第04章免疫组化技术2

1、第04章免疫组化技术2 一、生物素-抗生物素免疫组织化学技术 （一）基本原理 鸡蛋中含有一种碱性蛋白，属于糖蛋白，也称卵白素（avidin），分子量68000。卵白素具有4个与维生素H或称生物素（biotin）亲和力极高的结合位点。生物素是一种小分子维生素，分子量244，它与卵白素之间的亲和力比抗原抗体之间的亲和力高100万倍，因而能彼此牢固缔结和而不影响各自的生物活性。同时，生物素与卵白素都具有与其他标记物如荧光素、铁蛋白和过氧化酶等结合的能力。目前，已利用上述特性建立了卵白素-生物素免疫染色系统，为了便于理解，现在统称卵白素为抗生物素或亲和素，因此，卵白素-生物素免疫染色系统又称为生物素-

2、抗生物素免疫组织化学技术 （1）石蜡切片脱蜡至水，用（）漂洗5min3次； （2）滴加0.3% H2O2，37孵育10min，阻断内源性过氧化物酶； （3）用0.01 mol/L PBS漂洗5min3次； （4）滴加10%正常血清/0.3%Triton X-100/0.01 mol/L PBS，37孵育10 min； （5）滴加抗小鼠单克隆抗体（一抗）37 1 h或4过夜，PBS漂洗5min3次； （6）加生物素标记二抗（效价1:200），室温孵育10 min，PBS漂洗5min3次； （7）滴加链霉素抗生物素蛋白-HRP液，室温孵育10min；PBS洗5min3次； （8）滴加DAB，显微镜

3、下显色510min （二）ABC免疫组织化学技术 1981年，许世明等建立了抗生物素-生物素-过氧化物酶法（avidin-biotin-peroxidase complex method，简称ABC法）。ABC是卵白素-生物素结合的HRP复合物的简称。ABC复合物是先将HRP与生物素结合，然后按一定比例将此复合物与卵白素反应，使每一个卵白素分子上结合3个带HRP的生物素，留出一个能与其它生物素结合的空位。复合物上携带的HRP越多，则酶催化的组织化学反应也越强烈，阳性结果也越明显 （三）SABC免疫组织化学技术 链霉亲和素是一种从链霉菌培养物中提取的蛋白质，分子量60000， 含糖链。链霉亲和素

4、也有四个生物素亲合位点，是一种更理想的抗生物素结合蛋白。SABC是链霉亲和素-生物素-HRP复合物（strept-avidin-biotin-peroxidase complex）的简称。SABC复合物先将HRP与生物素结合，然后按一定比例将此复合物与链霉亲和素反应，使每一个链霉亲和素分子上结合3个带HRP的生物素，留出一个尚未被生物素结合的空位，可以与各种生物素标记的抗体结合。复合物上携带的HRP越多，则酶催化的组织化学反应也越强烈，阳性结果也越明显 SABC法是在一抗体反应后，用已结合生物素的抗IgG抗体二抗桥接。然后用SABC孵育，使桥抗上的生物素与SABC中链霉亲和素上的空位结合。最后

5、仍用HRP的底物成色。在SABC法中，一抗是特异性的，二抗是生物素标记的二抗，三抗是SABC复合物。SABC复合物与桥抗体之间是通过生物素结合的，因此SABC复合物没有种属特异性，可适用于任何种属的一抗。 当然，生物素结合的二抗必须是针对一抗种属的。因此，SABC法较PAP法操作更简单、更灵敏。目前，SABC试剂盒已经商品化，可以根据需要购买。 （四）PAP法与ABC法联合（ABPAP）技术 ABPAP使特异性一抗结合更多的酶分子，原始信号得 到更大的放大效应。 （1）石蜡切片脱蜡至水 （2）滴加0.3% H2O2，80%甲醇抑制内源性过氧化物酶 （3）用0.1 胰蛋白酶室温消化10min （

