兽药残留的检测方法定稿文件

1、-PAGE . z.说明书摘要本创造提供一种兽药的检测方法，所述方法包括如下步骤：1样品的处理：将待测样品进展前处理，参加提取剂后经过多个步骤处理得到上清液过滤得到的滤液用于UPLC-MS/MS测定；2兽药残留的测定，将得到的样品在一定的测定条件下进展超高效液相色谱与质谱联用的测定。本创造的检测方法具有灵敏度高，专属性强的特点，能够满足兽药残留的测定。-PAGE . z.权利要求书一种兽药残留的检测方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：1样品的处理：将待测样品进展前处理，参加提取剂后进展匀浆，之后进展超声提取，之后进展第一次离心别离得到上清液，用氮气将上清液吹干后得到的剩余物用初始流动相溶解

2、，混匀，之后进展第二次离心别离得到上清液，取上清液进展微孔滤膜过滤得到的滤液用于UPLC-MS/MS测定；2兽药残留的测定将步骤1得到的样品进展超高效液相色谱与质谱联用的测定，测定条件如下：色谱条件：色谱柱为Waters Acquity UPLC BEH C18柱；流动相为甲醇和甲酸水溶液，洗脱方式为梯度洗脱；质谱条件：电喷雾离子源(ESI+)；源温为105-115；脱溶剂温度为340-360；脱溶剂气流速度为600Lh-1-700Lh-1；锥孔反吹气流速度为45 Lh-1-55Lh-1。如权利要求1所述的兽药残留的检测方法，其中所述兽药为四环素类药物、受体冲动剂类药物、喹诺酮类药物、磺胺类药

3、物。如权利要求1或2所述的兽药残留的检测方法，其中所述兽药为四环素、土霉素、金霉素、强力霉素、特步他林、西马特罗、沙丁胺醇、菲诺特罗、莱克多巴胺、氯丙那林、克伦特罗、妥布特罗、喷布洛尔、苯乙醇胺A、培氟沙星，环丙沙星，恩诺沙星，氧氟沙星，伊诺沙星、吡哌酸、萘啶酸、西诺沙星、诺氟沙星、达氟沙星、洛美沙星、二氟沙星、沙氟沙星、司帕沙星、磺胺邻二甲氧嘧啶、磺胺嘧啶、磺胺噻唑、磺胺吡啶、磺胺甲基嘧啶、磺胺二甲基噁唑、磺胺对甲氧嘧啶、磺胺二甲嘧啶、磺胺甲噻二唑、磺胺甲氧哒嗪、磺胺甲噁唑、磺胺氯达嗪、磺胺间甲氧嘧啶、磺胺醋酰、磺胺二甲异噁唑、磺胺苯吡唑、磺胺二甲氧嘧啶和/或磺胺喹噁啉中的一种、几种或全部。

4、如权利要求1-3任一项所述的兽药残留的检测方法，步骤2所述梯度洗脱程序为：0-10.0 min：甲醇的体积比为3.0-90.0%；：甲醇的体积比为90.0-3.0；min：甲醇的体积比为3.0。如权利要求1-4任一项所述的兽药残留的检测方法，其中步骤1所述氮气吹干上清液的温度为25-35，优选在30下进展。如权利要求1-5任一项所述的兽药残留的检测方法，其中步骤1所述第一次离心和第二次离心的转速为9000 rmin-1-11000 rmin-1，离心的时间为8 min -12min，优选所述第一次离心和第二次离心的转速为10000 rmin-1，离心的时间为10 min。如权利要求1-6任一项

5、所述的兽药残留的检测方法，其中步骤1所述提取剂为10%三氯乙酸水溶液与乙腈的混合溶液；优选两者的体积比例为10%三氯乙酸水溶液：乙腈=1525：7585；更优选两者的体积比例为10%三氯乙酸水溶液：乙腈=20：80。如权利要求1-7任一项所述的兽药残留的检测方法，其中步骤1所述在第一次离心别离后得到上清液的同时得到沉淀，对沉淀进展再次提取，得到上清液与第一次离心别离得到的上清液进展合并，将合并后的上清液进展下一步骤的氮气吹干。如权利要求1-8任一项所述的兽药残留的检测方法，其中步骤2的甲酸水溶液的质量浓度为0.04-0.07，优选质量浓度为0.05。如权利要求1-9任一项所述的兽药残留的检测方

6、法，其中步骤2所述色谱条件：色谱柱为Waters Acquity UPLC BEH C18柱；流动相为甲醇和甲酸水溶液，洗脱方式为梯度洗脱；流速为0.25 mLmin-1；柱温为30。质谱条件：电喷雾离子源(ESI+)；毛细管电压为3.5 KV；锥孔电压为3.0 V；RF透镜电压为0.5 V；源温为110；脱溶剂温度为350；脱溶剂气流速度为650Lh-1；锥孔反吹气流速度为50Lh-1。-PAGE . z.说明书一种兽药残留的检测方法技术领域本创造涉及以一种检测方法，特别是涉及一种兽药残留的检测方法。背景技术兽药在防治动物疾病、提高生产效率、改善畜产品质量等方面起着十分重要的作用。然而，由于

