第五章蛋白质化学共页课件

1、第五章 蛋白质蛋白质是生命活动的物质基础生物体内的蛋白质是除水以外，机体组织中最多的组分，占人体干重的45%，占细菌干重的5070% 。1 概述一. 蛋白质的生物学意义是一切生物体中普遍存在的生物大分子，是生物功能的主要载体。生物遗传形状（存在于信息大分子DNA中）是通过蛋白质来表现的。 酶、调节蛋白、转运蛋白、贮存蛋白等 蛋白质种类繁多、各具一定的相对分子量（一般在一万到一百万，甚至高达数百万）、复杂的分子结构和特定的生物功能。二、蛋白质的生物学功能1.作为生物催化剂：在体内催化各种物质代谢反应的酶几乎都是蛋白质。2.调节代谢反应：一些激素是蛋白质或肽，如胰岛素、生长素。3.运输载体：如红细

2、胞中运输O2、CO2要靠Hb(Hemoglobin血红蛋白)、运输脂类物质的是载脂蛋白、运铁蛋白等转运蛋白或叫载体蛋白。4.参与机体的运动：如心跳、胃肠蠕动等，依靠与肌肉收缩有关的蛋白质来实现，如肌球蛋白、肌动蛋白。5.参与机体的防御： 机体抵抗外来侵害的防御机能，靠抗体，抗体也称免疫球蛋白，是蛋白质。6.接受传递信息：如口腔中的味觉蛋白、视网膜中的视觉蛋白。7.调节或控制细胞的生长、分化、遗传信息的表达。8.其它：如鸡蛋清蛋白、牛奶中的酪蛋白是营养和储存蛋白；胶原蛋白、纤维蛋白等属于结构蛋白。还有甜味蛋白、毒素蛋白等都具有特异的生物学功能。 所以，我们不难理解，为什么说没有蛋白质就没有生命。

3、三、蛋白质的分类1.根据分子形状分：球状蛋白质、纤维状蛋白质2.根据功能分：活性蛋白质、结构蛋白质。3.根据组成分：（1）简单蛋白质：清蛋白、球蛋白、谷蛋白、醇溶谷蛋白、组蛋白、精蛋白、硬蛋白。（2）结合蛋白质：色素蛋白、金属蛋白、磷蛋白、核蛋白、脂蛋白、糖蛋白。四. 蛋白质的水解完全水解：用浓酸、碱将蛋白质完全水解为氨基酸。 酸水解：无消旋作用，产物为L-氨基酸。 碱水解：多数氨基酸被破坏，有消旋现象。部分水解： 一般用酶或稀酸在较温和条件下，将蛋白质分子切断，产物为分子大小不等的肽段和氨基酸。蛋白酶：(内切酶、内肽酶）胰蛋白酶、糜蛋白酶、胃蛋白酶等。1.酸水解 条件：510倍的20%的盐酸

4、煮沸回流1624小时，或加压于120水解2小时。 优点：可蒸发除去盐酸，水解彻底，终产物为L-氨基酸，产物单一，无消旋现象。 缺点：色氨酸破坏，并产生一种黑色的物质：腐黑质，水解液呈黑色。2. 碱水解条件：4mol/L Ba(OH)2或6mol/L NaOH煮沸6小时。优点：水解彻底，色氨酸不被破坏，水解液清亮。缺点：产生消旋产物，破坏的氨基酸多，一般很少使用。3. 蛋白酶水解条件：蛋白酶如胰蛋白酶、糜蛋白酶，常温3740， pH值58 。优点：氨基酸不被破坏，不发生消旋现象。缺点：水解不完全，中间产物多。 蛋白质酸碱水解常用于蛋白质的组成分析，而酶水解用于制备蛋白质水解产物。一. 蛋白质的元

5、素组成 蛋白质是有机化合物，离不开C、H、O三种元素，还含有N、P、S、金属元素等。 含量% ： 5055 67 2023 1517 0.33 微量或无 元素组成 ： C H O N S 其它 蛋白质中N是特征元素，且含量恒定，为16%左右 ，即16克氮/100克蛋白质，故可以用定氮法测量蛋白质含量，即：每100克蛋白质含氮16克，100/16=6.25克蛋白质含氮1克。所以，每克样品含氮量6.25100=100克样品蛋白质含量（克%）。 有些蛋白质含有其他微量元素：P、Fe、Cu、Mn、Zn、Co、Mo、I 等。 2 蛋白质的基本结构氨基酸二、蛋白质分子的基本组成单位氨基酸（一）氨基酸的结构