6、4）滴加二抗的正常血清1:10； （5）滴加适当稀释的一抗； （6）加适当稀释的标记二抗； （7）滴加鼠PAP或兔PAP；（8）生物素化马抗鼠或羊抗兔；（9）滴加ABC复合物；（10）滴加0.04% DAB + 0.03% H2O2，（11）蒸馏水漂洗，苏木精复染（必要时），脱水、透明、封片、观察。 评价 ABPAP法较单一PAP法和ABC法更为敏感，抗体稀释度大大提高，尤其是对抗原性较弱、容易破坏或丢失的抗原，能得到较好的效果。但ABPAP法较单一PAP法和ABC法步骤增多、操作复杂，背景着色会相应加深，而且容易脱片。 二、葡萄球菌蛋白A（SPA）免疫组织化学技术 （一）SPA的生物学特性

7、1生化特性 葡萄球菌蛋白A是一种从金黄色葡萄球菌细胞壁分离的蛋白质，简称蛋白A（SPA）。SPA存在于大部分（90%）金葡菌，并且主要存在于血浆凝固酶阳性的菌株。内含3个高度相似的Fc段结合区，每区有50个以上的氨基酸组成，不含色氨酸和半胱氨酸。SPA的羧基末端是赖氨酸，氨基末端结构尚未肯定，其黏度高于球蛋白，等电点，天然结构十分稳定，在应用6mol/L鸟嘌呤盐酸盐变性剂条件下，尚能保存某些三级结构，除去变性剂后，能自然矫正恢复原有结构。 2免疫学特性 SPA具有与人和许多动物如豚鼠、猪、小鼠、猴等IgG结合的能力。SPA结合部位是Fc段而不是Fab段，结合后不影响抗体的活性。SPA具有双价结

8、合力，每分子SPA可同时结合两个IgG分子，也可一方面与IgG结合，同时与标记物（如荧光素）结合。另外，与SPA结合后的IgG可用4mol/L鸟嘌呤盐酸盐使其解离。 3其他特性 SPA能引起豚鼠离体回肠的收缩，在吞噬反应中抑制IgG调理素的吞噬和杀菌作用，SPA-IgG能固定人的补体和人、狗、猪的新鲜补体等 （二）SPA在免疫组织化学中的应用 目前，SPA已广泛应用于免疫球蛋白的制备和分析、免疫组织化学标记、多种病原体（细菌、病毒和支原体等）快速诊断，作为研究免疫复合物、膜抗原、膜受体和膜IgG的固相吸附剂。本节主要介绍SPA在免疫组织化学标记中的应用。SPA可被多种标记物如荧光素、过氧化物酶

9、、胶体金和铁蛋白等所标记，应用较广的为酶标SPA和金标记SPA技术。标记SPA常用的酶为HRP，SPA在PAP法中可以代替桥抗。 1SPA-HRP间接法染色 （1）石蜡切片脱蜡后用0.5% H2O2-纯甲醇液处理20min，抑制内源性过氧化物酶； （2）用Tris-HCl 缓冲液洗涤3min2次； （3）加一抗血清覆盖切片，37孵育30 min； （4）用Tris-HCl 缓冲液洗涤5min3次； （5）滴加适当稀释的SPA-HRP，室温处理30min； （6）用Tris-HCl 缓冲液洗涤5min3次，DAB-H2O2室温显色，蒸馏水漂洗； （7）苏木精复染，脱水、透明、封片，镜下观察反应产

10、物呈棕色。 2SPA用于PAP法染色 （1）石蜡切片脱蜡后用0.3% H2O2-80%纯甲醇液抑制内源性过氧化物酶20min； （2）加10%卵白蛋白Tris 缓冲液，室温作用20min； （3）加一抗血清覆盖切片，37孵育45 min （4）用Tris-HCl 缓冲液洗涤5min； （5）滴加SPA室温处理30min， 缓冲液洗涤5min； （6）加PAP复合物孵育30min， 缓冲液洗涤5min； （7）加DAB（）和0.01% H2O2室温显色5min，蒸馏水漂洗； （8）苏木精复染1min，脱水、透明、封片，镜下观察反应产物呈棕色 三、凝集素免疫组织化学技术 凝集素（lectin）是一

11、种从植物、无脊椎动物和高等动物中提纯的糖蛋白或结合糖的蛋白，因能凝集红细胞（含血型物质）而得名。常用的有植物凝集素（phytoagglutin，PNA），通常以其来源植物命名，如刀豆素（conconvalina，ConA）、麦胚素（wheat germ agglutinin，WGA）、花生凝集素（peanut agglutinin，PNA）和大豆凝集素（soybean agglutinin，SBA）等。凝集素不是来源或参与免疫反应的产物，但具有某些“亲合”特性，可被免疫组织化学所应用，因此，凝集素免疫组织化学应称为凝集素组织化学 （一）凝集素的生物学特性 生物膜中含有一定的糖类，主要以糖蛋白和

