多聚酶链式反应扩增DNA片段2

1、课题2多聚酶链式反应扩增DNA片段聚合酶链反应(Polymerase Chain Reaction ,PCR)是80 年代中期发展起来的体外核酸扩增技术。它具有特异、敏感、产率高、快速、简便、重复性好、易自动化等突出优点；能在一个试管内将所要研究的目的基因或某一DNA 片段于数小时内扩增至十万乃至百万倍,使肉眼能直接观察和判断；可从一根毛发、一滴血、甚至一个细胞中扩增出足量的DNA 供分析研究和检测鉴定。过去几天几星期才能做到的事情，用PCR 几小时便可完成。PCR 技术是生物医学领域中的一项革命性创举和里程碑。PCR技术概论多聚酶链式反应扩增DNA片段2将离心管放入PCR仪上，设置好PCR仪

2、的循环程序。过程：将微量离心管放在离心机上,离心约10s。4、离心5、反应离心目的：使反应液体集中在离心管底部，提升反应效果。（一）理论上DNA扩增数目的计算三、课题成果评价1 、一条DNA，复制n次， DNA为：2n2 、 a条DNA，复制n次， DNA为：a2n（二）实验中DNA含量的测定1 、原理能够通过计算DNA含量来评价扩增的效果，DNA在260nm的紫外线波段有一强烈的吸收峰，峰值的大小与DNA的含量相关。将离心管放入PCR仪上，设置好PCR仪的循环程序。过程：将微量离心管放在离心机上,离心约10s。4、离心5、反应离心目的：使反应液体集中在离心管底部，提升反应效果。过程：盖严微量

3、离心管口的盖子，用手指轻轻弹击管壁。注意：3、混合B、手指轻轻弹击微量离心管的管壁，目的是使反应液混合均匀。A、离心管口的盖子一定盖严，防止实验中脱落或液体外溢。二、 实验操作1、PCR仪（一）设备及用具实质上一台能够自动调控温度的仪器。2、微量离心管一种薄壁塑料管，总容积为0.5ml。3、微量移液器用于定量转移PCR配方中的液体，其上的一次性吸液枪头用一次更换一次。二、 实验操作1、PCR仪（一）设备及用具实质上一台能够自动调控温度的仪器。2、微量离心管一种薄壁塑料管，总容积为0.5ml。3、微量移液器用于定量转移PCR配方中的液体，其上的一次性吸液枪头用一次更换一次。一、基础知识（一）回忆

4、DNA的复制1、发生时间：发生在细胞有丝分裂的间期和减数第一次分裂间期。2、特点(方式)：边解旋边复制半保留复制多起点复制3、合成条件模板：原料：游离的脱氧核苷酸DNA两条链能量：ATP酶:解旋酶、DNA聚合酶（反应条件温和）4、场所：细胞核(主)、线粒体、叶绿体引物：使DNA聚合酶从引物的3端开始 连接脱氧核苷酸(一小段RNA)(二）PCR原理及条件1概念：PCR即_，是一种体外迅速扩增DNA片段的技术。它能以极少量的_为模板，在短时间内复制出上百万份的DNA拷贝。多聚酶链式反应DNA2DNA的平面结构：AGCT5端3端氢键ATGC3端: -OH端5端:磷酸基团的末端注意：1、DNA聚合酶不

5、能从头开始合成DNA，而只能从3端延伸DNA链，所以，DNA复制需要引物 2、DNA的合成方向总是从子链的5端向3端延伸（1）、 DNA 分子的热变性原理DNA双链单链变性（加热80-100）复性（缓慢冷却）变性的目的：复性的目的：解开双链有利于引物与两条单链结合 在80100 的温度范围内，DNA的双螺旋结构将解体，双链分开，这个过程称为变性。3、PCR原理1234522557294时间（min）温度（）适温延伸高温变性低温复性重复13步30轮（2）、步骤：变性 复性延伸（3）、PCR 反应的条件DNA模板；分别与两条模板链相结合的两种引物（引物和引物）；四种脱氧核苷酸；耐高温的聚合酶（Ta

