超声引导下微波消融联合自体CIK细胞治疗原发性肝癌的疗效研究(共7页)

1、PAGE PAGE 11超声引导下微波消融联合(linh)自体CIK细胞治疗原发性肝癌的疗效研究周健，刘黎，黄丽雯武汉科技大学附属天佑(tin yu)医院感染科 430064【摘要(zhiyo)】目的：观察超声引导下微波消融(PMCT)联合自体CIK细胞治疗原发性肝癌(HCC)的临床疗效及安全性。方法：62例HCC患者分为两组，PMCT组(n=30例)仅采用PMCT治疗，联合组(n=32例)则采用PMCT联合自体CIK细胞，观察两组临床疗效，KPS评分，治疗前后T细胞亚群及AFP变化，在0.5年、1年、2年的复发率及生存率以及不良反应。结果：联合组治疗总有效率(87.5%)和KPS有效率(90

2、.6%)明显高于PMCT组(70.0%)和(73.3%)(P0.05)，两组治疗后CD3+、CD4+、CD4+/CD8+比值均明显升高(P0.05)，而CD8+及AFP明显下降(P0.05)，联合组升高或下降较PMCT组更为显著(P0.05)；联合组在0.5年、1年、2年的复发率及生存率均明显低于和高于对照组(P0.05)；两组治疗期间均未出现严重不良反应。结论：PMCT联合自体CIK细胞治疗HCC疗效明显优于单纯PMCT，可明显调节患者免疫状态，降低复发率和提高生存率，安全可靠，值得临床推广应用。【关键词】微波消融；CIK细胞；原发性肝癌；T细胞亚群原发性肝癌(Hepatocellular

3、carcinoma, HCC)是目前最常见的恶性肿瘤之一，由于其发病隐匿，确诊时常常失去了手术治疗的机会，影响预后，病死率高1,2。对于无法手术切除特别是伴有转移的患者，采用非手术的治疗方法以及实行综合治疗是目前临床最常用的策略3,4。研究表明，微波消融(percutaneous microwave coagulation therapy, PMCT)治疗小肝癌可获得与手术切除相近的生存疗效5-7。PMCT治疗肝癌具有并发症发生率低、恢复快、住院时间短等优势，超声引导下经皮微波消融治疗肝癌具有成本低的优势8。PMCT治疗后，机体肿瘤负荷减轻，肿瘤对免疫系统的抑制大大解除，同时死亡和凋亡的肿瘤细

4、胞使肿瘤抗原得以释放和暴露，因而也是激发机体特异性抗肿瘤免疫的最佳时机。多种细胞因子诱导的杀伤细胞(cytokine induced killer,CIK 细胞)过继性免疫治疗能在一定程度上提高肿瘤患者的免疫功能，为预防肿瘤复发、消除患者体内残留的肿瘤细胞、改善晚期肿瘤患者的生存质量提供了新的治疗途径。因此本研究拟观察观察超声引导下微波消融联合自体CIK细胞治疗原发性肝癌的临床疗效及安全性。1 资料与方法1.1 临床资料62例HCC患者均为本院2011年2月-2013年2月期间住院治疗的患者，根据临床症状体征、实验室检查及影像学检查(CT或MRI等)均已确诊。排除标准包括：妊娠和哺乳期妇女，吸

5、毒，精神异常，未控制的感染，全身皮质激素治疗，自身免疫性疾病，缺血性心脏病或心力衰竭，近6个月内进行过化疗或放疗的患者。上述患者根据各自治疗意愿分为PMCT组(n=30例)和联合组(n=32例)，两组患者在性别、年龄、病程、肝功能Child分级、病灶数目、肿瘤最大径等方面比较无统计学差异(表1)。本研究已得到患者的知情同意及医院伦理委员会的批准。1.2 治疗方法1.2.1 微波消融仪器(yq)及步骤微波设备为中国(zhn u)南京康友微波能应用研究所研制的KY-2000(2450MHz)及KY-2100(915 MHz)微波(wib)消融仪，配用微波天线为15G，硬质裂隙水冷天线，最大输出功率

6、为100 W；随机配备组织测温系统，连接3根21G组织测温针(南京康友微波能应用研究所)。微波治疗方案：设计为1次消融治疗实现肿瘤完全灭活。治疗步骤：常规腹部超声检查后选定体位，超声引导择点定位，应用2%利多卡因进针点局部麻醉，给予动态心电、呼吸、血压监护。15G微波天线直入预定部位，根据肿块大小及患者情况选择不同功率、作用时间和进针次数，同时观察肿块回声变化。对5cm的肿瘤采取双针多部位分段凝固，按先深部后表浅，先周边后中央的顺序进行操作，选用功率5060W，作用时间1520min。PMCT组和联合治疗组患者均进行12次消融治疗，使用微波针数为14针，两组消融治疗次数和治疗针数差异无统计学意