12、糖脂的形式存在。凝集素能识别糖蛋白和糖肽，特别是细胞膜中复杂的碳水化物结构，即细胞膜表面的碳水化物决定簇。一种凝集素具有对某种特异性糖基专一性结合的能力，如刀豆素与-吡喃糖基甘露糖（-D-mannopyranosyl）结合，麦胚素与N-乙酰糖胺（N-acetyl glucosamine）结合。因此，凝集素可以作为探针，研究细胞膜上特定的糖基。另外，凝集素具有多价结合能力，能与荧光素、生物素、酶、胶体金和铁蛋白等示踪物结合，从而在光镜或电镜水平显示其结合部位 （二）凝集素在免疫组织化学中的应用 由于凝集素的以上生物学特性，目前已广泛应用作为细胞分化和成熟的标记、细胞特殊类型标记和肿瘤细胞凝结素结

13、合特性的研究。凝集素可以被多种标记物如荧光素、过氧化物酶、生物素等所标记，进行免疫组织化学染色。 1直接法 将标记物质直接标记在凝集素上，使其直接与切片中的相应糖蛋白或糖脂结合。本法简便、快速，但灵敏度不高。将荧光、HRP或胶体金标记的凝集素直接用于未处理组织，简单迅速但敏感性差。 2间接法 将生物素化的凝集素直接与切片中的相应糖基结合，生物素同ABC复合物结合。本法简便、快速，而且灵敏度高。试剂盒已商品化，可以方便购买。 （1）石蜡切片常规脱蜡至水，加0.01%胰蛋白酶消化20min； （2）TBS洗涤5min2次后，在10%BSA中浸育5min，以减少非特异性染色； （3）加与生物素结合的

14、凝集素（10g/ml），孵育60min，TBS洗涤5min2次； （4）加ABC浸育60min，TBS洗涤5min2次； （5）DAB显色，流水洗涤，苏木精复染，脱水、透明、封片。将组织切片孵育于凝集素溶液，使之结合于切片上的糖链，清洗后加凝集素的特异性抗体。该抗体可用FITC、HRP或胶体金标记；也可不标记凝集素抗体，而将二抗标记，或使用未标记二抗，再用PAP复合物完成染色。将凝集素用生物素标记，然后加用标记的抗生物素蛋白，或ABC复合物使之与生物素结合 3糖-凝集素-糖法 利用过量的凝集素与切片中特定的糖基结合，经过冲洗后，凝集素上还存在未被占用的结合位点，将这些未结合的部位与经过氧化物酶

15、标记的特异性糖基结合，形成一个三明治样的糖-凝集素-糖复合物。本法特异性强、灵敏度高，既不像ABC法那样要结合生物素，也不需要像PAP法那样制备抗体。 （1）石蜡切片脱蜡后用0.3% H2O2-纯甲醇液处理20min，抑制内源性过氧化物酶； （2）用凝集素室温孵育30min ，TBS洗涤3min2次； （3）加10g/ml HRP标记的糖液，室温孵育30 min，TBS洗涤5min2次； （4）DAB-H2O2显色，蒸馏水漂洗，脱水、透明、封片。将过量凝集素加于组织切片上（以保证凝集素的结合位点被组织上的糖基不完全占据）再加糖基化的标记物（如岩藻糖基Fuc-HRP)，其中的糖基将结合于未被占据

16、的凝集素结合位点，然后显示标记物。由于目前发现的糖基化的标记物种类不多，故夹层发的使用有限。 第五节 免疫金银及铁标记技术 应用胶体金作为标记物的免疫金染色和免疫金银染色方法，在光镜和电镜下可以进行单标记、双重标记或多重标记，观察组织和细胞结构，定性、定位和定量研究。 一、胶体金的基本概念 1分散体系 体系是一定空间范围内作为研究对象的物质，某一种或几种物质分散到另一种物质中所组成的体系称为分散体系。被分散的物质称为分散相或分散质，而另一种物质称为分散介质。分散体系的某些性质因分散相质点的大小而改变，可分为三类： （1）离子分散体系：分散相以小分子或离子状态分散，这种溶液具有高度稳定性，无论放

