第七届挑战杯科技作品竞赛申报书 (9)

1、序号：编码:第七届“挑战杯”全国大学生课外学术科技作品竞赛作品申报书作品名称：畜禽产品中二氟沙星残留快速检测方法研究学校全称：华南农业大学申报者姓名（集体名称）： 邹明类另U：J自然科学类学术论文哲学社会科学类社会调查报告和学术论文 口科技创造制作A类口科技创造制作B类第七届“挑战杯”广东大学生课外学术科技作品竞赛组委会制二00二年九月推 荐 者 情 况姓名杨桂香性别 女年龄37职称副教授工作单位华南农业大学兽医学院通讯地址华南农业大学兽医学院 510642单位 85280237 住宅 85282730推荐者所在 单位签章杨桂香是我院副教授。签章日期 2002年11月7日请对申报者申 报情况的

2、真实 性作出阐述情况属实。请对作品的意 义、技术水平、 适用范围及推 广前景作出您 的评价应用免疫检测法进行批量样品的筛选具有速度快、不需 昂贵仪器、反响灵敏等特点，是目前兽药残留快速检测 的一个开展方向。本研究的选取具有重要的理论和实践 意义。方法经完善成功应用后具有非常广泛的市场前景。 技术水平属国内领先，到达国际先进。其它说明E.全国组织委员会秘书处资格和形式审查意见学校组织协调 机构确认并盖章以上情况属实。（团委代章）2002年11月9日校主管领导或 校主管部门确认 盖章同意上报。2002年11月9 日校评审委员会 初评意见评委签名：年 月 日校组织协调委 员会审定意见（签章）年 月

3、日组委会秘书处资格审查意见审查人（签名）年 月 日组委会秘书处形式审查意见审查人（签名）年 月 日组委会秘书处审查结果合格口不合格负责人（签名）F.参赛作品打印处摘要二氟沙星(Difloxacin, DFX)最初开发应用于入医临床，但因其毒性较大而逐 渐淘汰应用在兽医临床上成为兽医专用的氟喳诺酮类抗菌药物。近年来，对氟 喳诺酮类药物在兽医和人医临床上应用时所产生的耐药性、残留毒性以及不良 反响的报道越来越多。目前，用于二氟沙星残留检测的方法有：微生物法、HPLC、 LCMS、SDF等。生产上尚缺乏一种快速、准确、易于推广使用的检测手段以提 供给广大生产企业和屠宰场等相关行业。本研究以此为立足点

4、，采用两种不同 的方法合成了 2种不同的二氟沙星人工抗原；利用杂交瘤技术建立了 5株分泌 抗二氟沙星单克隆抗体的细胞株。同时对5株单克隆抗体进行纯化和鉴定；在 此基础上进一步建立了畜禽产品中二嬴沙星残留的快速ELISA检测方法间 接竞争 ELISA (ciELISA)法。首先采用碳二亚胺法(活性酯法)将二氟沙星与牛血清白蛋白(BSA)交 联制备免疫用抗原DFXBSA;采用活泼酸肝法将二氟沙星与卵清蛋白(OVA) 交联制备包被用抗原DFXOVAo两种交联产物经FeCL显色法、紫外扫描法 和红外光谱法进行确认。结果说明：透析后的交联产物与FeCh反响呈红色且略 显浑浊，透析外液与FeCL那么呈现浅

5、黄色；DFX与载体蛋白BSA和OVA的吸收 光谱呈现明显的叠加现象；且在交联复合物中有DFX的特征性光谱峰出现，证 明两步交联均获得成功，为下一步构建分泌抗二氤沙星单克隆抗体的细胞株打 下坚实基础。细胞株的构建。将免疫原DFXBSA按1()()|1L/只的剂量经腹腔免疫46W 周龄的纯系BALB/c小鼠，免疫方案为0、3、5周龄各免疫一次，其中首次免疫 采用弗氏完全佐剂乳化免疫原(体积比1: 1),二免和三免乳化采用弗氏不完全 佐剂，融合前3天用不加佐剂的完全抗原按同样剂量腹腔注射加强免疫BALB/c 小鼠。间接ELISA试脸结果说明利用该免疫方案制备单抗取得成功。采用显微 克隆技术构建分泌单