6、通式：不同氨基酸在于R不同，除了R为H的甘氨酸外，其他氨基酸a碳原子都有手性，具旋光异构，存在D和L型 ，构成天然蛋白质的氨基酸均为L型蛋白质氨基酸： 蛋白质中常见的20种氨基酸稀有的蛋白质氨基酸：蛋白质组成中，除上述20种常见氨基酸外，从少数蛋白质中还分离出一些稀有氨基酸，它们都是相应常见氨基酸的衍生物。如4-羟脯氨酸、5-羟赖氨酸等。非蛋白质氨基酸：生物体内呈游离或结合态的氨基酸。生物体内常见氨基酸的分类（二）氨基酸的结构与分类二十种常见蛋白质氨基酸的分类、结构及三字符号据营养学分类 必需非必需据R基团化学结构分类 脂肪族A （中性、含羟基或巯基、酸性、碱性）芳香族A(Phe、Tyr、Tr

7、p)杂环(His、Pro)据R基团极性分类极性R基团AA非极性R基团AA（种）不带电荷（种）据氨基、羧基数分类一氨基一羧基一氨基二羧基(Glu、Asp)二氨基一羧基(Lys、His、Arg)人的必需氨基酸LysTrpPheValMetLeuIleThrArg、His带电荷：正电荷（种）负电荷（种）1、按氨基酸分子中羧基与氨基的数目分： （1）酸性氨基酸：一氨基二羧基氨基酸，有：天冬氨酸、谷氨酸、（2）碱性氨基酸：二氨基一羧基氨基酸 ，有：赖氨酸、精氨酸、组氨酸（3）中性氨基酸：一氨基一羧基氨基酸，有：甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、甲硫氨酸、半胱氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、酪氨酸、脯氨酸

8、、天冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸。酸性氨基酸及酰胺天冬氨酸 （Asp,D）谷氨酸 （Glu,E）天冬酰胺 （Asn,N）谷氨酰胺 （Gln,Q）碱性氨基酸赖氨酸 （Lys,K）精氨酸 （Arg,R）组氨酸 （His,H）杂 环氨基酸2、按侧基R基的结构特点分： （1）脂肪族氨基酸（2）芳香族氨基酸：苯丙氨酸、色氨酸、酪氨酸（3）杂环氨基酸：脯氨酸、组氨酸杂环氨基酸组氨酸 （His,H）脯氨酸 （Pro,P）芳香族氨基酸苯丙氨酸 （Phe,F）酪氨酸 （Tyr,Y）色氨酸 （Trp,W）甘氨酸 （Gly,G）丙氨酸 （Ala,A）缬氨酸 （Val,V）亮氨酸 （Leu,L）异亮氨酸 （Ile

9、,I）中性脂肪族氨基酸含羟基或硫脂肪族氨基酸丝氨酸 （Ser,S）苏氨酸 （Thr,T）半胱氨酸 （Cys,C）甲硫氨酸 （Met,M）3、按侧基R基与水的关系分： （1）非极性氨基酸：有甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、甲硫氨酸、半胱氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、酪氨酸、脯氨酸。（2）极性不带电氨基酸：天冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸。（3）极性带电氨基酸：天冬氨酸、谷氨酸、赖氨酸、精氨酸、组氨酸。4、按氨基酸是否能在人体内合成分： （1）必需氨基酸：指人体内不能合成的氨基酸，必须从食物中摄取，有八种：赖氨酸、色氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、苏氨酸。（2）非必需氨基

10、酸：指人体内可以合成的氨基酸。有十种。（3）半必需氨基酸：指人体内可以合成但合成量不能满足人体需要（特别是婴幼儿时期）的氨基酸，有两种：组氨酸、精氨酸。 二十种氨基酸的名称和结构如图所示:注：二十种氨基酸的结构特点支链氨基酸：缬氨酸、亮氨酸，异亮氨酸含羟基的氨基酸：丝氨酸、苏氨酸含硫的氨基酸：半胱氨酸（含巯基）、 甲硫氨酸（含硫甲基）含苯环的氨基酸：苯丙氨酸、色氨酸、酪氨酸含胍基的氨基酸：精氨酸含咪唑基的氨基酸：组氨酸亚氨基酸：脯氨酸含酰胺的氨基酸：天冬酰胺、谷氨酰胺含吲哚基的氨基酸：色氨酸含-氨基的氨基酸：赖氨酸（三）蛋白质中不常见的氨基酸羟-脯氨酸、羟-赖氨酸、r-羧基谷氨酸、6-氮-甲基