7、养殖人员对科学知识的缺乏以及一味地追求经济利益，致使滥用兽药现象在当前畜牧业中普遍存在。随着人们对动物源食品由需求型向质量型的转变，动物源食品中的兽药残留已逐渐成为全世界关注的一个焦点。兽药残留是指用药后蓄积或存留于畜禽机体或产品(如鸡蛋、奶品、肉品等)中原型药物或其代产物，包括与兽药有关的杂质残留。目前，在动物源食品中较容易引起兽药残留量超标的兽药主要有抗生素类、磺胺类和激素类等药物。滥用兽药极易造成动物源食品中有害物质的残留，这对人体安康造成直接危害。例如长期食用兽药残留超标的食品后，当体蓄积的药物浓度到达一定量时人体会产生多种急慢性中毒现象。目前，国外已有多起有关人食用盐酸克仑特罗超标的

8、猪肺脏而发生急性中毒事件的报道。四环素类药物能够与骨骼中的钙结合，抑制骨骼和牙齿的发育。磺胺类药物能够破坏人体造血机能等。另一方面，动物机体长期反复接触*种抗菌药物后，其体敏感菌株受到选择性的抑制，从而使耐药菌株大量繁殖，耐药性细菌的产生使得一些常用药物的疗效下降甚至失去疗效。此外，滥用兽药对畜牧业的开展和生态环境也造成极大危害。动物用药后，一些性质稳定的药物随粪便、尿被排泄到环境中后仍能稳定存在，从而造成环境中的药物残留。长期滥用药物严重制约着畜牧业的安康持续开展。如长期使用抗生素易造成畜禽机体免疫力下降，影响疫苗的接种效果，还可引起畜禽源性感染和二重感染。对动物性食品中的兽药残留进展监控的

9、一个重要手段就是建立快速准确的残留分析方法。目前，报道的文献及国家标准多是单一兽药或单一种类兽药的检测方法，但在实际工作中，由于动物性食品平安的保证需要多个指标进展综合指证，因此，单个样本常需要屡次检测工作，极大的浪费了人力、物力及财力。多残留的检测能够更好的节省时间、提高工作效率，并能更加有效地监测动物产品的平安性。另一方面，国外报道的动物源性食品中药物残留检测的检测方法主要有液相色谱法HPLC、气相色谱-质谱联用法(GC-MS)、液相色谱-串联质谱联用法(LC-MS/MS)、酶联免疫法及生物传感器技术。酶联免疫分析技术(ELISA)是一种将酶化学反响的敏感性和抗原抗体免疫反响的特异性相结合

10、的方法，其敏感性和特异性较好。ELISA具有样品前处理简单，纯化步骤少，大量样本分析时间短，适合于做成试剂盒现场筛选等优点，使其可实现快速现场监测，是现阶段食品平安检测领域应用较多的一项检测技术。但它也存在着很多缺陷：对试剂的选择性高，很难同时分析多种成分；对构造类似的化合物有一定程度的穿插反响；分析分子量很小的化合物或很不稳定的化合物有一定的困难。生物传感器是由一种生物敏感膜和电化学转换器两局部配合，对特定种类的化学物质或生物活性物质具有选择性和可逆响应的分析装置。在兽药残留分析上得到了较广泛的应用。虽然生物传感器具有微型化、响应速度快、样品用量少的特点，但还存在着结果的稳定性、重现性和使用

11、寿命方面的问题。现有技术的方法常有灵敏度不高、前处理繁琐、检测药物单一或重现性不好等问题，很难满足对药物残留的同时确证检测。液质联用HPLC-MS的检测方法以液相色谱作为别离系统，质谱为检测系统。样品在质谱局部被离子化后，经质谱的质量分析器将离子碎片按质量数分开，经检测器得到质谱图。液质联用表达了色谱和质谱优势互补，将色谱对复杂样品的高别离能力，与MS具有高选择性、高灵敏度及能够提供相对分子质量与构造信息的优点结合起来，在药物分析领域具有了广泛的应用。液质联用HPLC-MS分析样品中定性和定量方面的优势是单独液相分析不能媲美的。创造容本创造解决的技术问题是：提供一种新的兽药残留的检测方法，其是

12、通过液质联用的检测方法实现多种类多样品的检测。具体来说，本创造是通过如下技术方案实现的：一种兽药残留的检测方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：1样品的处理：将待测样品进展前处理，参加提取剂后进展匀浆，之后进展超声提取，之后进展第一次离心别离得到上清液，用氮气将上清液吹干后得到的剩余物用初始流动相溶解，混匀，之后进展第二次离心别离得到上清液，取上清液进展微孔滤膜过滤得到的滤液用于UPLC-MS/MS测定；2兽药残留的测定将步骤1得到的样品进展超高效液相色谱与质谱联用的测定，测定条件如下：色谱条件：色谱柱为Waters Acquity UPLC BEH C18柱；流动相为甲醇和甲酸水溶液，洗脱

13、方式为梯度洗脱；质谱条件：电喷雾离子源(ESI+)；源温为105-115；脱溶剂温度为340-360；脱溶剂气流速度为600Lh-1-700Lh-1；锥孔反吹气流速度为45 Lh-1-55Lh-1。其中，所述兽药为四环素类药物、受体冲动剂类药物、喹诺酮类药物、磺胺类药物。其中，所述兽药为四环素、土霉素、金霉素、强力霉素、特步他林、西马特罗、沙丁胺醇、菲诺特罗、莱克多巴胺、氯丙那林、克伦特罗、妥布特罗、喷布洛尔、苯乙醇胺A、培氟沙星，环丙沙星，恩诺沙星，氧氟沙星，伊诺沙星、吡哌酸、萘啶酸、西诺沙星、诺氟沙星、达氟沙星、洛美沙星、二氟沙星、沙氟沙星、司帕沙星、磺胺邻二甲氧嘧啶、磺胺嘧啶、磺胺噻唑、