17、置多久，分散相颗粒都不会因重力而下沉，不会从容液中分散出来 （2）胶体分散体系：分散相颗粒大小在110nm之间，胶体溶液外观透明不浑浊，普通显微镜下看不见其分散相粒子，不易受重力影响与分散介质分离而沉淀，但其中的溶胶粒子有聚结变大的倾向，即具有聚结不稳定性。 （3）粗分散体系：分散相颗粒由许多分子组成，因粒子较大，肉眼或显微镜即可看到，不稳定，极易因重力作用而自动沉降，外观浑浊不透明。 2胶体金的一般形状 胶体金也称金溶胶，是指分散相粒子直径在l150nm之间的金溶胶，是由金盐被还原成原金后形成的金颗粒悬液，具有一般溶胶的特性。属于多相不均匀体系，颜色呈桔红色到紫红色（颗粒越大，颜色越深）。

18、胶体金可以作为标记物用于免疫组织化学，近10多年来胶体金标记已经发展为一项重要的免疫标记技术。胶体金免疫分析在药物检测、生物医学等许多领域的研究已经得到发展，并越来越受到相关研究领域的重视 3. 胶体金标记蛋白 溶液的pH等于或稍高于蛋白质等电点时，蛋白质呈中性，此时蛋白质分子与胶体金颗粒之间的静电作用较小，但蛋白质分子的表面张力最大，处于一种微弱的水化状态，易于吸附于金颗粒的表面。由于蛋白质分子牢固地结合在金颗粒的表面，形成一个蛋白层，阻止了胶体金颗粒间的相互接触，使胶体金溶液处于稳定状态。为防止蛋白质与胶体金的聚合与沉淀，常用牛血清白蛋白、卵蛋白、聚乙二醇或明胶做稳定剂。 二、免疫金银组织

19、化学技术 （一）免疫金染色 1免疫金法 免疫金法（IGS）染色程序简单，无需显色就能检测细胞表面的抗原，又能检测细胞内抗原。阳性部位显红色，一般要求胶体金颗粒直径大于20nm，浓度较高。分为直接法（标记一抗）和间接法。用IGS定位细胞抗原一般采用间接法。 （二）免疫金银法 免疫金银法（IGSS）的基本原理是通过免疫反应沉积在抗原位置的胶体金颗粒起着一种催化剂作用，用对苯二酚还原剂将银离子（Ag+）还原成银原子（Ago）。被还原的银原子围绕金颗粒形成一个“银壳”，“银壳”一旦形成本身也具有催化作用，从而使更多银离子还原，促使“银壳”越来越大，最终抗原位置清楚放大。 IGSS优点：用于光镜和电镜观

20、察；敏感性高；定位准确；方法简便、安全；成本较低，标本可长期保存 （三）彩色免疫金银法（CIGSS） 是在IGSS基础上发展起来的，基本原理与彩色显影相似。IGSS方法在抗原位点处生成银颗粒，经铁氰化钾与溴化钾的作用即被氧化成溴化银，后者与彩色显影剂接触后即被还原成金属银，而彩色显影剂本身则被氧化，其氧化产物使彩色呈色剂由无色变成有色染料，沉积在银颗粒的部位，金属银变成了银离子。由于染料只能通过彩色显影剂沉积在有银的部位，所以，不与组织发生非特异性吸附。 （四）免疫金银组织化学技术的优点1.胶体金制备简单2.标记简单，抗体生物活性不受影响3.特异性强4.敏感性高5.定位准确6.适应性广7.易于

21、多重双重标记 三、免疫胶体铁组织化学技术 胶体铁（ferric colloid）是一种阳离子胶体，可以通过普鲁士蓝反应呈色，其颗粒有一定的大小和电子密度，最初用于光镜和电镜下定位组织中的阴离子部位，后来用于标记抗体分子，应用于免疫组织化学技术。本法特异性强、敏感性高、背景清晰。 目前常用水合联胺-二甲砷酸-FeCl3煮沸法制备微细颗粒的胶体铁，该方法制备的胶体铁呈棕红色，颗粒大小1nm左右 。 光镜下，阳性部位呈蓝色，细胞核呈红色 第六节 免疫组化双标技术 应用免疫细胞化学方法在同一张组织、细胞片上，同时或先后显示两种或两种以上的抗原成分，称为免疫双重或多重标记技术。光镜下可通过标记物或其反应