11、赖氨酸（四）非蛋白氨基酸 鸟氨酸、胍氨酸、高半胱氨酸、高丝氨酸、-丙氨酸、-氨基丁酸等三.氨基酸的理化性质（一）物理性质1.形态：均为白色结晶或粉末，不同氨基酸的晶型结构不同。2.溶解性：一般都溶于水，不溶或微溶于醇，不溶于丙酮，在稀酸和稀碱中溶解性好。3.熔点：氨基酸的熔点一般都比较高，一般都大于200，超过熔点以上氨基酸分解产生胺和二氧化碳。 4.旋光性：除甘氨酸外的氨基酸均有旋光性。5.光吸收：氨基酸在可见光范围内无光吸收，在近紫外区含苯环氨基酸(PheThyTrp)有光的吸收。（二）化学性质1.氨基酸的两性电离及等电点： 氨基酸既含有氨基，可接受H+，又含有羧基，可电离出H+，所以氨基

12、酸具有酸碱两性性质。通常情况下，氨基酸以两性离子的形式存在，如下图所示： 从上图可知：氨基酸在酸性环境中，主要以阳离子的形式存在，在碱性环境中，主要以阴离子的形式存在。在某一pH环境下，以两性离子（兼性离子）的形式存在。该pH称为该氨基酸的等电点。所以氨基酸的等电点可以定义为：氨基酸所带正负电荷相等时的溶液pH。2.由-氨基参加的反应： (1) 与亚硝酸反应：放出氮气，氮气的一半来自氨基氮，一半来自亚硝酸，在通常情况下测定生成的氮气的体积量可计算氨基酸的量，此反应可用于测定蛋白质的水解程度。（2）桑格反应与2,4-二硝基氟苯(DNFB)的反应NO2FO2N+ H2NCHCOOHRNO2O2NH

13、NCHCOOHR+ HF弱碱性DNP-氨基酸（黄色）（3）埃德曼反应与异硫氰酸苯酯（PITC）的反应N=C=S + NCHCOOHHHRPITCNCNCHCOOHHHRSPTC-氨基酸NCHRSNCCOPTH-氨基酸pH8.3无水HFEdman （苯异硫氰酸酯法）氨基酸顺序分析法实际上也是一种N-端分析法。此法的特点是能够不断重复循环，将肽链N-端氨基酸残基逐一进行标记和解离。重复测定多肽链N端氨基酸排列顺序，设计出“多肽顺序自动分析仪” 3.-氨基与-羧基共同参加的反应(1)与茚三酮的反应：除脯氨酸与羟脯氨酸外，可与其它氨基酸生成蓝紫色化合物。脯氨酸与羟脯氨酸为黄色化合物。 (2)成肽反应：

14、3 蛋白质的结构蛋白质的结构具有多种结构层次，包括一级结构和空间结构，空间结构又称为构象。蛋白质的构象：指蛋白质特有的空间结构空间结构包括二级结构、三级结构和四级结构。在二级与三级之间还存在超二级结构和结构域这两个结构层次。一、蛋白质的一级结构 蛋白质的一级结构（Primary structure）又称为共价结构或化学结构。它是指蛋白质中的氨基酸按照特定的排列顺序通过肽键连接起来的多肽链结构。 （一）肽键与肽链1.肽键：一个氨基酸的-COOH 和相邻的另一个氨基酸的 -NH2脱水形成共价键。如下图：肽键和肽的结构2. 氨基酸借肽键连接起来叫肽，肽是一大类物质，即： 1）两个氨基酸组成的肽叫二肽

15、；2）三个氨基酸组成的肽叫三肽；3）多个氨基酸组成的肽叫多肽；4）氨基酸借肽键连成长链，称为肽链，肽链两端有 自由-NH2和-COOH，自由-NH2端称为N-末端（氨基末端）， 自由-COOH端称为C-末端（羧基末端）；5）构成肽链的氨基酸已残缺不全，称为氨基酸残基；6）肽链中的氨基酸的排列顺序，一般-NH2端开始，由N指 向C，即多肽链有方向性，N端为头，C端为尾。（二）天然活性肽自然界中有自由存在的活性肽，主要有：1. 谷胱甘肽（GSH）：三肽（Glu-Cys-Gly），广泛存在于生物细胞中，含有自由的巯基，具有很强的还原性，可作为体内重要的还原剂，保护某些蛋白质或酶分子中的巯基免遭氧化，

