抗菌药物敏感性试验与耐药检测ppt---生物技术实验教学中心课件

1、实验九 抗菌药物敏感性试验与耐药检测一、实验目的：1. 掌握纸片扩散法（K-B法）的原理、操作方法、结果的判读及临床意义。2. 了解各种稀释法抗生素敏感性试验的原理、操作方法、结果判读和临床意义。3. 掌握纸片扩散法的质量控制，了解稀释法的质量控制。二、实验原理 1. 抗菌药物敏感性试验是测定抗生素或其他抗微生物制剂在体外抑制细菌生长的能力。这种能力可以通过稀释或扩散方法来测定。 1）稀释法敏感性试验 为了定量测定抗菌药物的活性，抗菌药物与肉汤或琼脂培养基混合进行稀释，然后种入试验细菌，孵育过夜，能抑制细菌生长的最低浓度称为该制剂的最低抑菌浓度(MIC) ，然后将MIC 与机体血清或体液中可获

2、得药物浓度相比较，来确定恰当的临床疗效。2）纸片扩散法敏感性试验 将含有一定量抗菌药物的纸片贴在已接种试验菌的琼脂平板上，通过纸片上抗生素的扩散形成不同的药物浓度梯度，在距离纸片一定距离的范围内试验菌的生长受到抑制。这种抑制作用与细菌的敏感性及其他因素相关。 2.抗菌药物敏感性试验目的：1）指导临床医师对各类患者选择最佳抗菌药物。2）在一定区域内积累对公共卫生有关的重要耐药的微生物流行病学资料。3.抗菌药物： 一般指具有杀菌或抑菌活性的药物，包括各种抗生素、磺胺类、咪唑类、硝基咪唑类、喹诺酮类等化学合成药物。 抗生素类包括: -内酰胺类（青霉素类、头孢菌素类、头霉素类、亚胺硫霉素、单环内酰胺类

3、及内酰胺酶抑制剂）、氨基糖苷类、大环内酯类、林可霉素类及四环素类等。内酰胺类：抑制细胞壁合成。青霉素类： 青霉素G、苯唑西林、阿莫西林、氨苄西林头孢菌素类： 头孢拉定等；头孢呋辛 ；头孢他啶；头孢吡肟其他： 亚胺培南、氨曲南、头孢西丁、氨苄西林/舒巴坦 氨基糖苷类： 作用于细菌体内的核糖体，抑制细菌的蛋白质合成的全过程，并破坏细胞膜的完整性。主要作用于G-杆菌 ，如链霉素、卡那霉素等大环内酯类： 通过阻断转肽作用和mRNA位移而抑制细菌蛋白的合成。主要作用于球菌，如红霉素、麦迪霉素等喹诺酮类： 通过拮抗细菌的DNA旋转酶，从而阻断细菌DNA的复制而产生快速杀菌作用。主要作用于G- 杆菌，如环丙

4、沙星 、利福平等1）敏感： 由被测细菌引起的感染，除禁忌症外，可用该抗菌药物常用推荐剂量通过恰当治疗而达到治疗目的。2）中介： 被测菌株对该药物的MIC 接近于血液、组织中通常可达到的浓度，而治疗反应率可能低于敏感菌株。3）耐药： 被测菌株不能被该抗生素的常用剂量，在组织内或血液中达到的浓度所抑制，提示该菌可能存在特定耐药机制(如产-内酰胺酶) ，而且治疗研究表明其临床疗效不可靠。 4.抗菌药物敏感性试验结果判断：原理： 将含有定量抗菌药物的纸片贴在已接种测试菌的琼脂平板上，纸片中所含的药物吸收琼脂中水分溶解后不断向纸片周围扩散形成递减的梯度浓度，在纸片周围抑菌浓度范围内测试菌的生长被抑制，从