7、义(P0.05)。1.2.2 自体CIK的制备及治疗方法 抽取患者外周血，经人淋巴细胞分离液密度梯度离心获得外周血单个核细胞(PMBC)，培养当天加入重组人IFN-、IL-2，培养第14d时，抽取培养液进行细菌真菌检测，回输当天进行内毒素检测和细胞表性分析。联合组患者共接受46次自体诱导的CIK 细胞治疗，每周一次，每次回输后如无不良反应则继续完成以后的治疗。每次回输的CIK细胞不少于11010，回输时由专人负责，如出现不可耐受的副反应则终止治疗。1.3 观察指标及评定标准治疗后3个月评价临床疗效：完全缓解(CR：所有靶病灶消失)；部分缓解(PR：靶病灶最长直径与基线状态比较，至少减少30%)

8、；无变化(SD：靶病灶缩小不到50%或增大不超过25%)；疾病进展(PD：靶病灶最长径之和与治疗开始之后所记录到的最小靶病灶之和比较，增加20%或者出现1个或多个病灶)。 治疗后KPS评分的变化，升高：化疗结束后较治疗前评分增加10分；稳定：化疗前评分增加或减少不足10分；降低：较化疗前评分减少10分。升高和稳定为有效。1.4 外周血淋巴细胞亚群分析患者治疗前后外周血淋巴细胞表型分析用流式细胞仪进行检测。血样以EDTA抗凝，各检测管中加入相应抗体(CD3-PerCP，CD4-FITC，CD8-FITC，CD 25 PE，CD 28 PE，CD56 PE，Mouse IgG1-FITC，Mous

9、e IgG1-PE，Mouse IgG2a-PE，Becton Dickinson Immunocytometry Systems，BDIS，USA)，混匀，室温暗处反应15 min；加入2 ml FACS Lysing Solution(BDIS，USA)，混匀，室温暗处放置10 min；3000 r/min，离心5 min，弃上清；洗涤，加入300 l 1%多聚甲醛；28暗处保存，24 h内用FACS-Calibur(Becton Dickinson，USA)检测分析。1.5 观察(gunch)指标1.5.1 检测治疗(zhlio)中和治疗后局部或全身毒副反应；1.5.2 检测(jin c

10、)治疗前后(1年内)外周血AFP浓度；1.5.3 观察患者无瘤生存率和1年，3年生存率。1.6 统计学分析方法采用SPSS 16.0软件包进行数据的统计处理。组间计量资料比较采用t检验，组内计量资料比较采用配对t检验；率和构成比的比较采用2检验，生存率分析用Kaplan-Meier法，生存时间比较采用Log-rank检验。检验水准=0.05。2 结果2.1 两组临床资料比较 两组患者在性别、年龄、病程、肝功能Child 分级、病灶数目、肿瘤最大径等方面比较无统计学差异(P0.05)，见表1。表1 两组临床资料比较组别例数性别(男/女)年龄(岁)病程(d)病灶数(个)病灶最大径(mm)肝功能Ch

11、ild分级ABCPMCT组3025/552.211.638.527.96.718102联合组3226/653.512.1 0.527.27.116113注：两组比较，P0.05。2.2 两组临床疗效及KPS评分比较 联合组治疗总有效率(87.5%)和KPS有效率(90.6%)明显高于PMCT组(70.0%)和(73.3%)(P0.05)；见表2及表3。表2 两组疗效比较组别例数CRPRSDPD治疗总有效率PMCT组304176370.0%联合组3282031 87.5%*注：与PMCT组比较，*P0.05。表3 两组KPS评分比较组别例数升高稳定降低总

12、有效率PMCT组30715873.3%联合组3215143 90.6%*注：与PMCT组比较，*P0.05)，两组治疗后CD3+、CD4+、CD4+/CD8+比值均明显升高(P0.05)，而CD8+及AFP明显下降(P0.05)，联合组升高或下降较PMCT组更为显著(P0.05)，见表4。表4 两组治疗前后T细胞亚群及AFP变化 组别例数CD3+(%)CD4+(%)CD8+(%)CD4+/CD8+ AFP(ug/mL)PMCT组 治疗前 治疗后303063.522.71 65.233.13*32.221.43 33.721.58*30.312.74 27.552.25*1.050.57 1.2