22、生成物的颜色来标记不同的抗原成分，电镜下则可通过标记物颗粒的大小来表示不同的抗原成分。本章主要介绍光镜免疫双重或多重标记技术。 一、基本原理和方法 目前已建立了许多方法，根据其作用方式和原理的不同，可以分为洗脱法和非洗脱法两大类。 （一）洗脱法 一般用于光镜下间接法所做的双标。基本原理是在第一种染色完成后，用酸性溶液洗脱这种染色在切片上形成的抗原抗体复合物，从而避免与下一种抗体系统发生交叉反应。按洗脱效果，可以分为以下两种情况。 1洗脱第一种染色中的抗原抗体复合物，但保留显色反应的生成物，然后做下一种染色，并采用不同颜色的反应生成物来标示第二种抗原。这样，两种颜色可同时并存于同一组织片上显示两

23、种抗原。 2洗脱第一种染色中的抗原抗体复合物及显色反应生成物，再做下一种染色。这时第二种染色实际上是在回复为空白的组织片上重新进行，并用不同颜色的反应生成物与前一种结果相区别。这种方法得到的两种染色阳性结果是先后而不是同时并存在同一组织片上。要比较和了解它们之间的关系，必须在完成第一种染色后先拍照，然后在第二种染色后找到同一区域再次拍照，比较两次照片的结果。 （二）非洗脱法 在染色过程中，不用洗脱第一种染色的抗原抗体复合物及显色反应产物，而用多种不同的技术方法来避免与第二种染色抗体系统的交叉反应，即非洗脱法。较常用的非洗脱法有以下几种。 1直接法 把不同颜色的标记物分别标记到各个特异性抗体（一

24、抗）上，采用直接法染色，特异性抗体分别与相应的抗原结合，使抗原由不同的标记物显示出来，实现双标或多标（图6-1）。 图6-1 直接法免疫双重染色原理X、Y为两种抗原 HRP为辣根过氧化物酶 AP为碱性磷酸酶 2间接法-异种动物抗体法 不同种动物IgG的Fc段抗原有种属特异性，因此相应的抗体不会发生交叉反应。用间接法染色时，不同的一抗（如兔抗X抗原的抗体和豚鼠抗Y抗原的抗体）可混合在一起使用，不同的二抗（如羊抗兔IgG和猪抗豚鼠IgG）也可混合在一起应用，不同种属的一抗和二抗各自与相应的抗原（X和Y）反应，从而将两种抗原同时显示出来（图6-2A）。如果二抗不是标记抗体而只是作为桥抗体，则可再与三

25、抗反应，后者分别由产生一抗的同种动物产生，又与不同的标记物结合，最终显示出不同的抗原所在部位（图6-2B）。 图6-2 间接异种动物抗体法和双重免疫染色原理 3间接法-同种动物抗体法 也称分步固定法。做第一种染色时，在一抗（兔抗X）与组织抗原X结合后，用第一种标记二抗（如FITC-羊抗兔IgG）饱和一抗（兔抗X）上的抗原决定簇，这就排除了第二种染色时所用的二抗（如TRITC-羊抗兔IgG）再与之结合的可能。此时由于二抗过量，每个FITC-羊抗兔IgG分子上的两个抗原结合部位（Fab段）只有其中一个与一抗上的抗原决定簇结合，另一个处于游离状态，有可能与下一种染色中的一抗（兔抗Y）交叉反应。因此，

26、在完成第一种染色后，用多聚甲醛蒸气处理组织片，使二抗的游离抗原结合部位失活，即可消除第二种染色中所用的一抗（兔抗Y）与之发生交叉反应的可能，使各种免疫染色所用抗体都不再会有交叉反应，从而可以一种接一种地进行多种免疫显色（图6-3）。 图6-3 间接法同种动物抗体法（分步固定法）多重免疫染色原理 4标记抗原法: 应用这一方法前，首先用不同的标记物分别标记与待检抗原相同的纯抗原。染色时先用未标记的特异性抗体与组织抗原反应，由于抗体过量及空间结构的原因，每个特异性抗体IgG分子中只有一个抗原结合部位（Fab段）与组织抗原结合，另一个则与后来所用的标记纯抗原结合，从而显示出相应的组织抗原的部位。采用本

