陈洪惠-2015-6-4修改版(共22页)

1、学校代码：10904 学 士 学 位 论 文双水相萃取(cuq)蚓激酶的初步研究姓 名：陈洪惠学 号：201107140402指导教师：王 飞学 院：生命科学学院专 业：制药工程完成日期：2015年6月5日 学 士 学 位 论 文双水相萃取蚓激酶的初步(chb)研究姓 名：陈洪惠学 号：201107140402指导教师：王 飞学 院：生命科学学院专 业：制药工程完成日期：2015年6月5日摘 要为弥补蚓激酶现有(xin yu)提取方法的不足，本实验采用聚乙二醇-硫酸铵组成的双水相体系对蚓激酶进行分离纯化，并运用TAME底物法测定其效价。以蚓激酶的效价为考察(koch)指标，探讨聚乙二醇的分子量

2、、聚乙二醇的质量(zhling)分数、硫酸铵的质量分数对双水相萃取蚓激酶的影响，并通过正交试验进一步优化萃取条件。经实验，聚乙二醇质量分数对蚓激酶的萃取影响最大，在聚乙二醇分子量为6000、聚乙二醇质量分数为16%、硫酸铵质量分数为18%时组成的双水相体系，对所分离得到的蚓激酶效价较高，提取的蚓激酶活力达12.23U/mg。结果表明，该双水相体系用于蚓激酶分离纯化具有良好的选择性，而且保持了较高的活性。关键词：双水相；萃取；蚓激酶；正交试验AbstractIn order to remedy the deficiency of Lumbrokinase extraction method,se

3、paration of Lumbrokinase directly from earthworn homogenate in aqueous two-phase systems(ATPS)of polyethylene glycol-ammonium sulfate was studied.The effects of polyethylene glycol molecular weight,(NH4)2SO4 concentration on the extraction were investigated in terms of titer.Orthogonal experiment wa

4、s used to further analyze and optimize the separation of Lumbrokinase.The results indicated that the control of polyethylene glycol molecular weight had the greatest influence.The polyethylene glycol molecular weight was6000, polyethylene glycol concentration was 16%, 18% sodium sulfate concentratio

5、n of aqueous two-phase system can obtain high Lumbrokinase titer.The separation was successful with the Lumbrokinase activity of 12.23U/mg.Test showed that polyethylene glycol-ammonium sulfate aqueous two-phase system for separation Lumbrokinase from the earthworm provides a new extraction method, r

6、sults showed that the aqueous water phase system used in Lumbrokinase purification has good selectivity, and kept high activity.Key Words:Aqueous two phase; Extraction;Lumbrokinase; Orthogonal experiment目 录TOC o 1-3 h u HYPERLINK l _Toc31509 第1章 引言(ynyn) 第1章 引言(ynyn) 蚓激酶为中药地龙中的有效成分。地龙其性寒，味咸，归肝、脾、膀胱经

7、，主要功效为清热定惊，通络，平喘，利尿；临床用于治疗高热神昏，惊痫抽搐(chuch)，关节痹痛，肢体麻木，半身不遂，肺热喘咳，水肿尿少等疾病1。 蚓激酶(jmi)纯品为淡黄色至黄褐色粉末；味腥，有引湿性2；相对分子质量为2104-4104，pI为 3-5，兼具激活纤溶酶原的类尿激酶及直接水解纤维蛋白的纤溶酶活性，不仅能够溶解血栓，而且还具有抗凝作用3-4，彼此之间具有许多相似的特性：热稳定性，在55以下放置1h，酶活力基本不变；超过60时，酶活力迅速下降；当温度达到70时，酶已完全失活；酸稳定性：其作用的pH范围较宽，在pH4-11活力变化很小，在pH8-9时该酶的稳定性最好5，pH低于4或高

8、于11时酶活性明显下降。蚓激酶具有多方面的药理作用，比如抗凝作用、纤溶作用、抑制血小板聚集、改善微循环等。体外药理试验表明：蚓激酶有很强的纤溶活性，对蚯蚓纤溶酶与尿激酶进行比较，发现其有较高的活性。 蚓激酶的分离纯化方法有很多，如刘美艳等6采用硫酸铵盐析、离子交换色谱、凝胶过滤和制备电泳等分离技术纯化蚯蚓纤溶；王雪英等7经匀浆抽提、热变性、硫酸铵分步沉淀、凝胶过滤和DEAE-纤维素离子交换柱色谱等纯化步骤，得到蚯蚓纤溶酶，但是都存在以下问题:分离纯化的工业路线长，采用的许多步骤较为繁琐，提取率低，周期长，不利于工业化生产8。 双水相萃取技术是一种新型的液-液萃取技术，与传统的萃取技术相比，其具