6、q DNA聚合酶）；控制温度，但不需解旋酶；需要在一定的缓冲液中实行。(二)PCR反应的过程1、变性： 温度上升到90以上时,双链DNA解聚成为单链。2、复性（退火）： 温度下降到50左右,引物与模板DNA单链的互补序列配对结合。3、延伸： 温度上升到72左右,溶液中的4种脱氧核苷酸在Taq DNA聚合酶的作用下,根据碱基互补配对的原则合成新的DNA链。PCR 循环第一步 ：加热变性：双链DNA解聚成为单链靶序列靶序列引物 引物 53553533PCR 循环第二步 ：引物与靶序列复性（退火）：引物与模板DNA单链的互补序列配对结合靶序列靶序列引物引物53553533Taq DNA聚合酶PCR

7、循环第三步 ：引物延伸：合成新的DNA链靶序列 靶序列第1个 PCR 循环完成后 ：得到两个拷贝的靶序列30次循环后靶序列扩增的数量4、PCR 循环的结果 DNA聚合酶只能特异性地复制处于两个引物之间的DNA序列，使这段固定长度的序列呈指数扩增。从第二轮循环开始，上一次循环的产物也作为模板参与反应，并且由引物延伸而成的DNA单链会与引物结合，实行DNA的延伸。二、 实验操作1、PCR仪（一）设备及用具实质上一台能够自动调控温度的仪器。2、微量离心管一种薄壁塑料管，总容积为0.5ml。3、微量移液器用于定量转移PCR配方中的液体，其上的一次性吸液枪头用一次更换一次。PCR仪微量离心管微量移液器1

8、、准备2、移液（二）实验操作步骤按照PCR反应体系的配方将所需用的试剂摆放在实验桌上用微量移液器按照PCR反应体系配方往微量离心管里面加入各种试剂过程：盖严微量离心管口的盖子，用手指轻轻弹击管壁。注意：3、混合B、手指轻轻弹击微量离心管的管壁，目的是使反应液混合均匀。A、离心管口的盖子一定盖严，防止实验中脱落或液体外溢。将离心管放入PCR仪上，设置好PCR仪的循环程序。过程：将微量离心管放在离心机上,离心约10s。4、离心5、反应离心目的：使反应液体集中在离心管底部，提升反应效果。多聚酶链式反应扩增DNA片段2PCR技术高度灵敏，为了避免外源DNA等因素的污染而造成干扰实验，PCR操作时要注意

9、做到：6、注意事项隔离操作区，所用微量离心管、枪头、缓冲液以及蒸馏水等在使用必须实行高压灭菌；分装试剂，简化操作程序，使用一次性枪头。（一）理论上DNA扩增数目的计算三、课题成果评价1 、一条DNA，复制n次， DNA为：2n2 、 a条DNA，复制n次， DNA为：a2n（二）实验中DNA含量的测定1 、原理能够通过计算DNA含量来评价扩增的效果，DNA在260nm的紫外线波段有一强烈的吸收峰，峰值的大小与DNA的含量相关。多聚酶链式反应扩增DNA片段22 、过程稀释2uLPCR反应液，加入98uL蒸馏水，即将样品实行50倍稀释。对照调零以蒸馏水作为空白对照，在波长260nm处，将紫外分光光度计的读数调节至零。取DNA稀释液100uL至比色杯中，测定260nm处的光吸收值。测定并读数计算DNA含量（ g ） 50 x（260nm的读数）x稀释倍数公式中50的含义：50g /ml的DNA在标准厚度为1cm比色杯中的吸光值为1。比色杯四、 课题延伸例如：PCR产物每轮循环增加一倍，30轮循环扩增量达230个拷贝（109拷贝）PCR技术是80年代中期发展起来的体外核酸扩增技术。 它具有特异性强、敏感性高、产率高、 快速