16、使其处于活性状态。 2.促甲状腺素释放激素：三肽（焦谷氨酰组氨酰脯氨酸），可促进甲状腺素的释放。 3.短杆菌素S：环十肽，含有D-苯丙氨酸、鸟氨酸，对革兰氏阴性细菌有破坏作用，主要作用于细胞膜。 4.青霉素：含有D半胱氨酸和D缬氨酸的二肽衍生物 。主要破坏细菌的细胞壁粘肽的合成引起溶菌。 5.牛催产素与加压素：均为九肽，分子中含有一对二硫键，两者结构类似。前者第九位为Gly或Lys或Phe，后者为Arg。前者可刺激子宫的收缩，促进分娩。后者可促进小动脉收缩，使血压升高，也有抗利尿作用，参与水、盐代谢的调节。 牛催产素 : S S CysTyrIleGlnAsnCysProLeuGly-NH2牛

17、加压素 :7.脑啡肽：为五肽，具有镇痛作用。 S S CysTyrPheGlnAsnCysProAryGly-NH26.舒缓激肽：促进血管舒张，促进水、钠离子的排出。（三）蛋白质的一级结构研究 一级结构的研究包括：蛋白质的氨基酸组成测定，肽链数目的确定，末端氨基酸种类测定，氨基酸的排列顺序测定，二硫键位置的测定，酰胺位置的确定。大致步骤如下： 1.获取一定量纯的蛋白质样品，测其分子量，然后将样品完全水解，确定该蛋白质的氨基酸种类、数目及每种氨基酸的含量。2.进行末端测定，确定该蛋白质的肽链数目，N-端和C-端是什么氨基酸。 N-末端测定法：常采用2，4二硝基氟苯法、Edman降解法、丹磺酰氯法

18、。 C-末端测定法：常采用羧肽酶法。3.肽链的拆分:经末端的分析，若该蛋白质含有两条以上的肽链，而且肽链之间是通过非共价键连接，使用蛋白质变性剂将其变性后分开；若蛋白质肽链之间通过共价键相连，则可采取过甲酸氧化法或巯基乙醇还原法将其分开。4.各肽链中氨基酸排列顺序的测定:使用两种以上的方法将肽链部分水解成肽段，测各肽段的氨基酸顺序，然后使用片段重叠法推测出完整肽链的氨基酸顺序。5.确定二硫键和酰胺的位置 二、蛋白质的二级结构 （一）构型与构象 构型：指一个不对称的化合物中不对称中心上的几个原子或基团的空间排布方式。如单糖的-、-构型，氨基酸的D-、L-构型。当从一种构型转换成另一种构型的时候，

19、会牵涉及共价键的形成或破坏。 构象：指一个分子结构中的一切原子绕共价单键旋转时产生的不同空间排列方式。一种构象变成另一种构象不涉及共价键的形成或破坏。维持蛋白质二级结构的作用力主要是氢键。蛋白质的二级结构是指多肽链的主链骨架沿一维方向所形成的规则的周期性结构，如-螺旋结构、-折叠结构等。(1) -螺旋结构（-Helix ）(2) -折叠结构（-sheet ）(3) -转角（ - turn ）(4) 无规卷曲 (random coil)多肽链的二级结构主要有以下几种方式 螺旋有左右手之分（1）-螺旋结构特点 1) 主链绕中心轴按右手螺旋方向盘旋，侧链伸向螺旋外侧。每3.6 个氨基酸残基前进一圈，

20、每圈前进距离是0.54nm(螺距），每个氨基酸残基占0.15nm。 2) 每个氨基酸残基的亚氨基与它前面第四个氨基酸残基的羰基氧原子形成氢键，氢键与螺旋轴近似平行。 -螺旋在许多蛋白中存在，如-角蛋白、血红蛋白、肌红蛋白等，主要由-螺旋结构组成。 螺旋的结构通常用“SN”来表示，S表示螺旋每旋转一圈所含的残基数，N表示形成氢键的C=O与H-N原子之间在主链上包含的原子数。 （2）、-折叠结构(-片层结构) -折叠(-pleated sheets)又称-片层、-结构，其结构要点如下：多肽链呈锯齿状（或扇面状）排列成比较伸展的结构；相邻两个氨基酸残基的轴心距离为0.35nm，侧链R基团交替地分布在

