骨组织工程研究现状与展望

1、骨组织工程研究现状与展望【关键词】 骨组织工程组织工程的基本含义是单用或将细胞、细胞因子和生物材料复合以后应用于体内的活组织再生和体外的组织构建。作为医学组织工程的重要组成部分，骨组织工程是针对骨不连骨缺损，特别是大块骨缺损(内径5 mm)的填充和愈合这一临床难题,研究有效的治疗途径。它的研究思路是在体内骨不连或骨缺损处植入载有高效成骨种子细胞的载体系统，提供骨诱导与骨传导的最佳环境，在局部直接成骨并完成骨愈合过程。上世纪6070年代人们对骨生长因子骨形态发生蛋白(bone morphogenetic proteins,BMPs)认识的深入,开辟了骨组织工程研究的新纪元。在骨组织工程研究早期，

2、人们主要把精力放在种子细胞的培育，寻找适合种子细胞生存的载体和设计载体的空间结构上面。近年来的研究证实，影响骨再生成功与否的决定因素之一是移植物的再血管化，组织工程骨的血管再生在其自身存活及与宿主床的愈合中发挥着重要的作用。就组织工程骨而言，快速血管化可以为成骨细胞功能活动提供充足的营养，决定成骨量的多少，同时只有血管化人工骨才能演变成自体骨，从而在体内发挥持久的生理功能。因此，提高组织工程骨的血供，构建微血管化的组织工程骨已成为目前研究的热点。1 成骨种子细胞的来源与选择种子细胞是骨组织工程研究中最基本的环节。从细胞分化的角度看，机体的成骨效应主要来源于两类细胞，即确定性的成骨祖细胞(DOP

3、C)和诱导性成骨祖细胞(IOPC)。DOPC是成骨细胞分化的高级阶段，有活性的DOPC成骨活力高而且稳定，是种子细胞培育的金标准。DOPC在体内主要存在于骨膜内和骨髓内，纯化的DOPC获得十分困难，在实际中难以办到。骨组织工程所应用的种子细胞主要来源于诱导性成骨祖细胞(IOPC)。它们主要来源于中胚层组织，如骨髓基质细胞、脂肪细胞、成纤维细胞等。骨髓是机体唯一同时含有DOPC和IOPC的组织，骨髓基质干细胞取材方便，对组织损伤小，成骨细胞活力高，体外状态下容易扩增，便于诱导，是目前骨组织工程研究最多而且最有应用价值的种子细胞来源。目前亦有采用异体骨髓基质细胞进行移植研究的报道。骨髓基质干细胞近

4、期有待于获得FDA认证后正式应用于临床。骨膜内有大量确定性的成骨祖细胞(DOPC)，在体外状态下容易扩增，成骨活力很高，也是很好的种子细胞来源，但是由于需要切开取材，目前仅停留在动物实验方面。有人提出大范围创伤病人在处理创伤的同时进行取材，体外培养，深低温保存，以备将来使用，是一个很好的思路。胚胎干细胞作为种子细胞极易被诱导体诱导向成骨细胞方向分化，成骨潜力极大。有人提出建立骨组织工程种子细胞库的设想，但是由于来源和免疫原性使之在应用方面受到限制。其它干细胞，包括脂肪干细胞、肌源性干细胞等，目前已经从不同的成熟组织中获得了其相应的干细胞，并在体外状态下诱导显示了这些细胞有很高的成骨活性，在临床

5、上潜在的应用价值，由于这些细胞取材、分离和分化的操作程序复杂，以及其免疫原性，而限制了它们的应用。其它成熟细胞虽然在病理状态和在科学实验中发现了它们的成骨分化，但是作为骨组织工程的种子细胞来源将不予考虑。2 种子细胞的成骨诱导与分化通过成骨因子或细胞因子诱导IOPC的成骨分化，仍然是目前获取高效种子细胞的主要手段。BMP2是最有效最方便的成骨诱导因子，此外，尚有BMP3、BMP7诱导分化的报道。目前，FDA已经通过了将重组人BMP应用于临床的决议。为了提高和维持种子细胞的成骨活力，生长因子网络的作用越来越受到重视，双因子，如BMP2与bFGF或三因子的共同刺激骨髓基质细胞已获得了很好的增值与成

6、骨分化。细胞因子仅在体外状态下实施诱导，可以获取高效的种子细胞，由于尚未发现较好的细胞因子缓释载体，如果将细胞因子直接植入体内，将很快被周围血流带走，或被周围细胞处理，难以发挥有效的成骨诱导作用，因而将其单独用在体内诱导的思路不可行。通过基因工程手段将高效成骨因子基因装入真核表达载体后转染成骨细胞，植入体内可以获得高效成骨细胞因子的稳定表达，可以维持其在成骨区浓度，使稳定成骨成为可能。目前常用的真核表达载体有质粒载体，如pcDNA3、逆转录病毒载体，如pDor、及腺病毒、慢病毒表达载体，比较有优势的是后两种载体。人们已将多种目的基因装入载体均获得了较好的表达，但是，这种方法表达细胞因子蛋白的三

