杂交的方法证实这两个基因的表达均受 到抑制，进而研究该基因的功能。4. 1. 2信号转导通路的研究利用RNAi技术可以容易地确定复杂的信号转导途径中相关基 因的上下游关系及其作

9、用。James等应用RNAi技术研究了果蝇细胞系中胰岛素的信号 传导途径，取得了与已知胰岛素信号通路完全一致的结果。另外，基因组范围的RNAi表型 筛选已成为研究基因在特殊细胞功能和生物活性中作用的一种有效方法，但对于相关基因之 间的相互关系还是不能确定。4. 1. 3其他基础研究除了以上两个主要应用方面外，RNAi技术还被应用于生理学、生长发 育过程等方面的基础研究中。Palmer等利用RNAi技术进行动物细胞离子通道生理学的 研究和应用。4. 2 RNAi在医学方面的研究4. 2. 1利用RNAi建立疾病模型传统的建立人类疾病动物模型是利用基因敲除和Cre-LoxP systems方法，但

10、是如果目的基因是小鼠发育必需基因的话，这些方法就会受到很大的限制。 RNAi技术将是建立转基因动物模型的新的工具，随着该技术的发展，它可以通过使组织特 异的基因功能灭活，不再需要条件定向小鼠和组织特异重组小鼠，因而转基因动物将是使用 更加广泛的生物研究工具10。遗传基因工程小鼠已被广泛用于建立人类癌症模型，模型小鼠模拟人类癌症相应的形态学，组织病理学、表型和基因型。这样的疾病模型 对于分析特殊癌症基因和修饰基因的作用、评价常规癌症治疗和新药、鉴定癌症肿瘤生长标 记、分析肿瘤微环境对肿瘤形成的影响、定义潜伏期和肿瘤发展分期等都优于传统的转基因的疾病模型。目前，乳腺、胰腺、肠、结肠和前列腺癌症的基

11、因工程小鼠 模型已经构建，而脑、卵巢、颈和皮肤癌症模型正处于研究的初期阶段11O RNAi除了被 用于建立癌症疾病模型外，也用于其他疾病模型的建立和保护方面。Shcherbata等12利用 遗传和RNAi诱导果蝇细胞激化和肌营养不良表型Kim等13构建重组体慢病毒将shRNAs 定向转移到保守的柯萨奇肠道病毒序列中，用于防治病毒性心肌炎，提高病毒性心肌炎动物 模型的成活率。但是利用RNAi建立的疾病动物模型的性状持续时间不太长，而且不一定能 被稳定遗传，还有其他问题有待继续研究。4. 2. 2 RNAi抗病毒治疗目前，RNAi在抗病毒中的研究主要是设计相应的siRNA,诱发特异的mRNA降解，

12、从而发 挥有效的抗病毒作用。美国麻省理工大学(MIT)的Novina最早开展了利用RNAi抗HIV的 研究，开启了利用RNAi治疗病毒性疾病的先河。随后，又有学者参与到这个研究中来，他 们针对HIV生活周期的不同阶段设计了多种siRNA，针对HIV病毒gag、tat、rev和nef等 基因的siRNA可用以控制病毒复制。研究证实针对病毒基因组的gag区域的siRNA可以有 效的将病毒的基因“沉默”，抑制HIV病毒的复制能力13 15 16】。此外，还有人开展了RNAi 针对其他病毒，如呼吸道合胞病毒、SARS病毒、脊髓灰质炎病毒等的作用的研究，如用脊 髓灰质炎病毒基因组的siRNA处理人类和鼠

13、的细胞，可明显减少子代病毒的数量，并能促 进病毒从感染细胞中清除的速度17。4. 2. 3 RNAi在肿瘤治疗中的研究1、RNAi技术具有高效沉默特定靶基因的特点，在确定单个基因在肿瘤发生发展中的作用 以及探索肿瘤的基因治疗方面是一种强有力的研究工具，因此其应用十分广泛。原癌基因的 活化和/或抑癌基因的失活会导致肿瘤的发生，基于RNAi技术在单基因研究中的优势，利 用RNAi抑制肿瘤细胞内的癌基因和抑癌基因的功能表达，分析其表型变化，有利于揭示肿 瘤发生发展的分子机制，从而为肿瘤的诊断和治疗提供标记物和治疗靶点。Wang等函用 RNAi干扰HeLa细胞中CML66的表达后发现HeLa细胞的增殖

14、、侵袭和转移能力受抑，进 一步研究其机制发现CML66表达受抑后cathepsin L、MMP15、uPAR、VEGF、COX-2、S100A4、MUC1、MDM2 和RAC1均下调，从而推断出CMI 66作为致癌基因通过多途径促进肿瘤的增殖、侵袭和转移。应用RNAi技术对肿瘤侵袭与转移的发生机制及有关基因的 改变进行研究，有助于加深理解恶性肿瘤的生物学本质。Shin等19通过RNAi技术敲除 eaveolin-1表达，从而调节血管细胞黏附分子1( VCAM-1)的表达，使得依赖于VCAM-1的 肿瘤细胞的黏附显著受抑;Tsuchiya等20通过RNAi制备Id1、Id3( Inhibitor

