第九章—核酸分子杂交(上)周琳

1、核酸分子杂交技术Nucleic Acid Molecular Hybridization共四十页主讲(zhjing)内容核酸分子(fnz)杂交的基本原理核酸探针核酸分子杂交技术共四十页一、DNA的变性(binxng)（denaturation）变性：在一定的条件下，DNA双螺旋之间的氢键断裂，解离成两条无规则的卷曲状单链DNA分子(fnz)，此现象称为变性。共四十页复性：去除变性因素后，单链DNA通过碱基互补配对原则重新结合(jih)成稳定的双螺旋结构，这一过程称为复性。二、DNA的复性(f xn) (renaturation)退火淬火共四十页 根据核酸变性和复性的原理，来源不同的两条单链核酸

2、分子(fnz)通过碱基互补配对形成异源双链杂交体的过程。三、核酸(h sun)分子杂交杂交的基础：核酸分子单链之间的碱基互补配对。注：分子杂交可以在DNA与DNA、RNA与RNA、RNA与DNA的两条单链之间进行。共四十页 核酸分子(fnz)的浓度 温度 离子强度 核酸分子的复杂性 影响核酸(h sun)分子杂交的因素共四十页四、核酸分子(fnz)杂交技术 通过标记的单链核酸探针与固相支持物上或液相中单链的互补靶序列(xli)退火形成双链杂交体，而定性或定量检测特异DNA或RNA的技术。 共四十页 第二节 核酸(h sun)探针 核酸(h sun)探针的概念 核酸探针的类型 核酸探针的标记 核

3、酸探针的检测方法 共四十页 核酸探针( nucleic probe )：指能够(nnggu)与待测的靶核酸片段互补结合的带有特殊可检测标记的核苷酸片段。一、概念(ginin)共四十页按化学(huxu)本质分： DNA探针 RNA探针按标记(bioj)物分： 放射性标记探针 非放射性标记探针按分子大小分： 寡核苷酸探针 单链探针 双链探针二、核酸探针的类型共四十页二、常见核酸(h sun)探针1.基因组DNA探针(tn zhn) 2.cDNA探针 3.RNA探针4.寡核苷酸探针来源于某种生物的基因组，为某 一基因的全部或部分序列。来源于cDNA,不含有内含子序列，适用于基因表达研究。大多以单链形

4、式存在,杂交效率高。可通过体外转录技术获得。用化学合成技术在体外合成的单链DNA,长度一般为20-50bp。共四十页三、核酸(h sun)探针的标记 1.核酸(h sun)探针的标记物 （1）放射性核素标记物常用放射性核素标记物有： 32P、35S、 3H优点：灵敏度极高,可检测到10-14 10-18g的物质，在最适 条件下，可以测出样品中少于1000个分子的核酸含量，光谱分析法只能鉴定10-9g的物质。 对碱基配对的特异性和稳定性无影响。 特异性高。缺点：放射性污染，有半衰期。共四十页32P或35S同位素标记(bioj)的单核苷酸（）（）（OH）HOH共四十页(2)非放射性标记(bioj)

5、物优点：无放射性污染，稳定性好，可以较长时间存放， 处理方便。缺点：灵敏度、特异性不够(bgu)理想。常用非放射性标记物有：生物素、地高辛、酶、荧光素 共四十页2.核酸探针的标记(bioj)方法（一）酶促法缺口平移(pn y)法随机引物法DNA探针末端标记法（二） 化学法预先标记酶促反应转移探针共四十页（1）缺口(quku)平移法（nick translation） 由DNA酶和大肠杆菌DNA聚合酶共同完成。酶促法共四十页随机引物：含有(hn yu)各种可能排列顺序的六核苷酸片段的混合物。（2）随机(su j)引物法（random priming）酶促法共四十页 在5或3端通过酶促反应(fny