27、法时，即使抗体不纯也不会影响结果的特异性，因为标记好的纯抗原只与相应抗体结合，从而使组织中相应的抗原分别得到特异性显示（图6-4）。图6-4 标记抗原法免疫双重染色原理 5其他方法 免疫荧光法和免疫酶法的敏感性不同，可以组合应用实现双标。先用免疫酶法作第一重染色，由于敏感性高，一抗可以高度稀释，显色反应后，二抗又被显色反应生成物包绕，不易与下一重的一抗相结合。此后以免疫荧光法作第二重染色，由于敏感性低，所用的抗体系统不会与前一重染色中高度稀释的抗体交叉反应，就能分别标示出不同抗原。同样，还可将免疫金银法与上两种方法做不同组合，或将免疫金银法与免疫金法组合来实现双标。 二、免疫荧光双标技术 最适

28、合观察存在于同一细胞内的不同抗原。不同的荧光素在相应的光波激发下会呈现不同的颜色，例如异硫氰荧光素（FITC）呈绿色，异硫氰酸四甲基罗丹明（TRITC）呈红色荧光。把它们分别标记在不同的抗体上，各自与相应的抗原相结合，就能实现用不同颜色显示不同的抗原。由于每种荧光素在特定波长的光波激发下才呈现相应的荧光（如FITC在490nm光波激发下呈绿色，TRITC在546nm光波激发下呈红色），用荧光显微镜观察双标阳性结果时，可以依次选用特定波长的激发滤光片分别观察。 要精确地比较阳性结果，则需用两次曝光的技术，选用彩色底片，先对一种颜色荧光显示的阳性结果拍照，然后转换激发滤光片，对另一种颜色荧光显示的

29、阳性结果作第二次曝光，此时不可移动载玻片，以保证切片上不同颜色代表的相应抗原，可以分析比较它们相互间的关系。也可以不移动切片，同时拍两张不同颜色荧光照片，比较抗原存在部分，对处于同一细胞内的抗原，用这种方法观察结果较好。有时在同一波长观察两种荧光，并进行照相也能得到较满意的结果。 （一）洗脱法 用同种动物产生的特异性抗血清为一抗（如兔抗X抗原及兔抗Y抗原血清），二抗也由一种动物产生（如羊抗兔IgG），但用不同颜色的荧光素分别标记（如FITC-羊抗兔IgG及TRITC-羊抗兔IgG）。 1设备与试剂 （1）湿盒，冰箱和烤箱。 （2）伊文蓝溶液：取伊文蓝lg溶解于l00ml PBS中，加入1%Na

30、N3 1m1。过滤后 贮存于4冰箱中。用前取，加稀释成0.01%浓度使用。 （3）洗脱液：12.5%高锰酸钾（KMn2O4）1ml，5%硫酸（H2SO4）1ml，加蒸馏水140ml混匀而成。 （4）0.5%焦亚硫酸纳还原液：500mg焦亚硫酸钠（Na2S2O5）加蒸馏水至l00ml。 （5）甲基绿溶液：0.1%甲基绿4m1加入PBS 36ml混匀。 （6）缓冲甘油：纯甘油（分析纯）20ml，加入碳酸缓冲液（）20m1，充分混匀，待其中气泡完全消失，即可使用。 （7）碳酸缓冲液（）：将NaHCO3 ，Na2CO2溶解于l00m1蒸馏水中，混合，调pH至。 2操作步骤 （1）石蜡切片经二甲苯脱蜡，

31、降乙醇至水；固定组织的恒冷切片，直接入；新鲜组织的恒冷切片，室温干燥3060min，在100%冷丙酮内固定5l0min后入PBS，组织周边擦干。 （2）滴加适当稀释度的免疫血清，在湿盒、37温箱中放置3060min，或在4冰箱中过夜。 （3）PBS洗3次，每次5min，吸水纸吸去残留液。 （4）滴加适当稀释度的间接荧光抗体（用0.01%伊文蓝溶液稀释，以消除非特异性自发荧光），在湿盒中37放置3060min。 （5）PBS洗2次，每次5min，再用蒸馏水洗1min。（6）甘油缓冲液封固，荧光显微镜观察，拍照。（7）PBS泡数分钟，去除封固，蒸溜水洗50min。（8）入洗脱液，洗脱时间随切片厚度