14、磺胺吡啶、磺胺甲基嘧啶、磺胺二甲基噁唑、磺胺对甲氧嘧啶、磺胺二甲嘧啶、磺胺甲噻二唑、磺胺甲氧哒嗪、磺胺甲噁唑、磺胺氯达嗪、磺胺间甲氧嘧啶、磺胺醋酰、磺胺二甲异噁唑、磺胺苯吡唑、磺胺二甲氧嘧啶和/或磺胺喹噁啉中的一种、几种或全部。其中，步骤2所述梯度洗脱程序为：0-10.0 min：甲醇的体积比为3.0-90.0%；：甲醇的体积比为90.0A-3.0；min：甲醇的体积比为3.0。其中，步骤1所述氮气吹干上清液的温度为25-35，优选在30下进展。其中，步骤1所述第一次离心和第二次离心的转速为9000 rmin-1-11000 rmin-1，离心的时间为8 min -12min，优选所述第一次离

15、心和第二次离心的转速为10000 rmin-1，离心的时间为10 min。其中，步骤1所述提取剂为10%三氯乙酸水溶液与乙腈的混合溶液；优选两者的体积比例为10%三氯乙酸水溶液：乙腈=1525：7585；更优选两者的体积比例为10%三氯乙酸水溶液：乙腈=20：80。其中，步骤1所述在第一次离心别离后得到上清液的同时得到沉淀，对沉淀进展再次提取，得到上清液与第一次离心别离得到的上清液进展合并，将合并后的上清液进展下一步骤的氮气吹干。其中，步骤2的甲酸水溶液的体积浓度为0.04-0.07，优选体积浓度为0.05。其中，步骤2所述色谱条件：色谱柱为Waters Acquity UPLC BEH C1

16、8柱；流动相为甲醇和甲酸水溶液，洗脱方式为梯度洗脱；流速为0.25 mLmin-1；柱温为30；质谱条件：电喷雾离子源(ESI+)；毛细管电压为3.5 KV；锥孔电压为3.0 V；RF透镜电压为0.5 V；源温为110；脱溶剂温度为350；脱溶剂气流速度为650Lh-1；锥孔反吹气流速度为50Lh-1。本创造的有益技术效果如下：本创造的检测方法具有灵敏度高，专属性强的特点。本创造采用的超高液相色谱进展测定，超高效液相色谱Ultra Performance Liquid Chromatography简称UPLC是别离科学中的一个全新类别，UPLC借助于HPLC的理论及原理，涵盖了小颗粒填料、非常

17、低系统体积及快速检测手段等全新技术，增加了分析的通量、灵敏度及色谱峰容量。超高液相色谱在测定上相对于普通液相色谱存在很多优点。与传统的HPLC相比，UPLC的速度、灵敏度及别离度分别是HPLC的9倍、3倍及1.7倍，它缩短了分析时间，同时减少了溶剂用量降低了分析本钱。UPLC-MS/MS联用技术，结合了液相色谱的高别离能力和质谱提供构造信息的功能，具有灵敏度高、选择性强的优势，尤其是串联质谱技术 (MS/MS或MSn) 的应用，可以获得丰富、有效的化合物构造信息，建立快速、高效的分析研究体系。本创造的目的是抑制现有技术的缺乏，针对4种四环素类药物、18种磺胺类药物、14种喹诺酮类药物及10种受

18、体冲动剂药物建立了一种快速简便、专属性强、灵敏度高的超高效液相色谱-串联质谱(UPLC-MS/MS)方法，以保障对动物源性食品中该类药物残留的检测。此外，本创造为了提高分析的灵敏度和专一性，进展多时间段的多反响检测扫描MRMmulti-period MRM，mpMRM，即按照待测药物的保存时间，分为多个时间段分别进展MRM扫描，并同时进展定性和定量的双离子通道分析，进而进一步提高该方法的准确性和专属性。本创造建立了稳定高效的测定方法，当待测样品通过本创造测定方法进展测定时，通过与所述的定性离子色谱图及保存时间进展残留药物的定性分析，并进一步通过定量离子色谱图和标准曲线最终确定残留药物的含量。附

19、图说明图1：4种四环素类药物混合对照物的定量离子通道色谱图；图2：10种-受体冲动剂类药物和3种氘代标混合对照物的定量离子通道色谱图；图3：14种喹诺酮类药物混合对照物的定量离子通道色谱图；图4 18种磺胺类药物混合对照物的定量离子通道色谱图；上述各图是UPLC-MS/MS测定结果的原始图谱，由于软件系统是英文的，故输出的原始图是英文的，其中1207代表样品的名称，图中的英文翻译如下：Channels ：质谱检测离子的通道Tetracycline：四环素、O*ytetracycline：土霉素、Chlorotetracycline：金霉素、Do*ycycline：强力霉素；Terbutalin

20、e；特步他林、Cimaterol：西马特罗、Salbutamol：沙丁胺醇、Salbutamol-D6：氘代沙丁胺醇、Fenoterol：菲诺特罗、Ractopamine：莱克多巴胺、Ractopamine-D6：氘代莱克多巴胺、Clorprenaline：氯丙那林、Clenbuterol：克伦特罗、Clenbuterol-D9：氘代克伦特罗、Tulobuterol：妥布特罗、Penbutolol：喷布洛尔、Phenyl EA A：苯乙醇胺A；Peflo*acin：培氟沙星，Ciproflo*acin：环丙沙星，Enroflo*acin：恩诺沙星，Oflo*acin：氧氟沙星，Eno*acin