9、有处理能力强、分相时间短、适合工业化生产等特点，被广泛应用于蛋白质的萃取、分离和纯化9-12。在无机盐存在下，某些高聚物水溶液可以分成两相的非有机溶剂萃取分离法，具有不挥发、无毒、快速和操作简单等优点，作为一种新型萃取分离技术，已得到了许多研究者的关注13。 本实验利用双水相萃取(cuq)技术，并采用TAME底物法对蚓激酶的效价进行测定，简化其分离纯化(chn hu)过程，使提取(tq)得到的蚓激酶产率和纯度较高。第2章 材料与仪器2.1 材料与试剂 干蚯蚓（购自山东淄博） 其他实验所用材料与试剂见表2-1，均为分析纯。表2-1 实验所用材料与试剂材料与试剂生产厂家批号无水甲醇天津市风船化学试

10、剂科技有限公司20141208TAME国药集团化学试剂有限公司20130929变色酸国药集团化学试剂有限公司20140303三氯乙酸国药集团化学试剂有限公司20140917高锰酸钾徐州试剂总厂20130407无水亚硫酸钠国药集团化学试剂有限公司20140312PEG2000国药集团化学试剂有限公司20140423PEG4000国药集团化学试剂有限公司20140605PEG6000国药集团化学试剂有限公司20141029磷酸二氢钠天津市福晨化学试剂厂20120802磷酸氢二钠天津市巴斯夫化工有限公司20120922硫酸铵天津市福晨化学试剂厂20140327浓硫酸莱阳经济技术开发区精细化工厂201

11、405092.2 试剂(shj)的配制 pH=7.0，0.02mol/L磷酸盐缓冲液的配制：称取磷酸二氢钠1.6g，磷酸氢二钠3.6g，将二者加水溶解(rngji)并稀释至500ml，备用。 pH=8.0，0.1mol/L磷酸盐缓冲液的配制(pizh)：称取磷酸二氢钠3.9g，磷酸氢二钠9.0g，将二者加水溶解并稀释至500ml，备用。 15三氯醋酸液的配制：称取三氯醋酸15.0g，加水稀释至100ml，备用。 2高锰酸钾液的配制：称取高锰酸钾2.0g，加水稀释至100ml，备用。 10无水亚硫酸钠液的配制：称取无水亚硫酸钠1.0g，加水稀释至100ml，现用现配。 0.4变色酸疏酸液的配制：

12、称取变色酸0.4g，加67硫酸(重量与重量比)至l00ml，现用现配14。2.3 实验仪器实验所用仪器见表2-2。表2-2 实验所用仪器仪器名称型号生产厂家小型中药粉碎机500A长沙市楚泰制药机械设备有限公司药典筛100目新乡市金牛振动设备厂电子天平BS300L上海有声衡器有限公司内切式匀浆机HFJ10天津恒奥科技有限公司数控超声波清洗器KQ5200DB昆山市超声仪器有限公司电热套RDM1000金坛市盛蓝仪器制造有限公司电热鼓风干燥箱101-2北京市中兴伟业仪器有限公司大容量高速冷冻离心机H2050R湖南湘仪实验仪器开发有限公司紫外可见分光光度计UV4802龙尼柯（上海）仪器有限公司数显恒温水

13、浴锅HH-4金坛市盛蓝仪器制造有限公司 第3章 实验(shyn)方法3.1 蚓激酶(jmi)粗提液的制备 称取适量干蚯蚓(qi yn)，用小型中药粉碎机进行粉碎，过100目筛，称取蚯蚓粉末12g，置500ml烧杯中，加0.02mol/L磷酸盐缓冲液400ml将其溶解，用内切式匀浆机低速匀浆2min，超声波震荡10min，超声结束后在4000r/min，4下离心20min，取上清液备用15。3.2 双水相萃取蚓激酶的流程 称取蚓激酶粗提液20g，置100ml烧杯中，分别加入适量的聚乙二醇和硫酸铵，搅拌溶解，将其转入60ml分液漏斗中，置于铁架台上静置分层，将上相烘干，研磨过80目筛，称取粉末0.