6、克隆抗体的细胞株，最终筛选出5株分泌特异性抗体的细 胞株，分别为2cl、2c4、3d3、4al和5a5并获取相关的腹水。对单克隆抗体的 鉴定说明该5株单抗均属IgG型抗体，单抗3d3的SDSPAGE电泳结果为两条 明显的区带，一条为重链，一条为轻链。ELISA检测条件的建立。本研究绘制了 DFX对单抗3d3的抑制曲线，单抗 的工作浓度为1: 150(),包被原DFXOVA的工作浓度为8pg/mL。标准曲线在 25 000ng/mL 之间线性关系良好(r=-0.9826),检测限(LOD)为 2ng/mL, DFX 的IC50为32.56ng/mL。交叉试验说明该株单抗具有非常高的选择性，在所试

7、验 的同类药物中与恩诺沙星的交叉反响率最高为10.28%,与沙拉沙星、环丙沙星、 诺氟沙星以及氧氟沙星的交叉反响率接近0;与氯霉素、SMZ、四环素和阿莫西 林的交叉反响率均为0o结合我国二氟沙星在动物组织和产品中的最高残留限量标准，作者认为该 株单克隆抗体经试脸条件的进一步优化后可用于畜禽产品中残留二氟沙星的快 速检测。G1.全国评审委员会预审意见粘贴处G2.全国评审委员会终审意见粘贴处.申报者应在认真阅读此说明各项内容后按要求详细填写。.申报者在填写申报作品情况时只需根据个人工程或集体工程填写 A1或A2表，根据作品类别（自然科学类学术论文、哲学社会科学类社会 调查报告和学术论文、科技创造制

8、作）分别填写Bl、B2或B3表。所有申 报者可根据情况填写C表。.表内工程填写时一律用钢笔或打印，字迹要端正、清楚，此申报 书可复制。.序号、编码由各高校根据作品种类填写。.学术论文、社会调查报告及所附的有关材料必须是中文（假设是外 文，请附中文本），请以4号楷体打印在A”纸上，附于申报书后，学术论文 及有关材料在8000字以内，社会调查报告在15000字以内（文章版面尺寸 14.5X22cm 左右）。.各高校的作品（数量参照”作品数额分配方案”）各一式四份分别 按规定的时间用特快专递寄至省竞赛组委会办公室。.作品申报书须按要求由各校竞赛组织协调机构统一寄送。.其他参赛事宜请向本校竞赛组织协调

9、机构咨询。.寄送地址：广州市东山区寺贝通津一号大院团省委学校部“挑战 杯”竞赛组委会。联系人：唐锐、黄廉东联系 ：（020） 87778918. 87185614传 真：（020） 87778918、 87185613邮政编码:510080A1.申报者情况（个人工程）说明：1.必须由申报者本人按要求填写，申报者情况栏内必须填写 个人作品的第一作者（承当申报作品60%以上的工作者）；2.本表中的学籍管理部门签章视为对申报者情况确实认。姓名邹明性别男出生年月1974. 10申报者情况学校全称华南农业大学现学历博士研究生专业基础兽医学年级2000 级学制3年入学时间2000. 9作品全称畜禽产品中二

10、氟沙星残留快速检测方法研究毕业论文题目抗二氟沙星单克隆抗体的研制及抗体重、轻链可变区碱基月卜列测定通讯地址华南农业大学兽医药理研究室邮政编码510642单位 常住地 通讯地址华南农业大学兽医药理研究室邮政编码510642住宅 合作者情况姓名性别年龄学历所在单位资格认定学校学籍 管理部门 意见是否为2003年7月1日前正式注册在校的全日制非成人教 育、非在职的各类高等院校中国学生（含专科生、本科生和研 究生）。J是口否假设是，其学号为：00123001（部门盖章）2002年11月7日院系负责 人或导师 意见本作品是否为课外学术科技或社会实践活动成果J是口否负责人签名：梁小伊2002年11月7日B