21、：伊诺沙星、Pipemidic Acid吡哌酸、Nalidi*ic Acid：萘啶酸、Cino*acin：西诺沙星、Norflo*acin：诺氟沙星、Danoflo*acin：达氟沙星、Lomeflo*acin：洛美沙星、Diflo*acin：二氟沙星、Saraflo*acin：沙氟沙星、Sparflo*acin：司帕沙星;Sulfado*ine：磺胺邻二甲氧嘧啶、Sulfadiazine：磺胺嘧啶、Sulfathiazole：磺胺噻唑、Sulfapyridine：磺胺吡啶、Sulfamerazine：磺胺甲基嘧啶、Sulfamo*ol：磺胺二甲基噁唑、Sulfameter：磺胺对甲氧嘧啶、S

22、ulfamethazine：磺胺二甲嘧啶、Sulfamethizole：磺胺甲噻二唑、Sulfametho*ypyridazine：磺胺甲氧哒嗪、Sulfametho*azole：磺胺甲噁唑、Sulfachloropyridazine：磺胺氯达嗪、Sulfamonometho*ine：磺胺间甲氧嘧啶、Sulfacetamide：磺胺醋酰、Sulfiso*azole：磺胺二甲异噁唑、Sulfaphenazole：磺胺苯吡唑、Sulfadimetho*ine：磺胺二甲氧嘧啶、Sulfaquino*aline：磺胺喹噁啉。具体实施方式本创造提供了一种兽药残留的检测方法，所述方法包括如下步骤：1样品的

23、处理：将待测样品进展粉碎，参加提取剂后进展匀浆，之后进展超声提取，之后进展第一次离心别离得到上清液，用氮气将上清液吹干后得到的剩余物用初始流动相溶解，混匀，之后进展第二次离心别离得到上清液，取上清液进展微孔滤膜过滤得到的滤液用于UPLC-MS/MS测定；所述待测样品是各类动物源的肉、蛋、奶。当所述的样品为肉时，前处理的步骤是通过料理机进展粉碎；当待测样品是蛋时，去壳打碎；当待测样品是奶时，只需要简单过滤除杂就可以。所述的两次离心别离目的是使样品中蛋白质尽量全部除去，防止堵塞液相色谱柱，同时减少残留物质对测定结果的干扰。所述的提取剂为10%三氯乙酸水溶液与乙腈的混合溶液，两者的体积比例为10%三

24、氯乙酸水溶液：乙腈=1525：7585，优选两者的体积比例为10%三氯乙酸水溶液：乙腈=20：80。所述的提取剂的选择是考虑到蛋白沉淀、药物溶解性及酸碱性进展选择的结果，选择单独的有机溶剂不利于小分子药物的溶解。选择酸性溶液过多会使样品中的残留药物破环，而影响测定结果的准确性。优选地，所述在第一次离心别离后得到上清液的同时得到沉淀，对沉淀进展再次提取，得到上清液与第一次离心别离得到的上清液进展合并，将合并后的上清液进展下一步骤的氮气吹干。优选地，所述的再次提取是将沉淀参加提取剂后进展匀浆，之后进展超声提取，之后进展离心别离得到上清液，将得到的该上清液与第一次离心别离得到的上清液进展合并，将合并

25、后的上清液进展下一步骤的氮气吹干。所述微孔滤膜的孔径大小为0.45 m。优选地，氮气吹干上清液的温度为25-35，优选在30下进展。优选地，所述第一次离心和第二次离心的转速为9000 rmin-1-11000 rmin-1，离心的时间为8 min -12min；优选第一次离心和第二次离心的转速为10000 rmin-1，离心的时间为10min。通过所述的提取过程尽量地将药物提取，并保证动物源性杂质的去除最大化，在两者同时兼顾的前提下，在本创造检测方法中提取的次数以2次为优选。2兽药残留的测定将步骤1得到的样品进展超高效液相色谱与质谱联用的测定；测定条件如下：色谱条件：色谱柱为Waters Ac

26、quity UPLC BEH C18柱；流动相为甲醇和0.05甲酸水溶液，洗脱方式为梯度洗脱；流速为0.25 mLmin-1；柱温为30；进样量为10L；质谱条件：电喷雾离子源(ESI+)；毛细管电压为3.5 KV；锥孔电压为3.0 V；RF透镜电压为0.5 V；源温为110；脱溶剂温度为350；脱溶剂气流速度为650Lh-1；锥孔反吹气流速度为50Lh-1。优选地，所述梯度洗脱程序为：0-10.0 min：甲醇的体积比为3.0-90.0%；：甲醇的体积比为90.0-3.0；10.1-13.0 min：甲醇的体积比为3.0。所述梯度洗脱的流动相配比和洗脱程序可以保证各个药物的良好别离和定量。优

