理论篇第五章植物组织培养001

1、理论篇第五章植物组织培养001植物组织培养的概念和意义植物组织培养的概念有广义和狭义之分，本章所涉及的植物组织培养是狭义的组织培养，是指对植物组织，包括分生组织、形成层、木质部、韧皮部、表皮、皮层组织、薄壁组织、髓部等及其培养产生的愈伤组织进行离体培养的技术。通过组织培养可以对不同类型组织的起源、形态发生、器官发生、植物再生等进行研究。2、植物分生组织培养植物分生组织的概念和意义分生组织培养的方法影响分生组织培养的因素植物分生组织培养的概念及意义植物分生组织培养（meristem culuture）：指对植物体的分生组织进行离体培养。分生组织包括茎尖分生组织（应用最多）、居间分生组织和侧生分生

2、组织。分生组织细胞具有持久的分裂能力和很强的生命力，离体培养时易发生细胞分化，再生完整植株，并且幼嫩的分生组织没有输导组织，病毒难以侵入，有利于获得无病毒植株。例：近年来应用类似Morel的方法成功将66属以上的兰属植物纳入了试管繁殖体系。分生组织培养的方法茎尖分生组织培养的方法（1）芽的表面消毒：健壮枝梢 去除叶片 分成1-2cm 自来水冲洗 消毒 95%的酒精30秒 0.1%升汞或0.5%次氯酸钠消毒8-10min 无菌水冲洗34次注：植物不同，消毒方法也有一定的差异。如块根或块茎类植物，可先用漂白粉的饱和溶液浸泡块根或块茎15分钟，然后使它们在无菌条件下萌发，再取芽使用。鳞茎类植物，先剥

3、去外部的鳞叶，用70%的酒精消毒鳞茎表面，然后在超净工作台上用消过毒的解剖工具取出位于鳞茎中心的休眠芽，直接接种到培养基上。茎尖分生组织培养的方法（2）茎尖的分离与接种：材料置解剖镜下，解剖刀切取小于1mm带有12个叶原基的茎尖，接种到培养基上.注：解剖时必须防止茎尖变干，因此茎尖暴露的时间越短越好解剖针要常常蘸入70%酒精，并用火焰灼烧以进行消毒，冷却后使用解剖镜台应垫载玻片或培养皿，并注意其与手的消毒茎尖分生组织培养的方法（3）腋芽的生长与增殖：在合适的培养基上培养，13个月后可以形成小的植株，有的会长出愈伤组织，再分化长出不定芽，经增殖培养扩大繁殖。注：茎尖培养主要是通过腋芽增殖扩大芽的

4、群体，达到快速繁殖的目的可用细胞分裂素打破顶端优势，促使腋芽萌动当培养基中含细胞分裂素时离体芽可形成丛生芽或丛生枝茎尖分生组织培养的方法（4）茎尖接种后的生长及调节：生长正常：生长点延长，基本无愈伤组织形成生长停止：接种物不增大，渐变褐色，至枯死，原因多为剥离过程中茎尖受伤生长缓慢：接种物增大缓慢，渐转绿，成一绿点，此时应立即转入高浓度生长素培养基，并适当提高培养温度生长过速：生长点不伸长或略伸长，并形成大量疏松愈伤组织，需转入无激素培养基或降低培养温度（5）诱根与移栽：与一般培养器官相同影响分生组织培养的因素培养基 通常以White、Morel和MS作为分生组织培养的基础培养基。使用时应注意

5、以下4点：提高培养基钾盐和铵盐的含量有利于茎尖生长培养基可含有的生长素和细胞分裂素，同时应避免使用2，4-D一般使用琼脂固化培养基培养基的pH值应控制在之间影响分生组织培养的因素外植体的大小 外植体的大小与其存活率、褐化率和玻璃化均有关。外植体大，感染率高，过小，存活率低；叶原基的存在与否也影响分生组织形成植株的能力。影响分生组织培养的因素培养条件 包括温度、湿度和光照。温度的设定主要由植物的种类、起源和生态类型决定，一般采用标准的培养室温度（ 25+2）培养室的湿度应保持较低的状态，以免室内生长霉菌植物光照培养的效果通常比暗培养效果好，光照强度为10002000LX，每天16h照明或24h连