21、片层平面的上下方，片层间有氢键相连；有平行式和反平行式两种，平行式的折叠其=-119。，=+113。反平行折叠其=-139。，=+135。 这种片层在丝心蛋白里大量存在。（3）、-转角蛋白质分子的主链在盘曲折叠运行中，往往发生180度的急转弯，这种回折部位的构象，即所谓的-转角。 -转角是由4个连续的氨基酸残基组成的，第一个氨基酸残基的羰基氧原子与第四个氨基酸残基的亚氨基连接来稳定构象。螺旋折叠片转角无规卷曲（4）、无规卷曲它是多肽主链不规则、多向性随机盘曲所形成的构象。球蛋白分子中常见的一种主链构象。(1)、球状蛋白质分子的三级结构 球状蛋白质分子的二级结构不是活性分子的结构形式，需要在二级

22、结构的基础上再盘曲折叠形成三级结构。 蛋白质分子的三级结构是指蛋白质分子在一、二级结构的基础上，借助于各种非共价键在三维空间盘曲、折叠成具有特定走向的紧密、近似球状的构象。 蛋白质分子的三级结构包括全部主链、侧链在内的所有原子的空间排部，但不包括肽链间的相互关系 球状构象给出最低的表面积和体积比，因而使蛋白质与环境的相互作用降到最小，最稳定。三、蛋白质的三级结构3. 蛋白质的三级结构 一条多肽链内二级结构单元的彼此组合后的固定结构 作用力来自侧链基团 球状蛋白质分子三级结构的构象特征 (1)三级结构的构象近似球形。 (2)分子中的亲水基团大多相对集中在球形分子的表面，疏水基团相对集中在分子内部

23、。 (3)三级结构构象的稳定性主要靠疏水的相互作用来维系。 (4)三级结构形成后，蛋白质分子的生物活性中心就形成了。在球形分子的表面往往有一个很深的裂隙，活性部位就在其中。三级结构的典型例子是肌红蛋白肌红蛋白的三级结构维系蛋白质空间结构的化学键氢键(hydrogen bond)离子键(盐键)(electrostatic interactions)疏水相互作用(hydrophobic interaction)范德华力(van der waals force)二硫键(disulfide bond)A.三级结构中的作用力包括二硫键、氢键、离子键、疏水作用力、范德华力氢键(侧链间形成)疏水作用“非极性

24、基团被极性水分子排挤相互聚拢”作用力。范德华力（分子间作用力，受彼此距离影响）离子键（或盐键）二硫键肽键 二硫键离子键 氢键疏水键 范德华力 90kcal/mol3kcal/mol1kcal/mol1kcal/mol0.1kcal/mol 这四种键能远小于共价键，称次级键 次级键微弱但却是维持蛋白质三级结构中主要的作用力,原因何在?数量巨大！键 能（2）、纤维蛋白分子的结构在纤维蛋白分子中螺旋肽链一般为平行排列含大量的-螺旋，-折叠片，整个分子呈纤维状角蛋白、丝心蛋白、胶原蛋白的结构都是如此。广泛分布于脊椎和无脊椎动物体内，起支架和保护作用。三条右手-螺旋 一个原纤维 大原纤维 纤维角蛋白四、

25、球状蛋白质分子的四级结构 有些球状蛋白质分子是由两个或两个以上的、具有独立三级结构的肽链单位缔合而成的，这种蛋白质通常称为寡聚蛋白或多体蛋白（multimeric protein）。 寡聚蛋白分子中的每一个三级结构单位称为一个亚基(或亚单位subunit、单体monomer)。 所谓蛋白质分子的四级结构是指就是指寡聚蛋白分子中亚基与亚基之间的立体排布及相互作用关系。 亚基的数目和类型也是四级结构研究的内容。 四级结构的稳定靠非共价键联系：主要包括疏水作用（主要），其次还有离子键、氢键、范德华力来维系。血红蛋白的四级结构五、超二级结构和结构域1超二级结构 超二级结构（Super-secondar

26、y structure）的概念是M.Rossmann于1973年提出来的。蛋白质分子中的多肽链在三维折叠中往往形成有规则的二级结构聚集体，在球蛋白中充当三级结构的构件。常见的有：、等。 2结构域（structural domain） 在一些相对较大的蛋白质分子中，在空间折叠时往往先分别折叠成几个相对独立的区域，再组装成更复杂的球状结构，这种在二级或超二级结构基础上形成的特定区域（三级结构的局部折叠区称为）结构域。它的结构层次介于超二级结构和三级结构之间。如图所示： （一）、多肽的一级结构与功能生物体中存在多种活性肽，如：生长激素、加压素、催产素等。4 蛋白质结构与功能的关系一、蛋白质一级结构与