27、选地，所述兽药为四环素类药物、受体冲动剂类药物、喹诺酮类药物、磺胺类药物。优选地，所述兽药为四环素、土霉素、金霉素、强力霉素、特步他林、西马特罗、沙丁胺醇、菲诺特罗、莱克多巴胺、氯丙那林、克伦特罗、妥布特罗、喷布洛尔、苯乙醇胺A、培氟沙星，环丙沙星，恩诺沙星，氧氟沙星，伊诺沙星、吡哌酸、萘啶酸、西诺沙星、诺氟沙星、达氟沙星、洛美沙星、二氟沙星、沙氟沙星、司帕沙星、磺胺邻二甲氧嘧啶、磺胺嘧啶、磺胺噻唑、磺胺吡啶、磺胺甲基嘧啶、磺胺二甲基噁唑、磺胺对甲氧嘧啶、磺胺二甲嘧啶、磺胺甲噻二唑、磺胺甲氧哒嗪、磺胺甲噁唑、磺胺氯达嗪、磺胺间甲氧嘧啶、磺胺醋酰、磺胺二甲异噁唑、磺胺苯吡唑、磺胺二甲氧嘧啶和/或

28、磺胺喹噁啉中的一种或几种或全部。所述的四种兽药残用途较为广泛，在动物组织中残留较多，同时检测上述四类兽药对于食品的检测具有重要意义。上述46种药物涉及的围很广，构造类型丰富，这说明本创造的方法可以用于多种药物的检测。在一种优选的实施方式中，本创造兽药残留的检测方法包括如下步骤：1样品前处理动物性肌肉组织首先用料理机充分粉碎，冷冻保存；准确称取解冻后的动物源性食品5.0 g，置于50 mL的离心管中，参加10%三氯乙酸：乙腈提取液V：V=20：8010.0 mL，充分匀浆后，超声提取10 min，10 000 rmin-1 离心10 min，上清液转移到另一50 mL离心管中，残渣再用提取液10

29、.0 mL重复提取一次，合并提取液，将提取液于30下氮气吹干。剩余物用初始流动相2.0 mL溶解，涡旋混匀，以10 000 rmin-1的速率高速离心10 min。取适量上清液，0.45 m 微孔滤膜过滤，供UPLC-MS/MS测定。2样品的检测：色谱条件与质谱条件色谱柱为Waters Acquity UPLC BEH C18柱 (100 mm2.1 mm，1.7m)；流动相:A相为甲醇，B相为0.05甲酸水溶液，梯度洗脱：0-10.0 min：3.0A-90.0%A；：90.0A-3.0A；10.1-13.0 min：3.0A；流速为0.25 mLmin-1；柱温为30；进样量为10L。电喷

30、雾离子源(ESI+)；毛细管电压为3.5 KV；锥孔电压为3.0 V；RF透镜电压为0.5 V；源温为110 ；脱溶剂温度为350 ；脱溶剂气流速为650Lh-1；锥孔反吹气流速为50 Lh-1。实施例实施例11 仪器与试药1.1 仪器Waters Ultra Performance LC液相色谱仪(Waters公司)，Quattro Premier *E 质谱仪(Waters公司)，MassLyn* v 4.1数据处理软件 (Waters公司)；Waters Acquity UPLC BEH C18色谱柱(100 mm2.1 mm，1.7m)；TranssonicTP 690超声波清洗器El

31、ma 公司;3K15离心机Sigma 公司；MilliporeEli* Milli-Q纯水仪。1.2 材料色谱纯甲醇Fisher Scientific公司产品；色谱纯乙腈FisherScientific公司产品；超纯水；其他试剂均为分析纯。所用46种药物均是商购获得，各个药物的纯度均高于98.0%。将安康牛肉经过测定不含所述的46种药物中的任一种定量参加所述的四环素、土霉素、金霉素、强力霉素、特步他林、西马特罗、沙丁胺醇、菲诺特罗、莱克多巴胺、氯丙那林、克伦特罗、妥布特罗、喷布洛尔、苯乙醇胺A、培氟沙星，环丙沙星，恩诺沙星，氧氟沙星，伊诺沙星、吡哌酸、萘啶酸、西诺沙星、诺氟沙星、达氟沙星、洛美

32、沙星、二氟沙星、沙氟沙星、司帕沙星、磺胺邻二甲氧嘧啶、磺胺嘧啶、磺胺噻唑、磺胺吡啶、磺胺甲基嘧啶、磺胺二甲基噁唑、磺胺对甲氧嘧啶、磺胺二甲嘧啶、磺胺甲噻二唑、磺胺甲氧哒嗪、磺胺甲噁唑、磺胺氯达嗪、磺胺间甲氧嘧啶、磺胺醋酰、磺胺二甲异噁唑、磺胺苯吡唑、磺胺二甲氧嘧啶和磺胺喹噁啉以下简称46种兽药，将参加兽药后牛肉参加首先用料理机充分粉碎，冷冻保存；准确称取解冻后的牛肉5.0 g，置于50 mL的离心管中，参加10%三氯乙酸：乙腈提取液V：V=20：8010.0 mL，充分匀浆后，超声提取10 min，10 000 rmin-1离心10 min，上清液转移到另一50 mL离心管中，残渣再用提取液1

33、0.0 mL重复提取一次，合并提取液，将提取液于30下氮气吹干。剩余物用初始流动相2.0 mL溶解，涡旋混匀，以10 000 rmin-1的速率高速离心10 min。取适量上清液，0.45 m 微孔滤膜过滤，供UPLC-MS/MS测定。2方法与结果2.1 方法色谱条件色谱柱：Waters Acquity UPLC BEH C18柱；流动相为甲醇和0.05甲酸水溶液，洗脱方式为梯度洗脱，A相为甲醇，B相为0.05甲酸水溶液，0-10.0 min：3.0A-90.0%A；：90.0A-3.0A；10.1-13.0 min：3.0A；流速为0.25 mLmin-1；柱温为30；进样量为10L。质谱条