15、 of DNA binding proteins，Id)双倍敲除的胃癌细胞系MKN45,证实Id1、Id3的敲除显著抑制胃癌细胞腹膜 转移。Jiang等知通过RNAi抑制MDA-MB-231和MCF-7 中MTA1基因的表达，从而下 调ERa的表达，结果使这两株乳腺癌细胞的侵袭活性下降。另外，Wang等22设计了针 对目前所知的最强的凋亡抑制因子生存素(survivin )表达的RNAi，导入人食管鳞状上皮细胞癌细胞系KYSE510中，证实下调survivin可以强烈抑制体内和体外癌细胞生长，推 测这种抑制可能是通过诱导凋亡的增强。该研究可加深对食管癌发生机制的了解，而且说明 survivin

16、可能是治疗食管癌潜在的靶位点，RNAi具有潜在的治疗价值。目前国内利用RNAi 抑制survivin的表达在胰腺癌、宫颈癌、肺癌、大肠癌、神经母细胞癌、骨肉瘤细胞和白血 病细胞中均有研究，不过大部分还停留在体外研究阶段。4. 3 RNAi在药学方面的研究利用RNAi进行药物研究利用RNAi能够特异高效地抑制基因表达，获得去基因功能表型， 能够在短时间内大规模筛选靶点，从而实现了在细胞水平和动物水平筛选药靶和评定药靶 *。Hamamichi24利用RNA干扰，系统屏蔽帕金森病模型中将近900个候选基因和通路， 找到了两个帕金森病遗传易感性位点和治疗靶点，从而为该疾病的治疗奠定基础。RNAi在 被

17、广泛应用于功能基因组研究确定了大量潜在的药物作用靶点的同时，也被证实其作为 新一代基因治疗药物的可能性。2006年，美国Acuity制药公司生产的用于治疗湿性老年黄 斑病变的RNAi药物Bevasiranib在RNAi临床试验方面取得成功，它在疗效、安全性方面都优于常规药物。除Acuity制药公司外，另有两家公司也在进行RNAi药物的开发， 一是Alnylam Pharmaceuticals，他们开发的RNAi药物用来治疗呼吸道合胞病毒、流行性 感冒、帕金森病和高胆固醇血症等二是Sirna Therapeutics，他们开发治疗ADM的RNAi 药物Sirna-027已经进入1期临床。其他方面

18、的应用如治疗Huntington病和哮喘以及COPD 也进入临床前研究阶段。但是RNAi药物仍存在如给药途径、使用安全性等方面的问题。4. 4 RNAi在植物学方面的研究RNAi现象首先是在植物研究中发现的，因此RNAi技术在植物方面的应用研究也比较深 入，包括植物功能基因组的研究、植物生长发育的研究、植物抗病性方面的研究和植物改良 方面的研究等多个领域25】。4. 4. 1植物功能基因组的研究随着后基因组时代的到来，人们越来越需要大规模、高通量地 研究基因的功能。由于RNAi具有高度的序列专一性和有效的干扰活力，可以特异地使某些 基因沉默，从而获得功能丧失或降低突变。因此，它可以作为研究基因

19、组学的一种有效工具。 在2002 年11 月，欧洲第五计划（the Arabidopsisgenomic RNAi knock-out line analysis， AGRIKOLA）就已准备用RNAi技术来研究拟南芥所有基因（约25 000个）的功能，方法是利 用拟南芥所有基因片段构建组成型和诱导型RNAi载体，通过农杆菌介导转化拟南芥获得4 000多个组成型hpRNA植株26。另外，Travella等在构建的PDS-RNAi和EINIRNAi 的六倍体小麦转基因作物中，成功地抑制了目的基因。Lawrence等也曾用拟南芥着丝 点甲基化相关的dsRNA，对拟南芥的四倍体进行RNA干扰，发现拟

20、南芥的四倍体中对应的 与甲基化有关的mRNA含量水平剧减。这些都可以证明RNAi技术是多倍体植物功能缺失 突变很好的工具。4. 4. 2植物生长发育及新品种培育的研究雄性不育是高等植物生命活动的一个常见现象，在农业上有巨大的应用价值。Cigan等皿】利用 RNAi技术直接沉默玉米的花粉囊基因表达的启动子MS45,从而抑制花粉囊的形成，形成 玉米的雄性不育株。利用RNAi技术可以创造一些优良的不育材料。Moritoh等或观察 OSGEN-L-RNA的水稻植株，发现一部分育性很低，一部分水稻雄性不育，找到了水稻的 雄性不育材料。经济作物的作用成分含量增加或降低，可以提高作物的经济价值和利用效率。

21、张银波等甲利用RT-PCT技术克隆了油菜PEP基因片段并构建了对应于PEPASE基因 的RNAi载体，以利用RNAi技术抑制PEPASE基因的表达，使代谢流偏向油脂合成，从 而提高油菜籽粒中的油脂含量。另外，还有采用果实特异启动子结合RNAi技术抑制番茄内 源光形态，建成调节基因DET的表达，结果使再生植株中DET1的表达下降，类胡萝卜和 类黄酮含量明显升高，而果实的其他品质参数没有发生大的改变。这些均表明利用器官特异 基因的沉默可以改善植物营养价值。另外，Shinjiro等勿利用RNAi技术对控制咖啡因合 成的基因进行抑制，使材料中的咖啡因含量降低了50% - 70%。RNAi技术可针对植物的 一些表型进行改良，这为人们生活增添了许多乐趣，也增加了一些植物更多经济价值；从另 一层次来说，该技术丰富了植物的品种，尤其是对花卉品质的改良。日本生物研究所使用 RNAi