13、70.62*472.41140.23 147.2525.47*联合组 治疗前 治疗后323263.852.8770.424.21*#32.141.6534.921.44*#30.762.8425.432.07*#1.070.55 1.540.62*#481.07133.48 51.0427.12*#注：与治疗(zhlio)前比较，*P0.05；与PMCT组治疗(zhlio)后比较，#P0.05。2.4 两组患者(hunzh)复发率及生存率比较 联合组在0.5年、1年、2年的复发率及生存率均明显低于和高于对照组(P0.05)，见表5。表5 两组患者复发率及生存率比较(%)组别例数复发率生存率0.

14、5年1年2年0.5年1年2年PMCT组 308(26.7)15(50.0)20(66.7)23(76.7)17(56.7)13(43.3) 联合组 32 4(12.5)* 10(31.3)*13(40.6)*29(90.6)* 24(75.0)*20(62.5)*注：与PMCT组比较，*P0.05。2.5 两组治疗不良反应 PMCT组及联合组CIK细胞回输治疗均未出现或级严重不良反应，治疗后主要的不良反应为穿刺部位渗血、肝区隐痛、发热及轻微乏力，经对症处理，上述症状均消失。临床观察未发现有明显肝肾心肺、血液系统和神经系统毒性作用，亦无明显自身免疫疾病临床表现。3 讨论 目前，治疗肝癌的有效方法

15、有手术切除、局部消融和经肝动脉栓塞等，均能极大地减少肿瘤负荷，取得显著的阶段性临床疗效。然而，肿瘤常常在治疗后1年内出现复发。研究显示，恶性肿瘤的发生发展与机体的免疫功能失调密切相关，免疫系统无法识别和清除恶变和突变的细胞致使肿瘤细胞逃逸机体免疫系统的监视和清除，因此对于影像学上肉眼无法分辨的微小病灶，最终需要动员机体免疫系统识别和清除恶变肿瘤细胞才能彻底清除9,10。 PMCT治疗不仅直接使肿瘤细胞凝固坏死，原位彻底灭活肝癌组织，而且还能提高免疫细胞数量及其抗肿瘤功能，而手术切除肿瘤有可能直接或间接地抑制细胞免疫11。PMCT能提高机体免疫功能，其机制为12,13： PMCT减轻了患者的肿瘤

16、负荷及相应的免疫抑制因子； PMCT在肿瘤局部造成了炎性环境，有利于抗原提呈细胞提取、加工肿瘤抗原，诱发抗肿瘤免疫； PMCT降低了免疫抑制因子的水平，肿瘤细胞分泌的可溶性IL-2 受体能中和活化T 淋巴细胞分泌IL-2，使肝癌患者IL-2水平降低； PMCT可刺激淋巴细胞活化，释放细胞因子，通过细胞因子网络调节作用，增强机体的免疫力。Schueller 等14研究发现，热疗通过加强肝癌细胞HSP70和HSP90 的表达，能增加对肝细胞癌的免疫能力；AFP具有免疫抑制作用，PMCT后患者AFP明显下降，进一步解除了机体的免疫抑制。但近些年研究发现，虽然PMCT治疗可刺激局部免疫反应，但持续时间

17、较短，提示微波治疗后有必要进行免疫治疗，进一步巩固和扩大微波治疗后减灭瘤负荷的成果，达到降低和延缓肿瘤复发的目的15。 CIK是一群增值率高并具有抗肿瘤活性的异质(y zh)细胞，通过(tnggu)穿孔素/颗粒酶杀伤肿瘤(zhngli)细胞16。CIK抗肿瘤已经被批准临床试验，许多病人已经由此获得良好的治疗效果17-19。与传统的肝癌切除相比，免疫治疗具有副作用少、减少肿瘤免疫逃避及避免免疫耐受的优点。CIK细胞主要通过3种途径发挥抗癌作用20： CIK在体内通过LFA/ICMA-1 等粘附因子粘附并穿过内皮细胞，直接识别并定位到血管外的肿瘤组织，分泌含大量BLT 酯酶的颗粒进而裂解杀伤肿瘤细