6、续光照。外植体的生理状态 最好取活跃生长且处于萌动期的芽上的茎尖 3、植物愈伤组织培养 愈伤组织培养(callus culture)：是指将外植体接种到人工培养基上，在激素作用下，进行愈伤组织诱导、生长和分化的培养过程。愈伤组织培养的基本过程愈伤组织形成的条件愈伤组织的形成过程愈伤组织的生长愈伤组织的形态发生影响愈伤组织培养的因素愈伤组织形成的条件愈伤组织形成需要离体和外源激素两大条件。在生理和遗传的制约下，细胞的全能性不能表达而发育成完整植株，只有离开这种制约，才有可能表达出全能性。诱导愈伤组织常用的激素有2,4-D、NAA、IAA、KT和6-BA。愈伤组织的形成过程从外植体脱分化形成愈伤组

7、织大致可分为三个时期：愈伤组织分化诱导期分裂期分化期愈伤组织的形成过程启动期（诱导期）细胞准备进行分裂的时期，是愈伤组织形成的起点。此时期细胞特点：气体交换增加，如氧气的吸收增加RNA含量增加（增加到300%）蛋白质量增加（每个细胞的总增加量为200%）酶活性增强愈伤组织的形成过程分裂期 指外植体细胞经诱导脱分化，不断分裂、增生子细胞的过程分裂期细胞的主要表现:1.细胞的数目迅速增加；每个细胞平均鲜重下降。；细胞体积小，内无液泡。2细胞的核和核仁增大到最大。3.细胞中RNA含量减少，而DNA含量保持不变。4. 随着细胞不断分裂和生长，细胞总干重、蛋白质和核酸量大大增加，新细胞壁合成极快。愈伤组

8、织形成的过程愈伤组织形成的过程分化期指愈伤组织细胞停止分裂，细胞内发生一系列形态和生理上的变化,形成一些不同形态和功能的细胞的时期。分化期特点：多种酶活性加强，积累淀粉，RNA和组蛋白合成速度加快细胞形态大小保持相对稳定，体积不再减小，成为愈伤组织的成长中心愈伤组织的生长培养物需及时转移到新鲜的培养基上，则愈伤组织可无限制地进行细胞分裂，而维持其不分化的状态。继代培养一般要求34周更换一次新鲜培养基，以保持愈伤组织始终处于旺盛生长状态有些植物诱导启动细胞分裂和保持分裂要求不同的培养基成分和培养条件愈伤组织产生的量与再生植株的速率有关根据愈伤产生的速度和形成愈伤的类型，可判断愈伤的质量，即产生再

9、生植株的可能性愈伤组织的形态发生形态建成：外植体细胞在适宜的培养条件下发生脱分化、再分化，产生芽和根，或者形成胚状体，发育成苗或完整植株。愈伤组织形态发生有器官发生型和体细胞胚发生型两种类型。在许多木本植物的愈伤组织再生植株的培养过程中，常常是将诱导不定芽与诱导不定根分两步完成。愈伤组织的形态发生愈伤组织的器官发生顺序有四种情况：（1）愈伤组织仅有根或芽器官的分别形成，即无根的芽或无芽的根；（2）先长芽，后长根，多数情况；（3）先长根，再从根的基部长芽。这种情况较难诱导芽的形成，尤其对于单子叶植物；（4）先在愈伤组织的邻近不同部位分别形成芽和根，然后两者结合起来形成一株植株。愈伤组织的形态发生

10、愈伤组织的体细胞胚发生顺序有两种方式：1.从培养中的器官、组织、细胞和原生质体直接分化成胚，中间不经过愈伤组织；2.外植体先愈伤化，然后由愈伤组织细胞分化形成胚。（最常见）影响愈伤组织培养的因素1.外植体2.培养基3.植物生长调节剂4.培养环境影响愈伤组织培养的因素外植体不同植物种类被诱导难易程度不大相同外植体细胞分化程度越高，脱分化越困难同一种植物不同部位诱导难度不同年龄器官和部位遗传型外植体影响愈伤组织培养的因素培养基培养基无机盐浓度（常用MS）形态（液态）糖类的浓度（质地和结构）影响愈伤组织培养的因素植物生长调节剂对愈伤组织发生的影响常用的生长素：2,4-D、IAA、NAA（0.0110mg/L）常用的细胞分裂素：KT、ZT、6-BA（0.110mg/L） 对愈伤组织形态发生的影响影响试管苗茎芽分化的植物生长调节剂：6-BA、KT影响试管苗不定根发生的植物生长调节剂：IBA、NAA、IAA、2，4-D影响愈伤组织培养的因素培养环境条件光对器官的作用是一种诱导作用，分为光强、光照时间和光质。温度对愈伤组织的诱导和生长有很大的影响，一般植物采用2225 的恒温条件都可以较好地形成芽和根。3、其他组织培养植物薄层组织培养 指对植物的薄壁细胞层组织进行离体培养的