34、件：电喷雾离子源(ESI+)；毛细管电压为3.5 KV；锥孔电压为3.0 V；RF透镜电压为0.5 V；源温为110；脱溶剂温度为350；脱溶剂气流速度为650Lh-1；锥孔反吹气流速度为50Lh-1。2.2质谱条件优化将所述的46种药物分别进展MS扫描，确定各个药物的定性离子和定量离子，并优化各个药物离子对的碰撞电压。为了提高分析的灵敏度和专一性，选用多反响监测模式(Multi-ReactionMonitoring，MRM) 进展检测，并同时进展定性和定量的双离子通道分析，进而进一步提高该方法的定性准确性和专属性。46种药物保存时间、定性离子对和定量离子对列于表1。为了增强方法的灵敏度，本研

35、究进展多时间段的多反响检测扫描，即按照待测药物的保存时间，分为多个时间段分别进展MRM扫描，以增加每个药物的扫描时间，进而提高灵敏度。具体来说，根据各个药物的保存时间确定监测时间，得到测定结果见表2。表1 46种药物的保存时间、定性离子对和定量离子对药物保存时间定量离子对定性离子对四环素类四环素(Tetracycline)4.89445.1410.1445.1428.1土霉素(O*ytetracycline)5.02461.2426.0461.2443.1金霉素(Chlorotetracycline)6.21479.2443.9479.2462.3强力霉素 (Do*ycycline)7.224

36、45.1428.1445.1410.1受体冲动剂类药物特步他林(Terbutaline)2.95226.0124.9226.0151.9西马特罗( Cimaterol)3.13220.0159.9220.0202.0沙丁胺醇(Salbutamol)3.20240.1147.9240.1222.0菲诺特罗(Fenoterol)3.83304.0134.9304.0104.9莱克多巴胺(Ractopamine)4.99302.1164.0302.1106.9氯丙那林(Clorprenaline)5.35214.0153.9214.0196.0克伦特罗(Clenbuterol)5.46277.020

37、2.9277.0259.0妥布特罗(Tulobuterol)6.02228.0153.9228.0171.9喷布洛尔( Penbutolol)9.15292.1201.0292.1236.1苯乙醇胺APhenylethanolamine A7.27345.2327.2345.2150.0喹诺酮类药物培氟沙星(Peflo*acin)4.67334.2316.2334.2290.2环丙沙星(Ciproflo*acin)4.96332.1314.1332.1288.1恩诺沙星( Enroflo*acin)4.99360.2316.2360.2245.1氧氟沙星Oflo*acin4.66362.131

38、8.1362.1261.1伊诺沙星Eno*acin4.71321.0232.1321.0303.2吡哌酸Pipemidic Acid4.23304.0217.1304.0189.0萘啶酸Nalidi*ic Acid7.52233.0215.0233.0187.0西诺沙星Cino*acin6.17263.1245.1263.1217.1诺氟沙星Norflo*acin4.85320.0302.2320.0276.2达氟沙星Danoflo*acin5.03358.2340.1358.2238.1洛美沙星Lomeflo*acin5.15352.1265.1352.1308.1二氟沙星Diflo*aci

39、n5.23400.2382.1400.2356.1沙氟沙星Saraflo*acin5.42386.2299.1386.2342.2司帕沙星Sparflo*acin5.87393.1349.2393.1292.2磺胺类药物磺胺邻二甲氧嘧啶Sulfado*ine5.30311.1156.0311.1108.1磺胺嘧啶Sulfadiazine3.33251.1156.0251.1108.1磺胺噻唑Sulfathiazole3.63256.0155.9256.092.0磺胺吡啶Sulfapyridine3.76250.0155.9250.0184.0磺胺甲基嘧啶Sulfamerazine3.95265

40、.0155.9265.0171.9磺胺二甲基噁唑Sulfamo*ol4.36268.0155.9268.0113.0磺胺对甲氧嘧啶Sulfameter4.41281.0156.0281.0215.1磺胺二甲嘧啶Sulfamethazine4.48279.0186.0279.0124.0磺胺甲噻二唑Sulfamethizole4.52271.0155.9271.092.0磺胺甲氧哒嗪Sulfametho*ypyridazine4.71281.0155.9281.0108.0磺胺甲噁唑Sulfametho*azole5.12254.0155.9254.092.0磺胺氯达嗪Sulfachloropy

41、ridazine4.99285.0155.9285.0108.0磺胺间甲氧嘧啶Sulfamonometho*ine5.22281.1155.9281.1108.0磺胺醋酰Sulfacetamide2.96215.1156.0215.1108.1磺胺二甲异噁唑Sulfiso*azole5.39268.1156.0268.1113.1磺胺苯吡唑Sulfaphenazole5.97315.1160.1315.1156.0磺胺二甲氧嘧啶Sulfadimetho*ine6.32311.0155.9311.0108.0磺胺喹噁啉Sulfaquino*aline6.54301.0.1155.9301.092

42、.0表2 46个药物的mpMRM参数药物时间minmpMRM监测离子碰撞电压V四环素类药物四环素Tetracycline4.3-5.2 445.1410.019445.1428.111土霉素O*ytetracycline4.8-5.3 461.2426.020461.2443.113金霉素Chlorotetracycline5.7-6.9 479.2443.922479.2462.317强力霉素Do*ycycline7.0-10.0 445.1428.121445.1410.120受体冲动剂类药物特步他林(Terbutaline)3.0-3.5 226.0124.922226.0151.916