11、1.申报作品情况（自然科学类学术论文）说明：1.必须由申报者本人填写；.本局部中的科研管理部门签章视为对申报者所填内容确实认;.作品分类请按作品的学术方向或所涉及的主要学科领域填写;.硕士研究生、博士研究生作品不在此列。作品全称作（D ） A.机械与控制（包括机械、仪器仪表、自动化控 制、工程、交通、建筑等）口 口口B.信息技术（包括计算机、电信、通讯、电子等）C.数理（包括数学、物理、地球与空间科学等）分D.生命科学（包括生物、农学、药学、医学、健 康、卫生、食品等）类E.能源化工（包括能源、材料、石油、化学、化 工、生态、环保等）通过本课题的研究，制备抗二氯沙星的单克隆抗体，建立二氟沙作品

12、撰写的目 的和基本思路星残留检测的ELISA方法。DFX人工抗原的制备T 定性判断交联成功T 免疫BALB/c小 鼠，制备免疫脾细胞T 抗DFX单克隆抗体杂交瘤细胞株的建立T ELISA检测条件的建立作品的科学 性、先进性及 独特之处在国内乃至国际上首次报道利用单克隆抗体进行畜禽产品中二羸沙星 残留的快速检测。该方案突破了原有检测方案的一些弊端与缺乏，如仪器 设备昂贵、操作复杂以及检测速度慢等缺点，可在几小时内出具检测结果。作品的实际应 用价值和现实 意义作品成果经进一步优化后可作为一整套快速、准确、易于推广使 用的检测方案提供给广大生产企业和屠宰场等相关行业。不仅利于保 障人们的食品平安，同

13、时对于打破新的非关税壁垒一“绿色贸易壁垒” 对我国畜产品出口的制约，促进经济开展具有重大意义。学 术 论 文 文 摘二羸沙星(Difloxacin, DFX)是动物专用的氯喳诺酮类抗菌药。目 前用于二氟沙星残留检测的方法有：微生物法、HPLC、LCMS、SDF 等。这些方法的一个最大缺点是检测速度慢，生产上尚缺乏一种快 速、准确、易于推广使用的检测手段。本研究采用两种方法合成了 2 种不同的二氟沙星人工抗原；利用杂交瘤技术建立了 5株分泌抗二 氟沙星单克隆抗体的细胞株：在此基础上建立了畜禽产品中二氯沙 星残留的快速ELISA检测方法间接竞争ELISA (ci-ELISA)法。本研究绘制了 DF

14、X对单抗3d3的抑制曲线，单抗的工作浓度为 1: 1500,包被原DFXOVA的工作浓度为8gg/mLo标准曲线在 25 000ng/mL之间线性关系良好(r= -0.9826),检测限(LOD)为 2ng/mL, DFX的ICso为32.56ng/mL。交叉试验说明该株单抗与恩诺 沙星的交叉反响率为10.28%,与沙拉沙星、环丙沙星、诺氟沙星以 及氧氟沙星的交叉反响率接近0;与氯霉素、SMZ、四环素和阿莫西 林的交叉反响率均为0o作品在何 时、何地、何 种机构举行的 会议上或报刊 上发表及所获 奖励作品在何 时、何地、何 种机构举行的 会议上或报刊 上发表及所获 奖励鉴定结果该株单克隆抗体经

15、试验条件的进一步优化后可用于畜禽产品中 二氟沙星残留的快速检测。请提供对于理 解、审查、评 价所申报作品 具有参考价值 的现有技术及 技术文献的检 索目录1 Watanabe H, Satake A, Kido Y, et al. Monoclonal-based enzyme-linked immunosorbent assay and immunochromatographic assay for enrofloxacin in biological matrices. Analyst. 2(X)2. 127(1): 98-1032蔡勤仁。恩诺沙星单克隆抗体的制备及初步鉴定。2001.华南