18、胞； 分泌IL-2、IL-6、TNF-及GM-CSF等细胞因子，改造机体的内免疫环境，在DC 细胞的存在下激活体液免疫并起到协同作用，提高机体免疫功能，抑制肿瘤细胞生长； 诱导肿瘤细胞凋亡从而抑制肝癌发展 本研究结果显示，联合组治疗总有效率和KPS有效率明显高于PMCT组；两组治疗后CD3+、CD4+、CD4+/CD8+比值均明显升高，而CD8+及AFP明显下降，联合组升高或下降较PMCT组更为显著；联合组在0.5年、1年、2年的复发率及生存率均明显低于和高于对照组(P0.05)；治疗期间均未出现严重不良反应。由此可知，PMCT联合自体CIK细胞治疗HCC疗效明显优于单纯PMCT，可明显调节患

19、者免疫状态，降低复发率和提高生存率，安全可靠，值得临床推广应用。参考文献：Cazejust J. MR features after radiofrequency ablation (RFA)J. Clinics and research in hepatology and gastroenterology,2011,35(2):81-82.Napoletano C, Taurino F, Biffoni M, et al. RFA strongly modulates the immune system and anti-tumor immune responses in metastati

20、c liver patientsJ. International journal of oncology,2008,32(2):481-490.Meijerink MR, Van Waesberghe JH, van der Weide L, et al. Early det- ection of local RFA site recurrence using total liver volume perfusion CT initial experienceJ. Academic radiology,2009,16(10):1215-1222.Thanos L, Poulou LS, Zia

21、kas PD, et al. Image-guided radiofrequency ablation (RFA) of unresectable hepatic tumors using a triple-spiral-shaped electrode needle: initial experience in 34 patientsJ.Cardiovasular and interventional radiology,2010,33(1): 107-112.Peng ZW, Zhang YJ, Chen MS,et al. Radiofrequency ablation as first

22、-line treayment for small solitary hepatocellular carcinoma: long-term resultsJ. Eur J Surg Oncol,2010,36:1054-1060.Hasegawa K,Kokudo N,Shiina S,et al. Surgery versus radiofrequency ablation for small hepatocellular carcinoma: Start of a randomized controlled trial(SURF trial)J.Hepatol Res,2010,40:8

23、51-852. Martin RC,Scoggins CR,Mcmasters KM. Safety and efficacy of microwave ablation of hepatic tumors: a prospective review of a 5-year experienceJ. Ann Surg Oncol,2010,17:171-178.Dong B,Liang P, Yu X,et al.Percutaneous sonographically guided microwave coagulation therapy for hepatocellular carcin

24、oma: results in 234 patientsJ. Am J Roentgenol,2003,180:1547-1555.Thanos L, Poulou LS, Ziakas PD, et al. Image-guided radiofrequency ablation (RFA) of unresectable hepatic tumors using a triple-spiral-shaped electrode needle: initial experience in 34 patientsJ. Cardiovasular and interventional radio

25、logy,2010,33(1): 107-112. Hansler J, Frieser M, Tietz V, et al. Percutaneous ultrasound-guided radiofrequency ablation(RFA) using saline-perfused (wet) needle electrodes for the treatment of hepatocellular carcinoma-long term experienceJ. Ultraschall Med,2007,28(6): 604-611.Ben-Eliyahu S. The promot

26、ion of tumor metastasis by surgery and stress:immunological basis and implications for psychoneuroimmunology.Brain Behav Immune,2003,17(2):S27-36.Quintini C,Hirose K,Hashimoto K,et al.“Splenic artery steal syndrome” is a misnomer: the cause is portal hyperperfusion，not arterial siphonJ. Liver Transp

27、l,2008,14(3):374-379.Humar A,Beissel J,Crotteau S,et al. Delayed splenic artery occlusion for treatment of established small for-size syndrome after partial liver transplantationJ. Liver Transpl,2009,15(2):163-168.Schueller G,Stift A,Friedl J,et al. Hyperthermia improves cellular immune response to

28、human hepatocellular carcinoma subsequent to co-culture with tumor lysate pulsed dendritic cells.Int J Oncol,2003,22(6):1397-1402.Chen J,Huang X,Huang G,et al. Preconditioning chemotherapy with Cisplatin enhances the antitumor activity of cytokine induced killer cells in a murine melanoma modelJ.Cancer Biother Radiopharm,2012,27(3):210-220.Kuci S,Rettinger E,Voss B,et al. Efficient lysis of rhabdomyosarcoma cells by cytokine-induced killer cells: implications for adoptive immunotherapy after allogeneic stem cell transplantationJ. Haematologica,2010,95(9):1579-1586.J