27、功能的关系 一级结构是空间构象的基础 1、核糖核酸酶的可逆变性RNase是由124氨基酸残基组成的单肽链，分子中 8 个Cys的-SH构成4对二硫键，形成具有一定空间构象的蛋白质分子。在蛋白质变性剂（如8mol/L的尿素）和一些还原剂（如巯基乙醇）存在下，酶分子中的二硫键全部被还原，酶的空间结构破坏，肽链完全伸展，酶的催化活性完全丧失。当用透析的方法除去变性剂和巯基乙醇后，发现酶大部分活性恢复，所有的二硫键准确无误地恢复原来状态。若用其他的方法改变分子中二硫键的配对方式，酶完全丧失活性。这个实验表明，蛋白质的一级结构决定它的空间结构，而特定的空间结构是蛋白质具有生物活性的保证。如下图：（二）、

28、蛋白质的一级结构决定高级结构牛核糖核酸酶的一级结构二硫键 天然状态，有催化活性尿素、-巯基乙醇 去除尿素、-巯基乙醇非折叠状态，无活性2、蛋白质前体的激活无活性的前提称为“原”，如酶原、胰岛素原 由108个氨基酸残基构成的前胰岛素原(pre-proinsulin），在合成的时候完全没有活性，当切去N-端的24个氨基酸信号肽，形成84个氨基酸的胰岛素原（proinsulin），胰岛素原也没活性，在包装分泌时，A、B链之间的33个氨基酸残基被切除，才形成具有活性的胰岛素。如图所示:胰岛素：AB两条链构成，A链含21个氨基酸残基，B链含 30 个氨基酸残基，链间有两对二硫键，A链上有一对二硫键。（切

29、除冗余及其它变化）前体蛋白（一级结构冗余，高级结构错误，因此无生物活性）活性蛋白（具有正确的一级结构和高级结构，因此具有生物活性）适合环境 现知几乎所有遗传病都与蛋白质分子结构改变有关，都称之为分子病。例如镰刀型贫血症，它是由于血红蛋白的-亚基上的第六位氨基酸由谷氨酸变成了缬氨酸，导致血红蛋白的结构和功能的改变，其运输氧气的能力大大地降低，并且红细胞呈镰刀状。 3、分子病镰刀状贫血病：血液中大量出现镰刀红细胞，患者因此缺氧窒息正常细胞 镰刀形细胞它是最早认识的一种分子病。它是由于遗传基因突变导致血红蛋白分子结构的突变。这种由蛋白质分子发生变异所导致的疾病，称为“分子病”正常型 -Val-His

30、-Leu-Thr-Pro-Glu-Lys - 链 谷氨酸镰刀型 -Val-His-Leu-Thr-Pro-Val-Lys - 链 缬氨酸 谷Aa（极性） 缬Aa（非极性）由于缬氨酸上的非极性基团与相邻非极性基团间在疏水力作用下相互靠拢，并引发所在链扭曲为束状，整个蛋白质由球状变为镰刀形，与氧结合功能丧失，导致病人窒息甚至死亡。 所以，蛋白质一定的结构执行一定的功能。功能不同的蛋白质总是有着不同的序列；比较种属来源不同而功能相同的蛋白质的一级结构，可能有某些差异，但与功能相关的结构也总是相同。若一级结构变化，蛋白质的功能可能发生很大的变化。 同源蛋白质有顺序同源性： 比较不同来源的细胞色素C发现

31、，与功能密切相关的氨基酸残基是高度保守的，这说明不同种属具有同一功能的蛋白质，在进化上来自相同的祖先，但存在种属差异。不同种属间的同源蛋白质一级结构上相对应的氨基酸差别越大，其亲缘关系愈远，反之，其亲缘关系愈近。二、蛋白质空间结构与功能的关系1、血红蛋白的变构效应与运输氧的功能(R)relaxed state(T) tense state 血中氧分子的运送：Lung氧分子HemoglobinMyoglobinMuscle静脉动脉环境氧高时Hb 快速吸收氧分子环境氧低时Hb 迅速释放氧分子释放氧分子后Hb 变回 T state任何一个亚基接受氧分子后，会增进其它亚基吸附氧分子的能力 Hb由4条肽