5、而形成无菌生长的透明圈即为抑菌圈。 抑菌圈的大小反映测试菌对测定药物的敏感程度，并与该药对测试菌的MIC呈负相关。 5.纸片扩散法（Kirby-Bauer法） （1）分类： 琼脂稀释法、肉汤稀释法、微量稀释法（2）原理： 用水解酪蛋白（MH）培养基将抗生素作不同浓度的稀释，然后接种待测细菌，定量测定抗菌药物对被测菌的最低抑菌浓度(MIC)或最低杀菌浓度（MBC）。6.稀释法 （3）微量液体稀释法原理： 聚乙烯板内含有各种稀释度的抗菌药物，实验时每孔加入100l浓度为105 CFU/ml的菌液，盖上盖板，37孵育1620h观察结果。孔底部清晰不出现细菌沉淀的最低抗菌药物浓度即为该抗菌药物对细菌的

6、最小抑菌浓度，通过CLSI标准判断其敏感和耐药。7. E试验 是一种结合稀释法和扩散法原理对微生物药敏试验直接定量的技术。原理： E试条是一条5mm50mm无孔试剂载体，一面固定有一系列预先制备的浓度呈连续指数增长稀释抗菌药物，另一面有读数和判别的刻度。抗菌药物的梯度可覆盖有20个MIC对倍稀释浓度的宽度范围。将E试条放在细菌接种过的琼脂平板上，经孵育过夜，围绕试条明显可见椭圆形抑菌圈，圈的边缘与试条交点的刻度浓度即为抗菌药物抑制细菌的最小抑菌浓度，对照CLSI标准判断其敏感、耐药、中介。 8.联合药物敏感试验1）方法很多，其中纸片法最为常用。先将试验菌均匀涂布于培养基表面，盖好平皿，放置5分

7、钟，待平板表面水分吸收后，将两种含药纸片贴于平板上，两纸片中心距离2-4mm左右。然后35 孵育过夜，取出观察结果。2）结果判断联合药物敏感试验可出现四种结果：A.无关作用： 甲+乙=甲单或乙单B.拮抗作用： 甲+乙甲单或乙单C.相加作用： 甲+乙=甲单+乙单D.协同作用： 甲+乙甲单+乙单三、实验操作步骤（一）纸片扩散法：1. M-H平板：直径为90mm，厚度 4mm。2. 菌悬液制备：无菌挑取菌落于无菌生理盐水中，校 正浊度至0.5 麦氏。3. 用无菌棉签浸入细菌悬液中，将棉签在试管壁上轻 轻挤压以挤去过多的菌液，用棉签以连续划线的方式均匀涂抹琼脂平板表面三次（每次转60）使菌液均匀分布，

8、最后沿平板内缘涂抹一周。盖上平板的盖子，放置310min。 4.用无菌镊子将抗菌纸片粘贴于M-H琼脂的表面，一旦纸片贴上，不能移动；各抗菌纸片中心距离应大于 24mm，纸片距平板内缘应大于15mm。（滤纸直径为6.35mm，-20保存，使用前放置室温平衡。）5. 37孵育1624h6. 量取抑菌环直径，根据CLSI标准，报告细菌对该抗生素敏感(S)、耐药(R)、中介(I)。 （二）液体微量稀释法1.菌液稀释： 将已稀释好的0.5麦氏的待测菌做200倍稀释；2.抗生素稀释： 取无菌离心管11支，每管加入250ul M-H液体培养基，在第1孔内加入浓度为5120ug/ml的抗生素250ul，混匀；

9、吸取250ul此液体至第2孔中，混匀；依次倍比稀释至第11孔.3.每人取无菌聚苯乙烯板条一条，共12孔；第1-11孔每孔加入100ul加抗生素，第12孔加100ulM-H液体，做对照；4.每个孔加入100ul浓度为105菌悬液（大肠或金葡），混匀，胶布封口，37C培养。 5.观察浊度，凡孔底清晰或不出现细菌沉淀的最低药物浓度即为该抗生素对被测菌的最低抑菌浓度（MIC）。四、 结果判断及临床意义敏感中介耐药最小抑菌浓度(MIC) ： 可完全抑制细菌增长的最低药物浓度。最低杀菌浓度(MBC)： 杀死99.9的供试微生物所需的最低药物浓度。 如果受试药物对供试微生物的MBC大于或等于32倍的MIC，可判定耐药。 五、质量控制：每批或每次实验时应根据测试菌种类分别选用标准菌株在同一试验条件下进行测定。 如：金黄色葡萄球菌ATCC25923 大肠埃希