7、、四级结构、表达量以及表达时间尚不能控制，影响成骨过程。此外上述载体存在一定的细胞毒性，而未获得医疗监管部门的批准，尚未进入到临床应用阶段。3 骨组织工程载体的选择与应用经典的载体设计理念仍然有指导意义。即骨组织工程载体应具有：(1)一定支持力和结构强度的材料作为核心骨架,降解缓慢,以提供有效的成骨空间和时间;(2)利用天然孔隙或不同工艺段造形成的孔隙,仍以100500 m直径为好,以提供良好的骨传导性;(3)通过载体的表面修饰增强对种子细胞的相容性和粘附性，以提供良好的成骨环境和首次贴壁率;(4)植入体内骨组织工程支架材料及其降解产物不会刘丹平:骨组织工程研究现状与展望辽宁医学院学报 200

8、9年10月，30(5)引起炎症及不良反应。目前，尚未发现一种材料同时具有上述的各种性能。从材料来源分类可将支架材料分为天然材料和合成材料两大类。天然材料中以牛松质骨载体为代表，牛松质骨经过去抗原处理(主要是脱脂、脱蛋白、去细胞)后，可形成孔隙均匀，相互贯通，强度较佳的载体。可以打磨成任意形状，由于属生物材料，组织相容性好。我国第四军医大学胡蕴玉教授课题组研制的以去抗原牛松质骨载体为核心骨架的重组合异种骨已应用临床。此外经过处理的异体骨和天然珊瑚(羟基磷灰石)材料在临床上亦已有应用。在人工合成的无机材料方面，羟基磷灰石虽强度和组织相容性较好，但无骨诱导活性，并且目前的工艺难以制作成均匀的孔隙和达

9、到相应的孔隙率。磷酸三钙的组织相容性很好,但强度较差，在体内易于松散并降解粉化，孔隙难以维持。近年来由于制作工艺的改进新近发展起来的纳米磁性磷灰石-硅灰石玻璃陶瓷(apatite-wollastonite-magnetic bioactive glass-ceramic，A-WM GC)载体展现了良好的应用前景。我们与四川大学联合协助研制了磷灰石-硅灰石玻璃陶瓷载体，改变传统的熔融制备法,而采用溶胶-凝胶法制备工艺制备的磷灰石-硅灰石玻璃陶瓷具有纳米晶结构并磁性化，可保证材料表面微环境的可调性。我们将载体的孔隙直径设为300500 m，孔隙率可达到60%，既增加载体内孔隙弯曲度和孔隙之间的再通

10、率，减少载体内大体积腔隙的形成，便于细胞在载体内的填充分布，又为细胞粘附提供更为广大的面积。它具有良好的生物相容性、骨传导诱导性和机械强度。在体外状态下，我们已经获得成骨种子细胞在该载体内的大量生存、繁殖，并有胶原蛋白的表达。A-WM GC载体的特点是：(1)可直接诱导MSC向成骨细胞分化;(2)静磁场可产生弱电流，促进“静止”状态的原始细胞分化;(3)成骨细胞可直接在其表面成骨，即细胞在其表面分泌类骨质可直接钙化，而不形成一层结缔组织膜;(4)其降解速度低于-TCP，避免了过快降解产生的“粉渣淤滞”现象，并且其降解过程中产生的钙磷富集层(Ca-P rich layer)可被成骨细胞直接利用成

11、骨。以聚乳酸(PLA)、聚乙酸(PGA)及其共聚物(PLGA)等为代表的高分子材料的主要结构形式有纤维支架、多孔泡沫以及管状结构等。这些材料具有良好的生物相容性、可降解性、可吸收性、材料的吸收率可以通过共聚单位的相关比例来控制等优点。有报道在骨组织工程研究中它们亦具有良好的成骨效应。但是其酸性降解产物和聚合物中可残留有机溶剂易引起无菌性炎症反应和周围组织的纤维化，机械强度不足。此外，材料表面缺乏细胞识别信号与细胞间缺乏生物性相互作用，令人不能满意。4 骨组织工程核心骨架材料的表面修饰上述的骨组织工程核心骨架材料均具有良好的组织相容性，但缺乏种子细胞的黏附性。这些材料表面“干枯而贫瘠”，在体外状

12、态下难以为种子细胞提供生存的“土壤”，故多数载体均需进行表面修饰。目前用于表面修饰的材料主要有胶原材料和壳聚糖及其衍生物。壳聚糖的分子结构与细胞外基质糖氨聚糖相似，在体内降解产物为N-乙酰氨基葡萄糖和氨基葡萄糖，对人体无毒，其他降解产物(如甲壳素或其寡聚糖)分子量相对低，在体内不积累，无免疫原性，因此有良好的生物相容性，可控的降解性，无毒副作用。有研究表明壳聚糖能促进前成骨细胞的分化增殖，并具有缓释和抑制炎症反应的作用。此外，还有多聚赖氨酸和人工合成的多肽可用于表面修饰，这些材料仅用于科学实验。5 改善骨缺损区血供状态充足的血液供应是维系骨缺损、骨不连局部骨再生的必要条件。在临床实际工作中，大