32、链组成：2、2，功能是运载O2 。在去氧Hb亚基中有下列几对离子键： 由于血红蛋白亚基之间存在大量离子键，使其构象呈紧张态，对氧的亲和力很低，第一个亚基与O2结合时，离子键的破坏较难，所需要的能量较多。当血红蛋白的一个亚基结合氧之后引起它的构象从紧张态变成松弛态，其它的离子键也依次破坏，此时破坏离子键所需要的能量也少，构象的变化导致血红蛋白对氧的亲和力大大增强，因此第四个亚基结合氧的能力比第一个大几百倍。 上述Hb与O2结合后，Hb的构象发生变化，这类变化称为变构效应，即通过构象变化影响蛋白质的功能。像血红蛋白这种具有变构效应的蛋白质称为变构蛋白（allosteric protein）。血红蛋

33、白的这种变构效应能更有效地行使其运氧的生物学功能。2、蛋白质变性一些物理或化学因素会破坏蛋白质空间结构，导致蛋白质生物活性丧失，同时引起某些物理性质和化学性质的变化，如溶解度降低、发生沉淀等现象称为蛋白质变性。天然蛋白质和变性蛋白在一级结构上相同，生物活性丧失。变性蛋白质分子恢复其天然构象，称为复性。变性因素：加热/加压/射线/强酸/强碱/有机溶剂等 总之，各种蛋白质都有特定的空间构象，而特定的空间构象又与它们特定的生物学功能相适应，蛋白质的结构与功能是高度统一的。5、蛋白质的性质一、蛋白质分子的大小和形状1、高分子特性：2、形状：纤维状蛋白、球状蛋白纤维蛋白：多结构蛋白，难溶于水，构成支架，

34、如胶原蛋白。球状蛋白：多溶于水，酶/转运蛋白/激素/免疫球蛋白等二、蛋白质的两性电离和等电点 蛋白质与氨基酸相似，也具有两性电离的性质。蛋白质的多肽链含有末端氨基和羧基，一些侧链上含有可解离的基团，有的可以接受氢离子，有的可以电离出氢离子，因此蛋白质具有酸碱两性电离的性质。它的两性电离比氨基酸复杂。 对某一蛋白质而言，在某一pH下，当它所带正负电荷相等的时候，该溶液的pH就称为该蛋白质的等电点。 蛋白质的等电点的大小与蛋白质的氨基酸组成有关。 蛋白质中可解离酸性基团 Glu的-COOH Asp的-COOH Tyr的酚羟基 Cys的-SH碱性基团 Lys的-NH2 His的咪唑基 Arg的-胍基

35、蛋白质分子的总解离蛋白质的等电点 蛋白质溶液在特定的pH下，其分子所带的正、负电荷相等，净电荷为零，这一pH称为 (用PI表示)。蛋白质纯化方法等电点沉淀法蛋白质电泳离子交换法蛋白质两性解离与等电点特性的应用静电排斥力的缺乏蛋白质之间的聚集等电点沉淀几种常见电泳等电聚焦纸电泳聚丙烯酰胺凝胶电泳SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳OFarrell的双向电泳银染结果考马斯亮染色为蓝色 蛋白质溶液有许多高分子溶液的性质，如：扩散慢、易沉降、 粘度大、不能透过半透膜，在水溶液中可形成亲水的胶体。蛋白质水溶液为亲水胶体。不能通过半透膜；分子周围有双电子层和水化层，有利于稳定pr胶体系统。超滤透析三、胶体性质蛋白质

36、的膜分离技术透析四、沉淀反应机理：1）利用pr两性电离性质。 2）许多化学试剂可减少pr与水的亲和力 盐析、醇、酸、重金属离子、生物碱等1、概念蛋白质胶体溶液的稳定性是有条件的、相对的，若改变环境条件，破坏其水化膜和表面电荷，蛋白质亲水胶体便失去稳定性，发生絮凝沉淀的现象，就称为蛋白质的沉淀作用。2、沉淀的方法(1) 等电点沉淀法(2) 盐溶与盐析（分级盐析）盐溶在盐浓度很低时，蛋白质的溶解度随着盐浓度的增加而增加，这种现象称为蛋白质的盐溶。 盐析在蛋白质溶液中加入高浓度的中性盐后，它与蛋白质胶体粒子竞争水份，使蛋白质胶体粒子表面的水化层破坏而失去稳定性，同时降低了蛋白质与水的亲和力而使蛋白质