32、而定，一般为15min，较厚的振动切片，需10min以上。（9）切片置入0.5%焦亚硫酸钠液30s。（10）流水冲洗1020min，蒸馏水浸5min。（11）重复步骤26进行第二重免疫荧光染色。 若需要，可用甲基绿套染核，染色5min，再用PBS洗5min，然后封固。在荧光显微镜下观察，可见细胞核呈红色。如果前一重染色中二抗是FITC标记的羊抗兔IgG，则第二重可用TRITC标记的羊抗兔IgG为二抗。完成第二重染色后，在镜下找到第一次拍照的部位再次摄影，比较两重染色的结果。由于洗脱法不能使两种荧光素同时存在于一张切片上，因而不能用二次曝光的方法在同一张照片上显示出两种抗原。 3注意事项 （1）

33、每次洗脱后，在进行下一重染色之前鉴定洗脱效果。例如，在洗脱第一重染色中显示X抗原抗体复合物后，先用非免疫血清（正常兔血清）或Y抗原吸附灭活的抗血清代替抗Y血清，以同样步骤做第二重染色，结果应为阴性，如果出现阳性，即表明洗脱不完全，第一重染色中残留的抗体系统与后一重抗体系统发生了交叉反应，阳性部位是X抗原而不是Y抗原。不经鉴定直接做第二重染色，就可能把第一重染色残留的抗体系统表现出来的假阳性结果误为Y抗原，影响结果的准确性。 （2）本法中应用的洗脱液具有很强的氧化作用，可能损害下一重染色所需要显示的组织抗原的抗原性，造成洗脱后的假阴性结果。为此，在对组织切片做双重染色之前，最好先用免疫组织化学滤

34、纸模型，检测洗脱液对所要染的各种抗原是否有破坏作用，也可将数张组织切片先用洗脱液处理后，分别对各个抗原做一重染色，了解最易受洗脱液损害的抗原。在双重染色中，第一重染色总是先行显示最娇弱的抗原，而把能经受洗脱液作用的抗原留待第二重染色中显示。 （二）非洗脱直接法 直接法双标的前提要备有不同荧光素分别标记的特异性抗体，如FITC标记的兔抗X抗体，TRITC标记的兔抗Y抗体。 1设备与试剂 同洗脱法。 2实验步骤 （1）切片准备：同洗脱法。 （2）把标记好的抗X、抗Y荧光抗体，按适当稀释度混合在一起（用0.01%伊文蓝溶液稀释）滴加在切片上，37中放置3060min。或4过夜。 （3）倾去荧光抗体，

35、PBS洗2次，每次5min，蒸馏水洗1min。 （4）50%甘油缓冲液封固。 （三）间接法-异种动物抗体法 所用的特异性抗体来自不同种动物，如兔抗X血清，由鼠抗Y血清，然后用FITC标记羊抗兔IgG，TRITC标记猪抗鼠IgG作为相应的二抗。染色时，不同的一抗可以混合在一起，不同的二抗也可混合在一起，按间接免疫荧光法步骤进行。当一抗分别与切片上的X、Y抗原结合后，再用混合二抗与之反应。由于兔和鼠IgG的Fc段抗原有种属特异性，因此羊抗兔IgG和猪抗鼠IgG各自与相应的Fc段抗原结合，不会交叉反应，X抗原即被FITC标示，Y抗原则为TRITC标示。这一方法的特异性与直接法一样，但敏感性高于后者。

36、 （四）间接法-同种动物抗体法 本法应用兔抗X、兔抗Y抗原的血清为一抗，二抗也可由一种动物产生，如羊抗兔IgG，但是用不同的荧光素如FITC及TRITC分别标记，以显示肽类抗原的方法为例，操作步骤如下： （1）石蜡切片厚35m，脱蜡进水。 （2）以l%人血清白蛋白（HAS）或10%正常羊血清作用10min，阻断切片对蛋白质非特异性吸附。 （3）用适当稀释的兔抗X血清与之反应，一抗的稀释度及反应时间均按间接免疫荧光法摸出的最佳条件而定。 （4）以（、内含l%Triton Xl00，下同）洗5min，共3次。 （5）TRITC标记的羊抗兔IgG在室温下反应1h。 （6）PBS洗10min，共3次，