43、西马特罗(Cimaterol)2.8-3.1 220.0159.916220.0202.010氯丙那林(Clorprenaline)5.1-5.7 214.0153.916214.0196.011克伦特罗(Clenbuterol)5.3-5.9 277.0202.916277.0259.010喷布洛尔(Penbutolol)7.0-10.0 292.1201.020292.1236.115莱克多巴胺(Ractopamine)4.8-5.3 302.1106.928302.1164.016菲诺特罗(Fenoterol)3.7-4.0 304.0104.916304.0134.912妥布特罗(Tu

44、lobuterol)5.7-6.9 228.0153.916228.0171.912沙丁胺醇(Salbutamol) 240.1222.018240.1147.910苯乙醇胺APhenylethanolamine A345.2150.025345.2327.215喹诺酮类药物培氟沙星(Peflo*acin)334.2316.220334.2290.215环丙沙星(Ciproflo*acin)332.1288.123332.1314.118恩诺沙星( Enroflo*acin)360.2316.218360.2245.125氧氟沙星Oflo*acin362.1261.120362.1318.12

45、5伊诺沙星Eno*acin321.0232.120321.0303.230吡哌酸Pipemidic Acid304.0217.120304.0189.030萘啶酸Nalidi*ic Acid233.0215.015233.0187.025西诺沙星Cino*acin263.1245.115263.1217.120诺氟沙星Norflo*acin320.0302.220320.0276.215达氟沙星Danoflo*acin358.2340.120358.2238.121洛美沙星Lomeflo*acin352.1265.123352.1308.115二氟沙星Diflo*acin400.2382.12

46、5400.2356.120沙氟沙星Saraflo*acin386.2299.127386.2342.219司帕沙星Sparflo*acin393.1292.225393.1349.220磺胺类药物磺胺邻二甲氧嘧啶Sulfado*ine311.1156.020311.1108.122磺胺嘧啶Sulfadiazine251.1156.016251.1108.125磺胺噻唑Sulfathiazole256.0155.915256.092.025磺胺吡啶Sulfapyridine250.0155.916250.0184.016磺胺甲基嘧啶Sulfamerazine265.0155.916265.017

47、1.915磺胺二甲基噁唑Sulfamo*ol268.0155.916268.0113.017磺胺对甲氧嘧啶Sulfameter281.0156.015281.0215.117磺胺二甲嘧啶Sulfamethazine279.0186.016279.0124.022磺胺甲噻二唑Sulfamethizole271.0155.916271.092.025磺胺甲氧哒嗪Sulfametho*ypyridazine281.0155.916281.0108.025磺胺甲噁唑Sulfametho*azole254.0155.916254.092.025磺胺氯达嗪Sulfachloropyridazine285.

48、0155.925285.0108.015磺胺间甲氧嘧啶Sulfamonometho*ine281.1155.916281.1108.025磺胺醋酰Sulfacetamide215.1156.021215.1108.116磺胺二甲异噁唑Sulfiso*azole268.1156.013268.1113.117磺胺苯吡唑Sulfaphenazole301.0155.916301.092.025磺胺二甲氧嘧啶Sulfadimetho*ine311.0155.917311.0108.025磺胺喹噁啉Sulfaquino*aline315.1160.120315.1156.018mpMRM数据采集模式在

49、一个循环中检测多个药物，节约分析时间，尤其是mpMRM灵敏度高，能够检测含量较低的待测组分。现有技术中，对四环素类药物检测的定量限为500.0ppb，或200.0 ppb，而在mpMRM扫描中上述4个药物的检测限均能到达5.0ppb，说明该数据采集模式能够显著提高灵敏度。2.3方法验证专属性实验将1.2制备的用于检测的样品进展测定得到色谱图见图1-4。通过图可以看出，46种药物能和其他色谱峰完全别离，空白组织没有干扰，到达了多药物的同时检测。线性关系和检测限准确量取适量的46个药物的标准液，分别添加到5.0 g安康牛肉中，制得含量为0.5，1.0，2.0，5.0，10.0，20.0，50.0，

50、100.0 , 200.0 ngmL-1的系列空白添加试样，按1.2的前处理方法项下所述方法进展处理，然后进展UPLC-MS/MS测定。对于四环素类药物、磺胺类及喹诺酮类药物，以各药物定量离子的色谱峰面积为纵坐标，样品浓度(ngmL-1)为横坐标，绘制标准曲线，并测定检出限S/N3和定量限S/N10，对于-受体冲动剂类药物，按标法以峰面积比计算，结果见表3。表 3 46种药物的标准曲线、定量限和检测限药物标准曲线rLOD(ng/mL)LOQ(ng/mL)四环素TetracyclineY=102.17*+13.010.9992.05.0土霉素O*ytetracyclineY=29.99*+43.