6、ng)加上标记物DNA聚合酶Klenow片段(pin dun)3末端标记法T4多核苷酸激酶5末端标记法聚合酶链反应标记DNA探针RNA探针的标记寡核苷酸链探针的标记（3）探针的末端标记酶促法共四十页 DNA聚合酶Klenow片段(pin dun)3末端标记法限制性内切酶酶促法共四十页 T4多核苷酸激酶(jmi)5末端标记法ATPADP32PT4多核苷酸激酶(jmi)碱性磷酸酶酶促法共四十页1.生物素地高辛标记(bioj)核酸探针2.酶、荧光素标记核酸探针化学法共四十页生物素化核苷酸 生物素 ( biotin ) 标记(bioj)生物素-16-dUTP共四十页 光敏生物素标记(bioj)法 强光

7、10-20分钟 光敏生物素的结构(jigu)共四十页 地高辛 ( digoxigenin ) 标记(bioj)Dig-11-dUTP的结构(jigu)共四十页 酶标记(bioj)碱性(jin xn)磷酸酶辣根过氧化物酶 荧光素标记异硫氰酸荧光素（FITC）荧光素直接与探针核苷酸或磷酸戊糖骨架结合共四十页四、 核酸探针(tn zhn)的检测 核酸分子杂交反应(fnyng)完成后，必须使已标记的核酸探针显示出可检测信号，方能检测未知的待测核酸序列。 1.放射性同位素标记探针的检测 2.非放射性标记探针的检测 共四十页1.放射性同位素标记(bioj)探针的检测（1）放射自显影：利用放射线在X线底片的

8、成影作用来 检测杂交信号。（2）液体(yt)闪烁计数器：共四十页2.非放射性标记探针(tn zhn)的检测（1）直接检测：杂交反应后可以立刻观测结果。如酶 和荧光素直接标记的探针。（2）间接(jin ji)检测：反应结果不能被直接检测, 需经两步 反应：与可检测系统偶联的偶联反 应，显色反应。 共四十页 （1）直接(zhji)检测法 碱性磷酸酶显色(xin s)体系 辣根过氧化物酶显色(xin s)体系酶促显色法荧光法共四十页Dig-DNA探针(tn zhn) + 抗Dig抗体-碱性磷酸酶（或辣根过氧化物酶）+ 底物 （2）间接(jin ji)检测法 偶联反应共四十页 显色(xin s)反应酶

9、法：通过(tnggu)酶促反应使其底物形成有颜色的反应产物碱性磷酸酶辣根过氧化物酶 DAB（二氨基联苯胺）红棕色TMB（四甲基联苯胺）蓝色共四十页第三节 核酸(h sun)分子杂交技术 印迹杂交 核酸(h sun)原位杂交 液相印迹杂交固相杂交共四十页 是将电泳分离的待测DNA片段固定在固相载体上，与标记的核酸探针进行杂交，在与探针有同源(tn yun)序列的位置上显示杂交信号的方法。一、传统的核酸分子杂交(zjio)技术1、Southern 印迹杂交共四十页提取(tq)DNA限制性内切酶消化(xiohu)琼脂糖凝胶电泳碱变性转移到NC膜，高温烘烤与DNA探针杂交放射自显影基本步骤预杂交共四十

10、页图 虹吸印迹法共四十页 与Southern Blotting不同的是：1. 不需要(xyo)限制性核酸酶切; 2. 变性方法不是碱变性，而是采用聚乙二醛和二甲基亚砜、甲醛、甲基氢氧化汞等方法。 检测(jin c)靶分子为RNA RNA极易被环境中存在的RNase 降解，提取时要特别注意RNase 污染问题。2、Northern 印迹杂交共四十页 3、斑点杂交与狭缝(xi fn)杂交 将RNA或DNA变性后直接点样或用狭缝点样器加样于硝酸纤维素膜或尼龙膜上，再用探针进行(jnxng)杂交，这样的方法称为称为斑点杂交（dot blotting）或狭缝杂交(slot blotting)。dot blottingslot blotting共四十页4、Western 免疫(miny)印迹检测(jin c)蛋白质共四十页共四十页内容摘要核酸分子杂交技术Nucleic Acid Molecular Hybridization。复性：去除变性因素后，单链DNA通过碱基互补配对原则重新结合成稳定的双螺旋结构，这一过程称为复性。杂交的基础：核酸分子单链之间的碱基互补配对。来源于某种生物的基因(jyn)组，为某 一基因(jyn