14、5g，用pH=8的磷酸缓冲溶液配成浓度为0.005g/ml的样品溶液，按照TAME底物法测定其效价。 3.3 蚓激酶效价测定 3.3.1 甲醇标准曲线的绘制 甲醇标准液的制备：精密最取甲醇0.102mI，置25ml容最瓶中，加入磷酸盐缓冲液(0.1mol/L)至刻度，摇均。精密最取此液0.5ml，置25ml容量瓶中，用磷酸盐缓冲液(0.1mol/L)稀释至刻度16。甲醇标准(biozhn)曲线的绘制见表3-1。表3-1 甲醇(ji chn)标准曲线的绘制123456PBS（ml）0.300.250.200.150.100.05甲醇液（ml）0.000.050.100.150.200.25TCA

15、（ml）0.200.200.200.200.200.20KMNO4（ml）0.10.10.10.10.10.1振摇1.5min无水Na2SO3（mL）0.10.10.10.10.10.1变色酸（ml）4.04.04.04.04.04.0置沸水浴中加热(ji r)25min，取出，冷水浴中降温10min，测定574nm波长处的吸光度17-19，计算其效价。3.3.2 蚓激酶样品效价测定样品的效价测定见表3-2。表3-2 样品效价测定123样品浓度（g/ml）空白5.010-32.510-3TAME（ml）0.10.10.1PBS（ml）0.20.10.1TCA（ml）0.2/样品液（ml）/0.

16、10.137水浴30min，精密计时TCA（ml）/0.20.2KMNO4（ml）0.10.10.1振摇1.5min无水Na2SO3（mL）0.10.10.1变色酸（ml）4.04.04.0沸水浴加热25min冷水浴10min574nm处测定吸光度根据所测样品的吸光值，在标准曲线上查出甲醇的量，依照(yzho)下列公式计算供试品中的TAME单位效价： TAME单位/mg=甲醇微摩尔数时间（min）体积（ml）3.4 双水相萃取(cuq)蚓激酶(jmi)的单因素分析3.4.1 PEG分子量的影响 取100ml烧杯5个，分别编号为1、2、3、4、5，加入粗提液20g，分别加入分子量为2000，40

17、00，6000的PEG 4.8g，依次加入硫酸铵5.3g，搅拌溶解后，将其转移至60ml分液漏斗中，置于铁架台上静置分层，取上相，将其烘干，研磨过80目筛，取粉末0.5g，用pH=8的磷酸缓冲溶液配成浓度为0.005g/ml的样品溶液，按照TAME底物法测定其效价。3.4.2 PEG质量分数的影响 保持PEG平均分子质量6000和硫酸铵质量分数18%不变，改变PEG加入量1.2、3.1、4.8、7.4、9.2g，搅拌溶解，按上法操作测定效价。 3.4.3 硫酸铵质量分数的影响 保持PEG分子量为6000，其质量分数为16%不变，依次加入硫酸铵1.8、3.9、5.3、6.7、8.8g，搅拌溶解，

18、同法测定其效价。3.5 双水相萃取(cuq)蚓激酶(jmi)的正交试验(shyn)设计为优化双水相萃取的条件，设定PEG的分子量为M，PEG的质量分数为A，硫酸铵的质量分数为C作为实验考察因素，加入蚓激酶粗提液20g，以蚓激酶的效价为指标做三因素三水平的实验20-21，见表3-3。表3-3 因素水平表水平PEG的质量分数MPEG质量分数A硫酸铵质量分数C1M1（2000）A1（14%）C1（16%）2M2（4000）A2（16%）C2（18%）3M3（6000）A3（18%）C3（20%）3.6 验证试验 按照正交试验得到的最优工艺条件进行双水相萃取，并进行效价测定。结果与分析4.1甲醇标准曲