37、沉淀的现象。 不同的蛋白质的带电性质、分子量不同，水膜厚度不同，故盐析所需的盐浓度也不同。等电点沉淀的蛋白质溶液中加入NaCl后沉淀溶解盐溶（Salting-in）盐溶蛋白质分子在等电点时，容易互相吸引，聚合沉淀；加入盐离子会破坏这些静电相互作用，使分子散开而溶于水盐析向蛋白质溶液中加入大量硫酸铵后蛋白质会沉淀析出盐析（Salting out）蛋白质分子表面的疏水区域，聚集了许多水分子，盐浓度高时，这些水分子被盐抽出（水化层被破坏），暴露出的疏水区域，它们发生相互作用而沉淀。（NH4）2SO4一般来讲，分子量越大的蛋白质分子，越容易盐析，所需盐浓度也越低。因此，对于不同分子大小的蛋白质，可采用

38、不同的盐浓度进分级沉淀。常用的盐是(NH4)2SO4 强电解质盐如硫酸胺、氯化钠、硫酸钠等。 盐析的机理：破坏蛋白质的水化膜，中和表面的净电荷。 盐析法是最常用的蛋白质沉淀方法，该方法不会使蛋白质产生变性。(3) 有机溶剂沉淀法在蛋白质溶液中，加入能与水互溶的有机溶剂如乙醇、丙酮等，蛋白质产生沉淀。有机溶剂沉淀法的机理：破坏蛋白质的水化膜。有机溶液沉淀蛋白质通常在低温条件下进行，否则有机溶剂与水互溶产生的溶解热会使蛋白质产生变性。(4) 重金属盐沉淀法 （条件：pH 稍大于pI为宜）蛋白质在碱性溶液中带负电，可与重金属离子如Zn+2、Cu+2、Hg+2、Pb+2、Fe+3等作用，产生重金属蛋白

39、盐沉淀。重金属沉淀蛋白质会使蛋白质产生变性，长期从事重金属作业的人应多吃高蛋白食品，以防止重金属离子被机体吸收后造成对机体的损害。(5) 热变性沉淀法 加热灭菌生物碱试剂沉淀法（条件：pH稍小于pI）生物碱是植物组织中具有显著生理作用的一类含氮的碱性物质。能够沉淀生物碱的试剂称为生物碱试剂。生物碱试剂一般为弱酸性物质，如单宁酸、苦味酸、三氯乙酸等。生物碱试剂沉淀蛋白质的机理：在酸性条件下，蛋白质带正电，可以与生物碱试剂的酸根离子结合而产生沉淀。 “柿石症”的产生就是由于空腹吃了大量的柿子，柿子中含有大量的单宁酸，使肠胃中的蛋白质凝固变性而成为不能被消化的“柿石”。(6) 生物碱试剂沉淀法五、蛋

40、白质的变性作用1.蛋白质变性的概念：天然蛋白质受物理或化学因素的影响后，使其失去原有的生物活性，并伴随着物理化学性质的改变，这种作用称为蛋白质的变性。2.使蛋白质变性的因素1）物理因素：高温、高压、射线等 2）化学因素：强酸、强碱、重金属盐等3.变性的本质： 分子中各种次级键断裂，使其空间构象从紧密有序的 状态变成松散无序的状态，一级结构不破坏。4.蛋白质变性后的表现：1）生物学活性消失2）理化性质改变：溶解度下降，粘度增加，紫外吸收增 加，侧链反应增强，对酶的作用敏感，易被水解。 六、蛋白质的颜色反应 蛋白质的颜色反应主要与其定性、定量测定有关： 1.茚三酮反应：多肽与蛋白质都能与之反应生成

41、蓝色化合物。2.双缩脲反应：多肽与蛋白质都能和双缩脲试剂反应，随着肽 键的数目越多，颜色依次为粉红、紫红、紫、蓝。3.酚试剂反应：多肽、蛋白质与酚试剂生成蓝色的化合物。碱性条件下，蛋白质中的酪氨酸、色氨酸可与酚试剂(含磷钼酸、磷钨酸的化合物)反应生成蓝色化合物，蓝色的强度和蛋白质的量成正比。 可用于测定蛋白质含量。但有缺陷七、蛋白质的紫外吸收性质一般蛋白质在280nm波长具有最大吸收，这是由于蛋白质分子中的Trp、Tyr和Phe存在共轭双键的缘故。 蛋白质溶液能在近紫外区（280nm处）有光吸收，主要是由带芳香环的氨基酸决定的。6 蛋白质的分离、纯化一、分离纯化蛋白质的意义 研究蛋白质的结构与功能：要求纯度高，不变性； 提取活性的酶或蛋白质：必须保持天然活性状态； 作为药物或食品添加剂：纯度要