37、这时第一重染色已完成，X抗原由TRITC显示。 （7）切片逐级乙醇脱水，二甲苯透明，空气中干燥后，置多聚甲醛密闭容器中，80温箱内以甲醛蒸气固定24h，使第一重染色中二抗的抗原结合部位失活。 （8）将切片以TBS洗5min，共3次。 （9）1%HAS（或10%正常羊血清）作用30min。 （10）再以适当稀释的兔抗Y血清及FITC标记的羊抗兔IgG，按上述步骤做第二重染色。 （11）TBS洗后，以缓冲甘油封盖，在荧光显微镜下分别以546nm及490nm波长的激发光观察TRITC及FITC所标示的X、Y抗原所在部位。 （12）如用彩色底片对切片同一部位用546nm及490nm波长的激发光分别做两

38、次曝光，即可在同一张照片上显示不同颜色标示的两种抗原。 这种双标方法的关键在于完成第一重染色后，用多聚甲醛蒸气使二抗的游离抗原结合部位被固定而失活，不会再与下一重染色中的抗体系统发生交叉反应，因此也可称为分步固定法。多聚甲醛蒸气处理切片的时间，需根据切片的厚度掌握，一般5m厚的切片，蒸气固定的时间需长达4h，效果较好。处理时间太短，可能使抗体灭活不彻底，仍然有可能与下一重染色中的一抗交叉反应。 同洗脱法一样，为检查甲醛蒸气固定对抗体的灭活效果，可以用正常兔血清以取代第二重染色中的一抗，按前述步骤做第二重染色，如果出现阳性，表明灭活不彻底，就需要再延长甲醛蒸气固定时间。 凡是经过甲醛溶液固定后仍

39、然能保持抗原性的抗原，用这种分步固定法可以取得良好的双重或多重免疫染色结果，有些抗原对甲醛固定作用比较敏感，其抗原性可能被破坏，对这样的抗原可以在第一重染色中先行显示。 多聚甲醛蒸气对FITC和TRITC的颜色和强度几乎没有影响，但因FITC的荧光比较容易衰退，因此在第一重染色中先用TRITC标记的二抗，在第二重染色中再用FITC标记的二抗效果较好。 三、免疫酶标双标技术 免疫酶标双标技术与免疫荧光双标技术的原理有很多相同之处，但作为标记物的酶有好几种，如辣根过氧化物酶（HRP）、碱性磷酸酶（AP）、葡萄糖氧化酶（GO）等，它们各自又有几种不同的底物，显色反应所得颜色也各不相同，因此，免疫酶染

40、色的方法种类比免疫荧光染色更多样化。 酶反应物性质较稳定，不像标记在抗体上的荧光素那样容易被洗脱，在光镜下同一张切片可同时见到两种颜色的显色物并存，不必像两重荧光染色那样分别观察。 （一）洗脱法 原理步骤都与前述洗脱法双重免疫荧光染色相似，可按不同的酶和底物系统呈色，在完成第一重免疫酶染色后，将抗原抗体复合物洗脱，再做第二重染色。 用于双重酶染色的洗脱液有多种，常用的是的甘氨酸-盐酸溶液，能够消除第一重染色的抗体系统与下一重染色的交叉反应，但保留显色反应所得的颜色。 （二）非洗脱法 1. 直接法 将两种不同的酶分别标记于两种特异性抗体上，用直接法染色，再分别由两种酶的底物呈色，即可得到双重染色结果。 如果采用同一种酶标记在不同的抗体上，则只能用顺序染色法。即先做第一重染色，用第一种底物与已定位的酶反应呈色，再进行第二重染色。在酶定位于第二种抗原后，用另一种底物显示不同的颜色。这往往需要一重染色的双倍时间。 2间接法 用两种酶作标记物双重染色时，第一重染色总是选用辣根过氧化物酶，第二重染色中，可按需要选择不同的酶。 如果一抗由不同种动物产生（如兔抗X，鼠抗Y），又有相应