19、线的绘制结果数据处理软件得到的甲醇标准曲线如图4-1。图4-1 甲醇(ji chn)标准曲线 由标准(biozhn)曲线可得，回归方程为A=2.431C0.011，R2=0.993；甲醇(ji chn)浓度在0.021-0.106mol/ml范围内线性关系良好。4.2 单因素分析结果4.2.1 PEG分子量PEG分子量对双水相萃取蚓激酶的影响见图4-2。 图4-2 PEG分子量对双水相萃取蚓激酶的影响 由图4-2可得，PEG分子量4000时蚓激酶的效价最高，分子量在6000是较高，分子量在2000时的效价最低，所以确定PEG分子量为4000时最有利于双水相萃取。4.2.2 PEG质量分数 PE

20、G质量分数对双水相萃取蚓激酶的影响见图4-3。图4-3 PEG质量(zhling)分数对双水相萃取(cuq)蚓激酶的影响(yngxing) 由图4-3可得，PEG质量分数在10%22%范围内时蚓激酶的得率较高，但是综合考虑成相的体积和吸光度，最终确定PEG质量分数为16%时为最佳质量分数。4.2.3 硫酸铵质量分数 硫酸铵质量分数对双水相萃取蚓激酶的影响见图4-4。图4-4 硫酸铵质量分数对双水相那个萃取蚓激酶的影响 由图4-4可得，随着硫酸铵质量分数逐渐增大，蚓激酶的效价呈现降低-上升-降低的趋势，在硫酸铵质量分数为18%时效价有最大值4.05U/mg。硫酸铵质量分数在8%之前不成相，而盐浓

21、度增加到一定程度后，使蚓激酶的溶解度下降而发生盐析作用，所以选择质量分数为18%硫酸铵。4.3 正交试验分析结果正交试验(shyn)结果(ji gu)见表4-1。表4-1 正交试验(shyn)表实验号PEG分子量PEG质量分数硫酸铵质量分数TAME(U/mg)1200014%16%8.332200016%18%11.103200018%20%10.134400014%20%9.285400016%16%10.566400018%18%10.627600014%16%9.558600016%20%11.149600018%18%11.02均值19.9079.05310.030均值210.1531

22、0.98710.520均值310.57010.59010.080极差R0.6631.9340.507按照表4-1正交结果对实验进行方差分析，见表4-2。表4-2 方差分析结果偏差平方和自由度均方F值P值M0.77720.3893.8950.204A3.38321.69216.9560.058C0.45220.2262.2640.306误差0.20020.100 由表4-1和表4-2可知，双水相萃取蚓激酶的影响因素顺序为：PGE质量分数PEG分子量硫酸铵质量分数，且试验确定了最佳优化条件为PEG分子量为6000，PEG质量分数为16%，硫酸铵质量分数为18%。4.4 验证(ynzhng)试验(s

23、hyn)结果(ji gu)称取粗提液20g，加入分子量6000的PEG 4.8g（质量分数为16%），依次加入硫酸铵5.3g（质量分数为18%），搅拌溶解后，将其转移至60ml分液漏斗中，置于铁架台上静置分层，将上相烘干，研磨过80目筛，取粉末0.5g，用pH=8的磷酸缓冲溶液配成浓度为0.005g/ml的样品溶液，测定其吸光度并算出其效价为12.23U/mg。结论与讨论 本文考察了聚乙二醇的分子量、聚乙二醇的质量分数以及硫酸铵的质量分数对聚乙二醇-硫酸铵成相系统萃取蚓激酶的影响(yngxing)，综合考虑各种因素，初步确定当萃取系统中聚乙二醇分子量为6000，其质量分数为16%，硫酸铵质量分

24、数为18%时，蚓激酶得萃取效率最高，酶活力达12.23U/mg22，该双水相体系用于蚓激酶分离纯化具有(jyu)良好的选择性，而且保持了较高的蚓激酶活性。 在聚乙二醇-硫酸铵组成(z chn)的双水相体系中，当聚乙二醇的分子量和硫酸铵的浓度不变时，双水相萃取得到的蚓激酶的效价随着分子量的增大先后减小，选择分子量为4000的聚乙二醇；当聚乙二醇的分子量和硫酸铵的浓度一定时，其效价随着聚乙二醇的质量分数的呈现先增大后减小的趋势，所以最终选择质量分数为16%的聚乙二醇；当聚乙二醇的分子量及其质量分数不变时，其效价随硫酸铵的质量分数的增大而有较大的改变，由于高浓度的硫酸铵会造成盐析，所以选择质量分数为