16、农业大学硕士毕业论文Dixon-Holland DE, Katz SE. Competitive direct enzyme-linked immunosorbent screening assay for the detection of sulfamethazine contamination of animal feeds. J Assoc Off Anal Chcm. 1991. 74(5): 784-9Stanker LH, Buckley S, Muldoon M, et al. A monoclonal antibody-based immunoassay for the det

17、ection of ceftiofur in milk. Food Agric. Immun. 1998. 10(2): 121-131申报材料清单 （申报论文一 篇，相关资料 名称及数量）申报摘要一份。科研管理 部门签章以上情况属实。2002年n月8日C.当前国内外同类课题研究水平概述说明：1.申报者可根据作品类别和情况填写;2 .填写此栏有助于评审。随着集约化畜牧业的开展，兽药和饲料添加剂的使用越来越广泛并发 挥了极其重要的作用；与此同时，兽药的不合理使用造成的药物残留问 题也越来越突出。近年来，由于畜禽产品中兽药残留和其他有害物质超 标造成的餐桌污染和引发的食物中毒事件时有发生。随着中国

18、加入WTO, 长期制约我国畜禽产品出口的“关税壁垒”已经打破。但是新的非关税 壁垒一“绿色贸易壁垒”将成为制约我国畜产品出口的主要屏障。氟喳诺酮类药物是70年代后期开展起来的第三代喳诺酮类抗菌药。近 年来，对氟哇诺酮类药物在兽医和人医临床上应用时所产生的耐药性、 残留毒性以及不良反响的报道越来越多。该类药物具有光半抗原特性， 可导致T细胞介导的免疫反响发生；进入脑组织后，可产生神经系统反响。 动物实验说明，氟喳诺酮类药物还可以引起幼畜的关节炎、跟腱炎，对 幼畜的负重关节造成影响，引起过敏性休克、恶心、呕吐以及静脉炎等 病症。二羸沙星最初是开发用于人医临床，但由于其毒性太大，而被人医临 床淘汰，

19、随在兽医临床中开始使用。因而急需制定一个切实有效的平安 评价程序来适时监控动物性产品中羸喳诺酮类药物的残留。我国对二氟沙星在各种组织的最高残留限量标准已经有相应的规 定，其ADI值为OlOjag/kg;在牛的肌肉、脂+皮、肝、肾中的残留限量 分别为400、100、800、800ppm;在鸡/火鸡牛的肌肉、脂+皮、肝、肾 中的残留限量分别为300、400、1900、600ppmo目前，用于二氟沙星检 测的方法有：微生物法、HPLC、LCMS、SDF等。上述检测方法均需要 复杂的样品前处理过程且常常需要有机溶剂进行相关的药物提取工作， 容易对环境造成污染，分析费时费力且需要专门的仪器设备和熟练的专

20、 业人员而不易推广。同时，上述方法存在的一个最大缺乏就是上述检测 方法仅仅局限于对产生残留这一危害的终端结果进行检测，从而忽略了 对残留形成过程的监督监管。国内目前还缺乏一种快速、准确、易于推 广使用的检测手段提供给广大生产企业和屠宰场等相关行业。近年来，陆续有利用单克隆抗体进行检测同类药物的报道。 Holtzapple (1997)报道利用抗沙拉沙星的单克隆抗体检测沙拉沙星在 动物组织中的残留取得成功。方法检测限可达2ppb;在10、50. 100ppb 添加水平下，组织样本平均回收率为132、78和81% o Saraf loxacin作 抑制物时,ICso范围在7.348.3ppb间。蔡勤仁(2001)利用恩诺沙星的 照基与载体蛋白BSA、OVA的胺基反响形成酰胺键，借此将药物与载体蛋 白交联，然后免疫BALB/c小鼠制备抗恩诺沙星的单克隆抗体取得成功。 方法检测限可达0. 13ppb：用Enrofloxacin作抑制物时，IC50为 21.6