51、690.9902.05.0强力霉素Do*ycyclineY=147.43*+5.220.9902.05.0金霉素ChlorotetracyclineY=25.57*+6.750.9952.05.0特步他林(Terbutaline)0.9960.51.0西马特罗( cimaterol)0.9930.51.0沙丁胺醇(Salbutamol)Y=1.524*+0.0760.9980.51.0菲诺特罗(Fenoterol)Y=0.005*+0.0020.9920.51.0莱克多巴胺(Ractopamine)Y=1.104*+0.1550.9990.51.0氯丙那林(Clorprenaline)0.99

52、80.51.0克伦特罗(Clenbuterol)0.9980.51.0妥布特罗(Tulobuterol)0.9980.51.0喷布洛尔(Penbutolol)0.9970.51.0苯乙醇胺APhenylethanolamine AY=25.57*+6.750.9960.51.0培氟沙星(Peflo*acin)Y=486*-74.80.9980.51.0环丙沙星(Ciproflo*acin)Y=293*+7.550.9990.51.0恩诺沙星( Enroflo*acin)Y=450*+46.70.9990.51.0氧氟沙星Oflo*acinY=416*-8.110.9990.51.0伊诺沙星En

53、o*acinY=555*-23.20.9980.51.0吡哌酸Pipemidic AcidY=282*-15.80.9990.51.0萘啶酸Nalidi*ic AcidY=891*-87.40.9990.51.0西诺沙星Cino*acinY=410*-19.10.9980.51.0诺氟沙星Norflo*acinY=311*+1810.9960.51.0达氟沙星Danoflo*acinY=558*-65.70.9970.51.0洛美沙星Lomeflo*acinY=418*-38.30.9990.51.0二氟沙星Diflo*acinY=381*-25.60.9990.51.0沙氟沙星Saraflo

54、*acinY=141*-4.810.9970.51.0司帕沙星Sparflo*acinY=171*-10.00.9980.51.0磺胺邻二甲氧嘧啶Sulfado*ineY=426*-1.500.9990.51.0磺胺嘧啶SulfadiazineY=149*-4.450.9980.51.0磺胺噻唑SulfathiazoleY=378*-18.90.9980.51.0磺胺吡啶SulfapyridineY=321*-23.50.9980.51.0磺胺甲基嘧啶SulfamerazineY=237*-25.00.9990.51.0磺胺二甲基噁唑Sulfamo*olY=386*-13.00.9990.51

55、.0磺胺对甲氧嘧啶SulfameterY=229*+8.680.9980.51.0磺胺二甲嘧啶SulfamethazineY=365*+1.050.9980.51.0磺胺甲噻二唑SulfamethizoleY=391*+1.480.9970.51.0磺胺甲氧哒嗪Sulfametho*ypyridazineY=419*-27.60.9990.51.0磺胺甲噁唑Sulfametho*azoleY=211*+4.540.9960.51.0磺胺氯达嗪SulfachloropyridazineY=296*-17.10.9990.51.0磺胺间甲氧嘧啶Sulfamonometho*ineY=275*+7.

56、70.9980.51.0磺胺醋酰SulfacetamideY=139*+9.820.9990.51.0磺胺二甲异噁唑Sulfiso*azoleY=291*+10.20.9980.51.0磺胺苯吡唑SulfaphenazoleY=138*-10.70.9970.51.0磺胺二甲氧嘧啶Sulfadimetho*ineY=359*-64.30.9990.51.0磺胺喹噁啉Sulfaquino*alineY=408*-65.20.9990.51.0通过表3数据可以看出4种四环素类药物在5.0 ngmL-1-200.0 ngmL-1的浓度围呈良好的线性关系，相关系数(r)均大于0.990，检测限为2.0

57、 ngmL-1，定量限为5.0 ngmL-1；喹诺酮及磺胺类药物在1.0 ngmL-1-100.0 ngmL-1的浓度围呈良好的线性关系，相关系数均大于0.996；检测限为0.5 ngmL-1，定量限为1.0ngmL-1。对于-受体冲动剂类药物，按标法以峰面积比计算，结果说明10种-受体冲动剂类药物在1.0 ngmL-1-100.0 ngmL-1的浓度围呈良好的线性关系，相关系数(r)均大于0.992；检测限为0.5 ngmL-1，定量限为1.0ngmL-1。上述数据说明本创造检测方法灵敏度高，检测限和定量限较低。回收率和精细度试验准确量取适量的46个药物的标准液，配制高、中、低浓度的46种标

58、准溶液，分别添加到5.0 g安康牛肉中，按照1.2的样品前处理方法项下处理样品，并测定药物浓度，每个浓度测定6个样本，每个浓度的测得量与参加量相比，最终得回收率。日精细度按高、中、低3个浓度分别在1天的不同时间测6次进展计算，日间精细度按高、中、低浓度连续测定3天进展计算。表4 46种药物的准确度及精细度药物Drug浓度/ng/mL准确度/%日精细度n=6日间精细度n=3土霉素O*ytetracycline5.090.36.93.88.720.093.36.06.72.3100.099.27.64.85.2金霉素Chlorotetracycline5.083.25.87.19.020.095.

59、64.84.88.0100.096.34.55.35.4四环素Tetracycline5.085.28.83.87.120.090.07.45.24.8100.094.38.53.85.3强力霉素Chlorotetracycline5.0101.39.47.89.920.090.19.85.37.8100.093.29.66.24.0特步他林(Terbutaline)1.0105.36.54.810.75.0103.36.26.52.350.085.23.64.85.2西马特罗(Cimaterol)1.0104.27.56.59.15.0102.65.88.88.650.096.34.45.5

60、5.4沙丁胺醇(Salbutamol)1.0103.57.88.28.15.0101.95.88.24.350.0105.44.57.55.0菲诺特罗(Fenoterol)1.091.07.36.64.35.090.45.26.55.950.0103.36.36.55.3莱克多巴胺(Ractopamine)1.0104.97.64.59.25.0102.25.06.17.150.0105.67.84.88.6氯丙那林(Clorprenaline)1.096.37.55.38.45.095.25.36.16.050.094.67.05.24.8克伦特罗(Clenbuterol)1.0106.97