25、18%的硫酸铵。 蚓激酶的效价测定有很多种方法，比如考马斯亮蓝法，该方法适合所有的蛋白质，对蚓激酶的专一性不高；纤维蛋白平板法，该方法过程繁琐，而且所需要的试剂价格昂贵。实验中，TAME方法的影响因素有很多： = 1 * GB3 * MERGEFORMAT 显色剂，实验中的显色剂为变色酸，配制的变色酸硫酸溶液，应为淡黄色澄清透明溶液，而且应在临用前现配； = 2 * GB3 * MERGEFORMAT 显色物的稳定性，测定液从冷水浴中取出后，应在0-2h时间间隔内尽快测定； = 3 * GB3 * MERGEFORMAT 高锰酸钾，操作时尽量避免高锰酸钾溶液粘附在试管的口、壁，如果粘附，可以用

26、亚硫酸钠溶液将粘附的高锰酸钾溶液荡洗下来；亚硫酸钠溶液必须临用前配制，以保证亚硫酸钠溶液的还原能力。 研究证明，蚓激酶的分离纯化还可以采用超滤、硫酸铵盐析和分子筛、离子交换层析、柱层析分离 23-26等方法对蚓激酶的提取工艺进行优化研究，也可以将分离纯化的蚓激酶制成冻干粉或者冻干粉针剂27-29。 参考文献1 国家药典委员会.中华人民共和国药典（一部(y b)）M.北京:中国医药科技出版社, 2010.113-114.2 WS1-(X-052)-2001Z-2010,国家食品(shpn)药品监督管理局国家药品标准-蚓激酶(jmi) S.北京: 国家食品药品监督管理局,2010.3 滕文娇,孙晋

27、民.蚓激酶的药学与临床研究进展J.西北药学杂志,2011,26(1): 69-72.4 周海,王春维,张怡,等. 蚓激酶的提取纯化及性质研究J.中国生化药物杂志, 2011,32(3):212-216.5 从玉文,刘耀明,陈家佩,等.蚓激酶的研究进展J.中国生化药物杂志,2000, 21(3):159-162.6 刘美艳,张双全,张健,等.蚯蚓纤溶酶的纯化及pH值、温度和胰蛋白酶对其纤 溶活性的影响J.中国生化药物杂志,2003,24(4):167-170.7 王雪英,伍晓斌,徐凤彩,等.蚯蚓纤溶酶的分离纯化及其部分酶学性质的研究 J.药物生物技术,2003,10(2):88-91.8 陈晓玲

28、.蚓激酶的分离纯化及其对内皮细胞作用的研究D.重庆大学,2006.9 谭志坚.双水相萃取体系在分离纯化芦荟活性成分中的应用研究博士学位论 文.湖南:中南大学,2013.10 刘杨,王雪青,庞广昌.双水相萃取法富集分离螺旋藻藻蓝蛋白的研究J.海洋 科学,2008,32(7):30-32,37.11 郭辉,张中玉,罗宇倩.双水相萃取法分离竹叶黄酮的工艺研究J.氨基酸和生 物资源,2012,34(2):24-28.12 赵云灿,薛学东,赵波.头孢菌素C的新型双水相萃取J.中国医药工业杂志, 2012.43(5):337-339,371-371.13 王碧,阮尚全,覃松,等.聚乙二醇-硫酸铵体系双水相

29、萃取(cuq)光度法测定钯J.四 川大学(dxu)学报(自然科学版),2003,40(1):108-111.14 李剑梅,苗玉琨,李鑫,等.TAME法对康脂口服液中蚓激酶单位(dnwi)效价的测定J. 微生物学杂志,2001,21(3):61-62. 15 周海,王春维,张怡.蚓激酶的提取纯化及性质研究J.中国生化药物杂志,2011 ,32(3):212-216.16 王玮.蚓激酶导向溶栓给药系统的研究博士学位论文.四川:四川大学,2003.17 胡静.纳豆激酶的活性测定J.海峡药学,2013,25(5):47-48.18 焦连庆,于敏,黄青,等.TAME法测定金龙消栓合剂中蚓激酶单位效价J.中草 药,2000,31(4):267-268.19 王玮,尹宗宁,李铜铃,等.蚓激酶白蛋白纳米粒中的酶活力测定J