13、块状骨缺损多由于严重的车祸、重物砸伤或爆炸引起，损伤段的骨块可由于过于粉碎，严重污染而不能回植应用，甚至损伤段的骨块散落于骨折发生现场而无法找回。此类骨折临床治疗多采用二期植骨。此外还有一类骨缺损由感染造成，或由于慢性骨髓炎一般细菌感染骨块摘除遗留的骨缺损，或由于骨结核坏死骨块由窦道排出。骨缺损区血供馈乏主要有两个原因，其一骨缺损区两端骨质已硬化，骨髓腔封闭;其二骨缺损周围组织已经严重的纤维瘢痕化，血管再生能力较差。此外，目前的骨组织工程载体孔径多为100700 m，孔隙率一般在50%70%。大量的观察发现，无论在体内还是体外与成骨种子细胞组装，也无论这些载体做成骨粒状还是做成大块状(内径5

14、mm)填充骨缺损，在植入体内早期载体周围被结缔组织挤压和积血块包裹，局部仅依靠组织液渗入获得营养，特别是骨缺损中心部位或植入的大块状载体中心部位组织液流动就更为缓慢，氧分压更低，营养物质供应严重不足，致使此部位成骨活动缓慢以至停滞，甚至连种子细胞生长的基本营养需求都不能满足。解决上述问题的关键是尽快在骨缺损区或载体的中心部位构建有效的血管网来支撑成骨过程，这是骨组织工程研究的一个新热点。机体血管的形成有血管生成(已有的毛细血管生芽并爬行生长)和血管形成(干细胞分化成血管内皮细胞后再聚集形成毛细血管)两种方式。骨缺损区内植入的载体内的血管形成上述这两种方式均可发生，但以何种方式生成血管为主，以骨

15、缺损周围软组织和髓腔内血供条件为前提，软组织越新鲜、再通的髓腔血供越丰富，毛细血管生芽爬行就越快;目前骨组织工程学在骨缺损区内血管构筑研究方向的理想模式是促进新生毛细血管尽快再生，还要使之进一步增粗、加厚和固定，即微血管化，形成包括有微动脉毛细血管微静脉的微血管系统，而获得稳定的局部血供。目前认为血管内皮生长因子VEGF是最重要的刺激毛细血管再生的生长因子。但无论是将外源性的VEGF蛋白直接注入骨折区域，还是将含转染VEGF基因的真核表达载体的靶细胞植入骨折区，虽然均可以获得VEGF在骨折区局部作用，但仍存在VEGF的表达量或表达时间的控制的探索问题，此外，实验观察还表明既使骨折区局部有VEG

16、F的稳定存在，也多形成低流量和不稳定的毛细血管，而且这些毛细血管有时产生不同程度的退化，难以进化形成有意义的血管网。此外，VEGF的使用还涉及到几个严重的安全性问题，其中一个潜在的并发症是非缺血靶组织的非特异性新血管化或“附带”新血管化，不可控制的新血管化可能会导致处于静止状态的肿瘤细胞或组织的生长。将骨髓基质干细胞(MSC)体外诱导分化成为血管内皮细胞(EC)或直接体内取材体外培养获得的血管内皮细胞，将该两种细胞直接应用于骨折区促进血管再生，虽然这一思路在实验中显示许多积极意义，但是它目前仅停留在动物实验阶段，主要问题是体外诱导的MSC向EC方向分化的程度难于确定，将其植入动物体内后有去分化

17、现象;而体外培养自体来源的EC，不仅存在操作繁琐，体外培养较难的问题，而且在人类EC标本来源和取材就是一个难于越过的鸿沟。血管新生过程本身受一系列生长因子的调节，且这些生长因子相互协调、相互补充，而单个生长因子并不足以诱导成熟的血管新生。因此人们在探索用基因治疗骨缺损时，力求找到能促进多基因共同表达的因子，以诱导生理功能完整的新血管生成。低氧诱导因子1(hypoxia inducible factor-1, HIF-1)是在缺氧条件下广泛存在于哺乳动物和人体内的一种转录因子，对体内局部微环境中的氧浓度敏感，缺氧即可诱导其基因表达，缺氧时间延长，表达量亦增加;缺氧改善，HIF-1水平迅速下降。H

18、IF-1为促进VEGF等刺激血管形成生长因子基因的上游基因，启动和促进VEGF等基因及其受体基因的表达，产生内源性的VEGF和其受体，促进血管再生。优点是内源性的VEGF活性明显比外源性的强，而且表达量恒定;VEGF的受体表达更增加了靶细胞对VEGF的敏感性;启动糖酵解过程，在暂时缺氧环境下维持成骨细胞的生存代谢，一旦血管再生，迅速发挥成骨效应;HIF-1也能促进成骨系统内已分化的血管内皮细胞(EC)长时间存活，并能使多能造血祖细胞向EC方向定向分化、扩增，以供新生血管的发生，并可促使新生毛细血管形成微血管系统。此外，HIF-1还可调控促红细胞生成素、一氧化氮合酶等因子，在促进红细胞生成，调节能量代谢，细胞凋亡与增殖方面发挥重要作用。HIF-1的提高组织和细胞在